程成，汪俊卿，王騰飛，楊曉慧，王瑞明

齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353

熱帶假絲酵母ctpxa1基因缺失菌的構(gòu)建及對長鏈二元酸積累的影響

程成，汪俊卿，王騰飛，楊曉慧，王瑞明

齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353

程成, 汪俊卿, 王騰飛, 等. 熱帶假絲酵母ctpxa1基因缺失菌的構(gòu)建及對長鏈二元酸積累的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(2): 237–246.

Cheng C, Wang JQ, Wang TF, et al. Effect ofctpxa1gene deletion inCandida tropicalison long chain dicarboxylic acid accumulation. Chin J Biotech, 2017, 33(2): 237–246.

Pxa1p為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae過氧化物酶體上的膜蛋白，與Pxa2p組成二聚體，參與轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸進(jìn)入過氧化物酶體過程。熱帶假絲酵母能夠發(fā)酵烷烴和脂肪酸生產(chǎn)長鏈二元酸，而過氧化物酶體中發(fā)生的β-氧化會消耗產(chǎn)生的長鏈二元酸造成產(chǎn)率降低。本研究以熱帶假絲酵母Candida tropicalis1798為宿主菌，通過基于PCR片段的同源單交換法，快速構(gòu)建ctpxa1基因敲除菌株C. tropicalis1798-pxa1。利用半定量RT-PCR技術(shù)，檢測ctpxa1基因在C. tropicalis1798、C. tropicalis1798-pxa1的表達(dá)量，灰度值比值為2.03，表明ctpxa1在C. tropicalis1798-pxa1中的表達(dá)被弱化。經(jīng)144 h發(fā)酵，C. tropicalis1798-pxa1比C. tropicalis1798的十二碳二元酸產(chǎn)量明顯提升，其產(chǎn)出濃度為10.3 g/L，比野生型菌株C. tropicalis1798提高了94.3%。

熱帶假絲酵母，長鏈二元酸，ctpxa1p基因，過氧化物酶體

長鏈二元酸是一類重要的化工原料，可用于合成人工麝香類香料、尼龍、工程塑料、熱熔膠、樹脂、高級潤滑油、耐寒增塑劑及液晶等物質(zhì)。熱帶假絲酵母是重要的工業(yè)菌種，能夠利用烷烴和脂肪酸作為唯一碳源和能源合成長鏈二元酸[1-3]，當(dāng)以烷烴或脂肪酸為碳源時，在細(xì)胞內(nèi)可形成大量的過氧化物酶體，同時誘導(dǎo)生成脂肪酸β-氧化酶系[4-5]，二元酸可以進(jìn)入過氧化物酶體經(jīng)β-氧化降解為細(xì)胞生命活動提供能量，但該過程通常會導(dǎo)致二元酸的過量消耗，因此對于提高烷烴的轉(zhuǎn)化率和二元酸的產(chǎn)量是極為不利的[6-8]。許家齊等研究結(jié)果表明，在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae過氧化物酶體上存在一條能夠特異性轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)體系，其中Pxa1p為過氧化物酶體的膜蛋白，與Pxa2p組成二聚體，參與轉(zhuǎn)運(yùn)長鏈脂肪酸進(jìn)入過氧化物酶體中，是長鏈脂肪酸β-氧化重要環(huán)節(jié)之一[9-11]，而Dulermo等則發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica中存在類似于S. cerevisiae的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)YlPxa1p-YlPxa2p，但該系統(tǒng)功能與S. cerevisiae的Pxa1p-Pxa2p轉(zhuǎn)運(yùn)體系具有較大的差異性[12-15]，而關(guān)于其他酵母菌種特別是假絲酵母菌株的相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體系尚未見報(bào)道。

