朱菲瑩，肖姬玲，張 屹，李基光，梁志懷

（湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖南 長沙 410125）

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究方法綜述

朱菲瑩，肖姬玲，張 屹，李基光，梁志懷

（湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖南 長沙 410125）

綜述了土壤微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和Biolog微平板分析碳素利用法、磷脂脂肪酸法（PLFA分析法）等微生物群落生理代謝研究方法，以及變性梯度凝膠電泳（DGGE）、末端限制性長度多態(tài)性（T-RFLP）、高通量測序技術(shù)及宏基因組等微生物分子生物學(xué)技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用，并對未來的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

土壤；微生物群落；研究方法；綜述

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，在土壤物質(zhì)循環(huán)、生態(tài)平衡和植物養(yǎng)分轉(zhuǎn)換中起著舉足輕重的作用。微生物是土壤中最活躍的組成，它們種類繁多、數(shù)量巨大，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中擁有獨(dú)特的功能，在地球物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)換以及環(huán)境與健康等方面發(fā)揮著重要作用[1]。據(jù)估計(jì)，1 g土壤中生存著多達(dá)上十億個(gè)微生物個(gè)體（細(xì)胞），是人類取自不盡的生物資源庫、基因資源庫、代謝產(chǎn)物庫。土壤微生物在維持生態(tài)系統(tǒng)的整體功能方面發(fā)揮著非常重要的作用，通常被比作土壤C、N、S、P等養(yǎng)分元素的循環(huán)“轉(zhuǎn)化器”、環(huán)境污染物的“凈化器”、陸地生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的“調(diào)節(jié)器”。同時(shí)，土壤是微生物的“天然棲息地”，為微生物的生長和繁殖提供物理結(jié)構(gòu)與化學(xué)營養(yǎng)[2]。自1676年，虎克用自制的顯微鏡觀察到了細(xì)菌個(gè)體，從此開創(chuàng)了人類研究土壤微生物新時(shí)代。1953年，沃森和克里克發(fā)表DNA雙螺旋模型，促使整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)入分子生物學(xué)研究階段，標(biāo)志著微生物學(xué)發(fā)展史進(jìn)入成熟階段。土壤微生物與植物的互作已作為一種涉及許多生態(tài)現(xiàn)象的機(jī)制正受到越來越多的關(guān)注[3-6]。土壤微生物群落多樣性已經(jīng)成為環(huán)境科學(xué)和土壤微生物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)研究的內(nèi)容之一。綜述了土壤微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、微生物群落生理代謝研究方法，以及微生物分子生物學(xué)技術(shù)在土壤微生物多樣性的研究進(jìn)展，并對未來的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 微生物的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

土壤微生物的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是指微生物稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法。該方法通過將土壤中可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后依據(jù)微生物菌落的形態(tài)特征和菌落的數(shù)量來判定微生物的類型及數(shù)量。由于所用的培養(yǎng)基對于培養(yǎng)土壤中可培養(yǎng)微生物具有一定的針對性，能夠獲得純培養(yǎng)的土壤微生物的菌株種類的數(shù)量僅僅只占微生物總數(shù)的0.1%～1%，因此，用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得的多樣性結(jié)果來代表自然環(huán)境中土壤微生物的多樣性具有片面性[5-6]。

2 微生物群落生理代謝研究方法

2.1 Biolog微平板分析碳素利用法

1991年，Garlan和Mills首次提出Biolog技術(shù)，并在土壤微生物的研究中得到廣泛的應(yīng)用。Biolog法是以微生物存活、生長及競爭過程中所需的不同形式的碳源為線索，根據(jù)微生物對碳源利用模式的差異，比較鑒定微生物群落功能的多樣性[7]，并以微生物在不同碳源中新陳代謝產(chǎn)生的酶與四唑類物質(zhì)（TTC、TV等）發(fā)生顏色反應(yīng)的濁度差異為基礎(chǔ)，運(yùn)用獨(dú)特的顯型排列技術(shù)檢測出各種微生物的代謝特征指紋圖譜。Biolog法可以根據(jù)檢測目的的不同選擇不同的微平板，如MT板、GP（革蘭氏陽性板）、GN（革蘭氏陰性板）、ECO（生態(tài)板）和FF（絲狀真菌板）等。平板上設(shè)有96個(gè)微井，其中1個(gè)不含碳源的微井作對照，通過測定變色速率推測微生物的呼吸速率，從而評價(jià)微生物種類和利用程度[5-6]。譚兆贊等[8]采用Biolog法分析土壤微生物中的特征碳源，表明特征碳源對土壤微生物群落特征的變化更敏感。張志紅等[9]采用了Biolog Eco微平板的方法研究了盆栽試驗(yàn)中堆肥、生物有機(jī)肥和生物復(fù)混肥3種肥料對土壤微生物功能多樣性影響及其與防病的關(guān)系。2015年，張超等[10]運(yùn)用Biolog法研究了在溫室大棚條件下采用密封熏蒸法不同劑量（300、450、600和750 kg/hm2）棉隆對辣椒疫霉的防效及對土壤微生物群落的影響。2016年，Shang Q等[11]利用Biolog技術(shù)輔助分析蘭州百合發(fā)病植株與健康植株的根際土壤微生物功能多樣性。