本研究通過BLAST方法在NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)C. tropicalisMYA-3404中存在一種與S. cerevisiae中Pxa1p蛋白氨基酸序列一致性為41%的蛋白CTRT_01043 (NCBI No. EER36303.1)，并命名為CtPxa1p。為進(jìn)一步驗(yàn)證CtPxa1p蛋白的功能，通過重疊PCR構(gòu)建ctpxa1p基因敲除的片段pxa1p1-kanr，酶切后經(jīng)電轉(zhuǎn)化至C. tropicalis1798中，利用同源單交換的原理[16]，快速構(gòu)建ctpxa1p基因單敲除菌株C. tropicalis1798-pxa1。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒、引物

熱帶假絲酵母購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心 (CICC)，編號為1798；pPIC 9K為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

表1 引物列表Table 1 Primers used in this study

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司。PfuDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA marker及相關(guān)分子生物學(xué)試劑盒均為生工生物工程 (上海)股份有限公司產(chǎn)品。酵母浸粉和蛋白胨為北京奧博星生產(chǎn)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉 10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖62 g/L，酵母浸粉2 g/L，(NH4)2SO41 g/L，VB10.2 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO48 g/L，Na2HPO4·12H2O 10.08 g/L，尿素3 g/L，Mg2SO4·7H2O 6.15 g/L。

1.2 方法

1.2.1 同源臂pxa1p1和抗性基因kanr獲取

用S. cerevisiae中Pxa1p的氨基酸序列(GenBank Accession No. AJW19428.1) 進(jìn)行Blast搜索，獲得熱帶假絲酵母中同源序列，并以此設(shè)計(jì)引物pxa1p F1和pxa1p R1。使用上海生工酵母基因組DNA抽提試劑盒提取

C. tropicalis1798菌體的DNA，并以此為模板，使用引物pxa1p F1和pxa1p R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增獲得長度為553 bp用于pxa1p基因敲除的同源臂pxa1p1；使用高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取質(zhì)粒pPIC 9K，以質(zhì)粒pPIC 9K為模板，使用引物kan F1和kan R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸3.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增獲得長度為1 561 bp G418抗性基因片段kanr；使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒 (上海生工生物工程股份有限公司) 膠回收制得的pxa1p1片段與kanr片段，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 敲除片段的構(gòu)建

以膠回收制得的pxa1p1片段與kanr片段為模板，pxa1p F1和kan R1為引物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：1) 95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸3.5 min，5個循環(huán)；72 ℃延伸2 min；2) 95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸4.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增得到長度為2 148 bp的同源重組片段pxa1p1-kanr，過程如圖1所示，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 C. tropicalis1798-pxa1工程菌的構(gòu)建流程Fig. 1 Flowchart of construction ofC. tropicalis1798-pxa1.

1.2.3 同源重組片段pxa1p1-kanr酶切及濃縮

同源重組片段pxa1p1-kanr經(jīng)EcoR I酶切后，加入酶切產(chǎn)物1/10體積的3 mol/L NaAc和2.5倍體積的無水乙醇，-20 ℃冷藏20 min，12 000 r/min離心5 min，倒掉上清液；加入300 μL 70%乙醇重懸清洗一次；12 000 r/min離心5 min，倒掉上清液；37 ℃風(fēng)干30 min，除去乙醇，加16 μL去離子水重懸DNA。使用核酸超微量分光光度計(jì)(BioFuture MD2000) 測定回收DNA濃度，并最終獲得濃度在500–1 000 ng/μL之間的DNA溶液。

1.2.4 熱帶假絲酵母感受態(tài)制備及電擊轉(zhuǎn)化

挑取新鮮固體YPD培養(yǎng)基表面的C. tropicalis1798單菌落，接種20 mL液體YPD培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)16–18 h，接種過夜培養(yǎng)菌體5–50 mL新鮮液體YPD培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)10 h，使菌體濃度達(dá)到1×108個/mL，3 000 r/min離心10 min收集菌體，倒掉上清，菌體用20 mL無菌水懸浮，洗滌2次；離心收集菌體，用1 mL 1 mol/L山梨醇重新懸浮菌體，洗滌1次，轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中；離心收集菌體，移液器吸凈上清，加入0.2 mL 1 mol/L山梨醇混勻菌體，使菌體呈濃漿狀，取0.2–0.4 mL的菌懸液分裝在1.5 mL的離心管，每管中加入10 μL (1 μg) DNA，混勻，冰浴10 min；將轉(zhuǎn)化菌懸液全部轉(zhuǎn)入已預(yù)冷的轉(zhuǎn)化池中，1 500 V、5 ms下使用Eppendorf Mulultiporator電轉(zhuǎn)化儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化；用等體積的1 mol/L山梨醇將轉(zhuǎn)化菌懸液從轉(zhuǎn)化池中洗出，取200 μL涂布于添加了一定濃度G418的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2–3 d，篩選抗G418的菌株。

1.2.5 陽性重組菌株的鑒定

挑取上述單菌落于50 mL液體YPD培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)12–14 h，使用Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒 (上海生工生物工程股份有限公司) 提取基因組，以提取的基因組為模板，pxa1p F1、kan R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，最終獲得陽性重組菌株。

1.2.6C. tropicalis1798-pxa1菌株ctpxa1基因表達(dá)量

利用UNIQ 柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取總RNA，并按照TUREscript 1st Strand cDNA Synthcsis Kit的要求將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為ctpxa1基因PCR擴(kuò)增的模板，以pxa1p F2、pxa1p R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，并通過Quantity One軟件對灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算C. tropicalis1798與C. tropicalis1798-pxa1菌株中ctpxa1基因的灰度值比值。

1.2.7 種子培養(yǎng)

取100 μL甘油管保藏的熱帶假絲酵母接種于50 mL液體YPD培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，然后在裝有固體YPD培養(yǎng)基的平板上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12–16 h，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接于裝液量為50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，30 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)12 h[17-19]。

1.2.8 發(fā)酵培養(yǎng)

取種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于裝液量為50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板瓶中，接種量為10%，30 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)，每2 h取樣，發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)，蒸餾水為對照，測定OD600，待生長穩(wěn)定后調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為7.5，加入5%十二烷烴，進(jìn)入產(chǎn)酸期，在產(chǎn)酸期，每12 h調(diào)節(jié)pH到7.5。

1.2.9 十二碳二元酸的提取與測定

將發(fā)酵液離心，回收上層未利用的十二烷，用濾紙過濾上清液。取3 mL過濾液置于碘量瓶中，加適量玻璃珠，在沸水浴中加熱，用3 mol/L鹽酸調(diào)pH至3.0，加入100 mL乙醚，搖瓶至十二碳二元酸完全溶解于乙醚中，靜置30 min后取50 mL乙醚提取液于100 mL燒杯內(nèi)，在通風(fēng)櫥中吹去乙醚，得白色固體十二碳二元酸。將提取到的二元酸加入25 mL 95%中性乙醇溶解，加入2滴酚酞，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，記錄消耗的氫氧化鈉體積，計(jì)算十二碳二元酸的產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸序列比對

目前關(guān)于酵母中pxa1p基因功能的研究主要集中在S. cerevisiae和Y. lipolytica中。通過NCBI分別檢索S. cerevisiae中Pxa1p (870 aa) 和Y. lipolytica中YlPxa1p (NCBI No. AJW19428.1，930 aa) 蛋白的氨基酸序列，并利用DNAMAN進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果如圖2所示。分析發(fā)現(xiàn)，C. tropicalis中的CtPxa1p長度為732 aa，短于S. cerevisiae和Y. lipolytica中對應(yīng)的蛋白序列，同時雖然C. tropicalis中的CtPxa1p序列與S. cerevisiae和Y. lipolytica中對應(yīng)的蛋白序列都屬于ABC跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，并定位于過氧化物酶體膜上，但與兩者相比氨基酸序列一致性較低，分別僅為41%和38%，因此C. tropicalis中的CtPxa1p蛋白的具體功能還需要進(jìn)一步研究。

圖2 氨基酸序列相似性分析Fig. 2 Putative amino acid sequence alignment.