Biolog碳素利用法具有自動化程度高、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，是目前用于揭示土壤微生物群落功能多樣性的一種相對簡單快捷的研究方法。但僅限于檢測可培養(yǎng)、能迅速生長的微生物，且微孔中的碳源并不能完全代表土壤生態(tài)系統(tǒng)中實(shí)際碳源的所有類型，此外，樣本的處理方法、培養(yǎng)條件以及使用的微平板類型等都會給微生物多樣性的評價(jià)帶來誤差[6]。

2.2 磷脂脂肪酸法（PLFA）

磷脂脂肪酸（PLFA）作為細(xì)菌和其他微生物細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記廣泛應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)。微生物磷脂脂肪酸法的提取和測定是該分析法的關(guān)鍵因子。磷脂脂肪酸法經(jīng)過不斷的發(fā)展完善，目前普遍采用的是準(zhǔn)確、方便快捷的GC-MS方法，它在描述整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化中具有快捷、可靠的優(yōu)點(diǎn)[6]。磷脂是細(xì)胞膜中主要的脂質(zhì)。磷脂可皂化并釋放出包含在其尾部的脂肪酸甘油二酯。一旦未知樣品的磷脂皂化，由此產(chǎn)生的磷脂脂肪酸成分可與已知生物對比，從而確定樣品的身份。PLFA分析也可以與其他技術(shù)相結(jié)合，如應(yīng)用穩(wěn)定同位素探測技術(shù)確定樣品中哪些微生物代謝活躍。PLFA分析技術(shù)早在20世紀(jì)80年代中期，由在華盛頓田納西大學(xué)的D.C. White博士首創(chuàng)[12-13]。PLFA分析可廣泛用于估算總生物量，也用于觀察土壤和水中微生物群落組成及變化。2002年，Keith-Roach M J等[14]的研究發(fā)現(xiàn)暖季增加了鹽堿地微生物的PLFA豐度，且發(fā)現(xiàn)一年中好氧細(xì)菌是優(yōu)勢菌。2004年，Tomoyoshi M等[15]研究了大米土壤中細(xì)菌群落多樣性和PLFA的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌多樣性和PLFA量呈比例關(guān)系。

3 微生物群落的分子生物學(xué)研究方法

3.1 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

1983年，F(xiàn)ishers等[16]基于聚丙稀酰胺凝膠電泳，發(fā)明了分離出相同長度但序列有區(qū)別的DNA片段的的方法即變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gelelectrophoresis，DGGE）。1993 年，Muyzer G[17]等初次使用DGGE方法分析微生物群落結(jié)構(gòu)，隨后被廣泛用于自然環(huán)境中細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、古菌、真菌、真核生物和病毒等群落生物多樣性的分析。1997年，Holger H等[18]運(yùn)用群特異性的PCR和DGGE法對不同泥土的優(yōu)勢放線菌進(jìn)行了研究。2000年，Haller C M等[19]用DGGE法分析研究了地中海西部的3種過濾海水中不同組分的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，并比較了它們的細(xì)菌群落分布情況。2012年，Zhou X等[20]利用PCR-DGGE分析了溫室條件下黃瓜連作土壤微生物的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)真菌種群大小與尖孢鐮刀菌的多樣性變化使土壤病態(tài)，從而影響了黃瓜的生長。2016年，葛曉穎等[21]以山東壽光及禹城地區(qū)不同連作年限的54個(gè)設(shè)施番茄土壤為研究對象，研究芽孢桿菌和假單胞菌及土壤微生物群落隨連作年限的變化及其與土壤養(yǎng)分的關(guān)系，進(jìn)而分析土壤中芽孢桿菌和假單胞菌與連作障礙之間的關(guān)系，通過對設(shè)施連作番茄土壤分析可知，連作番茄土壤中土壤細(xì)菌數(shù)量隨連作年限呈減少趨勢。