2.2C. tropicalis1798-pxa1工程菌的構(gòu)建

以C. tropicalis1798基因組為模板，以pxa1p F1、pxa1p R1為引物，PCR克隆同源臂pxa1p1，獲得大小為550 bp左右的條帶，結(jié)果如圖3A所示，與理論值553 bp接近。以pPIC 9K基因組為模板，以kan F1、kan R1為引物，克隆kanr基因，獲得大小為1 600 bp左右的條帶(圖3B)，與理論值1 561 bp接近。重疊PCR將同源臂pxa1p1與kanr基因連接起來，得到pxa1p1-kanr片段，獲得大小為2 100 bp左右的條帶(圖3C)，與理論值2 148 bp接近，該結(jié)果表明通過重疊PCR方法成功獲得了pxa1p1和kanr的融合片段。

2.3pxa1p1-kanr電轉(zhuǎn)化及鑒定

用EcoR I 酶切1 mLpxa1p1-kanr片段，并用乙醇濃縮法濃縮獲得的酶切片段，使用核酸超微量分光光度計(jì) (BioFuture MD2000) 測定回收DNA濃度，結(jié)果顯示DNA濃度為564.32 ng/μL。將10 μL回收片段與100 μLC. tropicalis1798感受態(tài)細(xì)胞混合并電轉(zhuǎn)化，并使用引物pxa1p F3和kan R1對含G418 (終濃度800 μg/mL) 平板上生長菌落的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，獲得大小為2 200 bp左右的條帶(圖4)，與理論值2 169 bp接近，表明pxa1p1-kanr與pxa1發(fā)生同源重組，完成ctpxa1基因的敲除。

2.4C. tropicalis1798、C. tropicalis1798-pxa1菌株中ctpxa1基因表達(dá)量

提取C. tropicalis1798、C. tropicalis1798-pxa1總RNA進(jìn)行半定量RT-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示，通過Quantity One軟件對灰度值進(jìn)行分析，ctpxa1基因在C. tropicalis1798、C. tropicalis1798-pxa1灰度值比值為2.03，證明ctpxa1基因在C. tropicalis1798-pxa1的表達(dá)量下降。

圖3 PCR擴(kuò)增目的基因Fig. 3 PCR amplification of the target gene. (A) PCR product of homology armspxa1p1gene. M: marker DL5000; 1–2: 550 bp DNA fragment ofpxa1p1gene fromC. tropicalis1798. (B) PCR product ofkanrgene. M: marker DL5000; 1–2: 1 600 bp DNA fragment ofkanrgene from plasmid pPIC 9K. (C) Product of overlap PCR. M: marker DL5000; 1–2: 2 100 bp DNA fragment by overlap PCR.

圖4 工程菌C. tropicalis1798-pxa1的PCR驗(yàn)證Fig. 4 PCR verification ofC. tropicalis1798-pxa1. M: marker DL5000; 1–2: 3 700 bp PCR product ofC. tropicalis1798-pxa1.

圖5 PCR擴(kuò)增目的基因Fig. 5 PCR amplification of the target gene. M: marker DL5000; 1: 2 100 bp PCR product ofC. tropicalis1798; 2: 2 100 bp PCR product ofC. tropicalis1798-pxa1.

2.5C. tropicalis1798、C. tropicalis1798-pxa1生長曲線

取種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于裝液量為50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板瓶中，接種量為10%，30 ℃、220 r/min，每2 h取樣一次，發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)，蒸餾水為對照，測定OD600，結(jié)果如圖6所示。從生長曲線可以看出C. tropicalis1798與C. tropicalis1798-pxa1生長情況相近，表明以葡萄糖為碳源培養(yǎng)時，ctpxa1基因敲除對C. tropicalis1798的生長沒有顯著影響。

2.6 以十二烷為底物C. tropicalis1798-pxa1發(fā)酵驗(yàn)證

圖6 C. tropicalis1798和C. tropicalis1798-pxa1生長曲線Fig. 6 The growth curves ofC. tropicalis1798 andC. tropicalis1798-pxa1.

圖7 C. tropicalis1798和C. tropicalis1798-pxa1發(fā)酵十二烷烴曲線Fig. 7 Fermentation curves of dodecane byC. tropicalis1798 andC. tropicalis1798-pxa1.

發(fā)酵培養(yǎng)12 h后加入5 mL的十二烷烴，每12 h調(diào)節(jié)pH到7.5并取樣，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，測得十二碳二元酸的濃度，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示C. tropicalis1798-pxa1比C. tropicalis1798產(chǎn)十二碳二元酸的量明顯提升，其產(chǎn)出濃度為10.3 g/L，比C. tropicalis1798產(chǎn)十二碳二元酸提高了94.3%，同時產(chǎn)酸階段的時間也由野生型的120 h延長至144 h，表明ctpxa1基因敲除提高了熱帶假絲酵母產(chǎn)十二碳二元酸的能力，同時也延長了產(chǎn)酸期。

3 討論

在二元酸發(fā)酵過程中，烷烴氧化為一元脂肪酸后，有兩條代謝途徑：ω-氧化和β-氧化。ω-氧化將一元酸的ω碳末端進(jìn)一步氧化，形成目的產(chǎn)物二元酸，而β-氧化則將中間產(chǎn)物一元酸以及目的產(chǎn)物降解，從而進(jìn)入TCA循環(huán)，為細(xì)胞生長提供能量。目前針對熱帶假絲酵母的基因工程改造多集中在提高ω-氧化的過程上，以降低β-氧化為目的的菌株改造報(bào)道較少，Picataggio等[20]阻斷β-氧化中脂酰輔酶A氧化酶提高了長鏈二元酸的轉(zhuǎn)化率。高弘等[21-22]通過敲除發(fā)現(xiàn)肉毒堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 (CAT) 阻斷乙酰輔酶A由過氧化物酶體到線粒體過程的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少烷烴通過β-氧化途徑的消耗，能夠提高烷烴的轉(zhuǎn)化率，但CAT基因的缺失會影響菌體代謝短鏈和中鏈脂肪酸的過程，進(jìn)而影響酵母的生長和產(chǎn)酸的過程。長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pxa1p定位在S. cerevisiae中的過氧化物酶體膜上，特異性介導(dǎo)長鏈脂肪酸進(jìn)入過氧化物酶體的過程，但該蛋白在假絲酵母中與長鏈二元酸的消耗的關(guān)系尚未明晰。本研究首選通過基因比對分析找到熱帶假絲酵母潛在的長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并通過基因敲除手段對該蛋白的功能進(jìn)行分析，探索阻礙部分長鏈脂肪酸進(jìn)入過氧化物酶體，減少長鏈脂肪酸消耗的新途徑。構(gòu)建菌株C. tropicalis1798-pxa1較原始菌株C. tropicalis1798十二碳二元酸產(chǎn)量提高了94.3%，產(chǎn)出濃度為10.3 g/L。由此推測ctpxa1基因的敲除，阻斷了部分長鏈脂肪酸進(jìn)入過氧化物酶體中，減弱了β-氧化反應(yīng)與長鏈二元酸的消耗，提高了長鏈二元酸的產(chǎn)量。

酵母菌中目的基因敲除常用的方法是雙交換同源重組[23-24]，即采用以質(zhì)粒為載體的同源雙交換法，獲取目的基因上下游兩段基因序列作為同源臂，構(gòu)建穿梭載體或自殺載體并轉(zhuǎn)化到目的菌株中，轉(zhuǎn)化后需先后發(fā)生兩次單交換，實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除[25]。本研究與雙交換同源重組之間的區(qū)別在于目的基因的敲除利用的是一次單交換，并且通過重疊PCR方法直接構(gòu)建熱帶假絲酵母敲除元件pxa1p-kanr，省去構(gòu)建基因敲除載體及測序的過程。該方法具有簡單、穩(wěn)定、易行和節(jié)約時間等優(yōu)點(diǎn)，同時由于所構(gòu)建的片段較短，因此轉(zhuǎn)化效率相對較高。該方法對其他微生物的基因敲除也有一定的借鑒意義。

REFERENCES

[1] Hattori K, Suzuki T. Microbial production of d-arabitol byn-alkane-grownCandida tropicalis. Agric Biol Chem, 2014, 38(10): 1875–1881.