3.2 末端限制性長度多態(tài)性（T-RFLP）

末端限制性片段長度多態(tài)性是一種微生物群落分析的分子生物學(xué)技術(shù)。1980年，遺傳學(xué)家Bostein提出限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)，并被稱為第一代DNA分子標(biāo)記技術(shù)。RFLP是根據(jù)不同品種基因組限制性酶切位點(diǎn)的堿基突變，如堿基的插入、缺失等，引起酶切片段長度發(fā)生變化，然后通過探針的雜交來檢測這類變化，從而對比不同品種的DNA水平的不同，通過多個(gè)探針的對比來確定物種的進(jìn)化和分類[22]。1997年，Liu WT等[23]最先采用T-RFLP技術(shù)分析微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性。2012年，林茂茲等[24]運(yùn)用微生物純培養(yǎng)法和T-RFLP技術(shù)分析了連作太子參根際土壤微生物多樣性的影響。2015年，秦越等[25]為探明馬鈴薯連作障礙的機(jī)制，分別采集馬鈴薯正茬以及連作1、6和l0 a的根際土壤樣本，利用T-RFLP技術(shù)研究連作栽培對馬鈴薯根際土壤主要茵群動態(tài)變化規(guī)律及連作障礙的可能原因。2015年，張振興等[26]通過水稻盆栽試驗(yàn)，以細(xì)菌16S rRNA基因?yàn)闄z測對象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和T-RFLP分子生物技術(shù)探究了水稻根際與非根際土壤中細(xì)菌豐度和群落結(jié)構(gòu)的差異。

3.3 高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）主要以454公司的454 GS FLX+和454 GS Junior、Illumina公司的HiSeq和MiSeq、美國ABI公司5500xl Solid為代表，測序流程包括：文庫的制備、基因組DNA隨機(jī)片段化和末端標(biāo)記測序及數(shù)據(jù)分析。第一代高通量測序技術(shù)采用雙脫氧核苷酸終止法，也被稱為Sanger測序法。但是Sanger測序法存在著很多不足之處，如測序通量低、測序成本高、無法對混合物中的微生物進(jìn)行準(zhǔn)確檢測等，因此無法進(jìn)行大規(guī)模測序和大量的平行測序，也不能滿足基因組學(xué)方面的研究。第二代高通量測序有：（1）Roche454。454公司于2005年開發(fā)的高通量測序體系Genome Sequencer 20 System。次年，推出新的測序系統(tǒng)Genome Sequencer FLX System。2008年，新測序試劑GSFLXTitanium的推出，促進(jìn)了測序的讀長、通量和準(zhǔn)確性的進(jìn)步。（2）Illumina的Hiseq和Miseq。2006年，Illumina公司的第二代高通量測序方法成為測序的主流技術(shù)，開發(fā)出了 GenomeAnalyzerllx、HiSeq2000、HiSeq2500/1500、MiSeq等測序體系。Illumina MiSeq平臺可針對16S rDNA的1個(gè)或多個(gè)高變區(qū)域來進(jìn)行測序，具有較高的測序深度，同時(shí)也可以檢測到低豐度微生物群落，分析準(zhǔn)確性得到大幅提高。Illumina測序方法主要原理是DNA簇和可逆性末端終結(jié)。HiSeq2000的讀長為100 nt，每次運(yùn)行至多產(chǎn)生200 GB的數(shù)據(jù)，大大降低了基因組測序的成本，是最常用的高通量測序方法。Illumina HiSeq2500高通量測序儀則是是目前最先進(jìn)的。（3）Life的Ion Torrent PGM。Rothberg于2007年著手研究Ion Torrent測序儀，Ion Torrent測序是以半導(dǎo)體芯片為基礎(chǔ)，將核苷酸加入到伸長的DNA鏈時(shí)釋放氧離子來檢測，測序讀長可達(dá)400 bp[27-30]。

3.4 宏基因組學(xué)