[2] Ferdinandusse S, Denis S, van Roermund CWT, et al. Identification of the peroxisomal β-oxidation enzymes involved in the degradation of long-chain dicarboxylic acids. J Lipid Res, 2004, 45(6): 1104–1111.

[3] Wang JX, Ding HY, He LF, et al. Influence of growth factor and emulsifier on dodecanedioic acid fermentation byCandida tropicalis. China Brew, 2011, (5): 87–89 (in Chinese).王佳新, 丁海燕, 何連芳, 等. 生長因子和乳化劑對熱帶假絲酵母產(chǎn)十二碳二元酸發(fā)酵的影響.中國釀造, 2011, (5): 87–89.

[4] Lasorsa FM, Scarcia P, Erdmann R, et al. The yeast peroxisomal adenine nucleotide transporter: characterization of two transport modes and involvement in ΔpH formation across peroxisomal membranes. Biochem J, 2004, 381(3): 581–585.

[5] Van Roermund CWT, Ijlst L, Majczak W, et al. Peroxisomal fatty acid uptake mechanism inSaccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 2012, 287(24): 20144–20153.

[6] Wang JJ, Zhang B, Chen SL. Oleaginous yeastYarrowia lipolyticamutants with a disrupted fatty acyl-CoA synthetase gene accumulate saturated fatty acid. Process Biochem, 2011, 46(7): 1436–1441.

[7] Beopoulos A, Mrozova Z, Thevenieau F, et al. Control of lipid accumulation in the yeastYarrowia lipolytica. Appl Environ Microbiol, 2008, 74(24): 7779–7789.

[8] Court DL, Sawitzke JA, Thomason LC. Genetic engineering using homologous recombination. Annu Rev Genet, 2002, 36(1): 361–388.

[9] Choi BK, Bobrowicz P, Davidson RC. Use of combinatorial genetic libraries to humanize N-linked glycosylation in the yeastPichia pastoris. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(9): 5022–5027.

[10] Liu SC, Li C, Fang XC, et al. Optimal pH control strategy for high-level production of long-chain α, ω-dicarboxylic acid byCandida tropicalis. Enzyme Microb Technol, 2004, 34(1): 73–77.

[11] Beopoulos A, Nicaud JM, Gaillardin C. An overview of lipid metabolism in yeasts and its impact on biotechnological processes. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 90(4): 1193–1206.

[12] Liu SC, Li SL, Yang D, et al. Fermentation of 1,13-tridecane dicarboxylic acid in an industrial pilot plant. Petrochem Technol, 2002, 31(7): 558–561 (in Chinese).劉樹臣, 李淑蘭, 楊東, 等. 十三碳二元酸發(fā)酵工業(yè)試驗(yàn). 石油化工, 2002, 31(7): 558–561.

[13] Green KD, Turner MK, Woodley JM.Candida cloacaeoxidation of long-chain fatty acids to dioic acids. Enzyme Microb Technol, 2000, 27(3/5): 205–211.

[14] Ma YC, Yu HM, Pan WY, et al. Identification of nitrile hydratase-producingRhodococcus ruberTH and characterization of anamiE-negative mutant. Bioresour Technol, 2010, 101(1): 285–291.

[15] De Crescenzo G, Grothe S, Zwaagstra J, et al. Real-time monitoring of the interactions of transforming growth factor-β (TGF-β) isoforms with latency-associated protein and the ectodomains of the TGF-β type II and III receptors reveals different kinetic models and stoichiometries of binding. J Biol Chem, 2001, 276(32): 29632–29643.

[16] Teder T, Boeglin WE, Brash AR. Lipoxygenase-catalyzed transformation of epoxy fatty acids to hydroxy-endoperoxides: a potential P450 and lipoxygenase interaction. J Lipid Res, 2014, 55(12): 2587–2596.