宏基因組學(xué)（Metagenomics）是將不同環(huán)境樣品的微生物總基因組作為研究對象，用于功能基因的挑選、測序分析，研究微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性、演化關(guān)系以及與環(huán)境之間的相互關(guān)系。宏基因組是基因組學(xué)中一個(gè)以微生物群落為研究對象的新興科學(xué)研究方向。其研究優(yōu)勢是：（1）微生物通常以群落方式共存于某生境中，通過整個(gè)群落環(huán)境及個(gè)體間相互影響從而發(fā)現(xiàn)其特性；（2）宏基因組學(xué)能夠更好的研究那些不能被分離培養(yǎng)的微生物。近些年，隨著DNA測序技術(shù)的進(jìn)步以及生物信息學(xué)分析方法的不斷改進(jìn)，使人們進(jìn)一步加快了對基因組學(xué)領(lǐng)域的認(rèn)識與發(fā)展。宏基因組學(xué)突破了傳統(tǒng)分離純化培養(yǎng)技術(shù)中絕大多數(shù)無法培養(yǎng)微生物分析的局限，使通過基因水平來研究整個(gè)環(huán)境中的微生物群落及群落變化規(guī)律成為可能[3-6,16,43]。1991年，Schmidt T M等[31]構(gòu)建北太平洋中部海洋超微型浮游生物群落16S rRNA基因文庫，發(fā)現(xiàn)了15個(gè)獨(dú)特的真細(xì)菌序列。2004年Treusch AH等[32]構(gòu)建了沙地系統(tǒng)和森林土壤16S rDNA基因文庫，對古細(xì)菌進(jìn)行了多樣性的分析。2009年，Djikeng A等[33]通過分析湖泊水體RNA病毒宏基因組學(xué)，研究了腸道內(nèi)影響人健康的微生物。2011年，Mendes R等[34]基于宏基因組學(xué)技術(shù)和可培養(yǎng)功能分析研究了抑病土壤的根際微生物群落。2012年，Rosario K等[35]利用宏基因組學(xué)研究了與動植物疾病相關(guān)單鏈DNA病毒群落。2013年，Ercolini D等[36]運(yùn)用高通量測序和宏基因組學(xué)研究食物的微生物生態(tài)學(xué)。2014年，Smedile F等[37]利用宏基因組學(xué)研究了地中海深海高鹽缺氧盆地的微生物系。2014年，F(xiàn)ang H等[38]通過宏基因組調(diào)查了在長期施肥土壤中抗生素抗性基因與人類致病細(xì)菌病原體發(fā)病率的關(guān)系。2015年，Baker B J等[39]利用宏基因組的方法分析了河口沉積物中細(xì)菌與土壤中C、N、S循環(huán)的關(guān)系。2015年， Shen Z Z等[40]利用基于Illumina的16S和ITS測序技術(shù)分析了連作兩年不同肥料處理的土壤微生物群落組成與香蕉枯萎病額相關(guān)性。2016年，南京農(nóng)大Hu J X等[41]基于Illumina的16S rRNA測序方法研究表明人參果的種植增加喀斯特地區(qū)細(xì)菌群落的多樣性和豐度。

4 展 望

高通量測序技術(shù)的發(fā)展有效的促進(jìn)了組學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的廣泛應(yīng)用，而宏基因組學(xué)是目前最為關(guān)鍵和成熟的組學(xué)方法。生物信息學(xué)在微生物宏基因組學(xué)研究中具有至關(guān)重要的作用。它貫穿于宏基因組學(xué)的數(shù)據(jù)收集和存儲、數(shù)據(jù)處理和分析等各個(gè)階段，既是宏基因組學(xué)推廣的最大瓶頸，也是目前宏基因組學(xué)研究發(fā)展的關(guān)鍵所在。隨著近年來測序成本的下降和測序深度的增加，將進(jìn)一步增大宏基因組學(xué)研究在數(shù)據(jù)存儲、數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)挖掘?qū)用娴碾y度，因此，相應(yīng)生物信息學(xué)技術(shù)與方法的研究和發(fā)展也勢在必行[42-43]。

作為環(huán)境微生物研究的重要組成部分，微生物宏基因組學(xué)中的生物信息分析在我國的開展和研究仍需要大力加強(qiáng)。而這部分所涉及的領(lǐng)域十分廣泛，不僅僅包括環(huán)境微生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)和生態(tài)學(xué)，同時(shí)需要用到生物信息學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、超級計(jì)算機(jī)技術(shù)和比較基因組學(xué)。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的日趨成熟和實(shí)驗(yàn)技術(shù)成本的下降，微生物群落宏基因組學(xué)將會更加廣泛的應(yīng)用。宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的并行，可以在不同的層面研究微生物的群落結(jié)構(gòu)，這些技術(shù)的發(fā)展在微生物研究中具有廣闊的應(yīng)用前景，包括整體微生物多樣性及其動態(tài)規(guī)律的揭示，以及在特殊生境下對新的可能發(fā)揮重要功能的未知微生物的探索等。

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Summary of Methods on Soil Microbial Community Structure

ZHU Fei-ying，XIAO Ji-ling，ZHANG Yi，LI Ji-guang，LIANG Zhi-huai
（Hunan Agricultural Biotechnology Research Institute, Changsha 410125, PRC）

The author reviews the traditional soil microbial culture method and the progress of microbial molecular biology techniques to study soil microbial diversity, including the method of Biolog, phospholipid fatty acid analysis method (PLFA), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), and terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) etc. Besides, within the development of highthroughput sequencing technology and metagenomic, not only their widely usages but also the future trends in the study of diversity soil microorganism has been prospected in this paper.

soil; microbial community; research methods; summary

S154

A

1006-060X（2017）10-0112-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.010.031

2017-08-21

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201503110-03）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0200600）。

朱菲瑩（1985-），女，土家族，湖南吉首市人，助理研究員，研究方向：植物與微生物互作。

梁志懷

（責(zé)任編輯：夏亞男）