[17] Uccelletti D, Farina F, Mancini P, et al. KlPMR1 inactivation and calcium addition enhance secretion of non-hyperglycosylated heterologous proteins inKluyveromyces lactis. J Biotechnol, 2004, 109(1/2): 93–101.

[18] van Roermund CWT, Drissen R, van den Berg M, et al. Identification of a peroxisomal ATP carrier required for medium-chain fatty acid β-oxidation and normal peroxisome proliferation inSaccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 2001, 21(13): 4321–4329.

[19] Cho YH, Lee HJ, Lee JE, et al. Fast determination of multiple-reaction intermediates for long-chain dicarboxylic acid biotransformation by gas chromatography-flame ionization detector. J Microbiol Biotechnol, 2015, 25(5): 704–708.

[20] Picataggio S, Rohrer T, Deanda K, et al. Metabolic engineering ofCandida tropicalisfor the production of long-chain dicarboxylic acids. Nat Biotechnol, 1992, 10(8): 894–898.

[21] Gao H, Zhang J, Hua YT, et al. Effects of carnitine acetyltransferase gene knockout on long chain dicarboxylic acid production and metabolism ofCandida tropicalis. Acta Microbiol Sin, 2005,45(1): 102–105 (in Chinese).高弘, 張劍, 華玉濤, 等. 肉毒堿乙酰轉(zhuǎn)移酶基因敲除對長鏈二元酸生產(chǎn)代謝過程的影響. 微生物學(xué)報(bào), 2005, 45(1): 102–105.

[22] Gao H, Huang YM, Liu M, et al. Effects of CAT gene knockout on DCA13 metabolic network ofCandida tropicalis. J Chem Ind Eng (China), 2006, 57(9): 2157–2161 (in Chinese).高弘, 黃英明, 劉銘, 等. CAT基因敲除對熱帶假絲酵母產(chǎn)DCA13代謝網(wǎng)絡(luò)的影響. 化工學(xué)報(bào), 2006, 57(9): 2157–2161.

[23] Xu Y, Tu Z. Application and progress of filamentous fungi gene targeting. J Food Sci Biotechnol, 2007, 26(1): 120–126 (in Chinese).許楊, 涂追. 絲狀真菌基因敲除技術(shù)研究進(jìn)展.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2007, 26(1): 120-126.

[24] Xiang Z, Chen XZ, Zhang LH, et al. Development of a genetic transformation system forCandida tropicalisbased on a reusable selection marker ofURA3gene. Hereditas (Beijing), 2014, 36(10): 1053–1061 (in Chinese).項(xiàng)崢, 陳獻(xiàn)忠, 張利華, 等. 利用可重復(fù)使用的URA3標(biāo)記基因建立熱帶假絲酵母基因敲除系統(tǒng). 遺傳, 2014, 36(10): 1053–1061.

[25] Xue KJ, Liu B, Chang SH, et al. A high efficient method to knockout target gene by two-step homologous recombination inPichia pastoris.Lett Biotechnol, 2010, 21(5): 650–654 (in Chinese).薛奎晶, 劉波, 唱韶紅, 等. 一種兩步基因同源重組敲除酵母靶標(biāo)蛋白基因的方法. 生物技術(shù)通訊, 2010, 21(5): 650–654.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Effect ofctpxa1gene deletion inCandida tropicalison long chain dicarboxylic acid accumulation

Cheng Cheng, Junqing Wang, Tengfei Wang, Xiaohui Yang, and Ruiming Wang
College of Biological Engineering,Qilu University of Technology,Jinan250353,Shandong,China

Candida tropicalisuses alkanes and fatty acids to produce long chain dicarboxylic acids. However, the yield can be affected by β-oxidation in peroxisomes. Pxa1p was a membrane protein ofSaccharomyces cerevisiaeperoxisomes.Pxa1p and Pxa2p form a dimer that is involved in transporting of long chain fatty acids into peroxisomes, but the similar transporting system ofCandida tropicalishas not yet been reported. In this study, actpxa1gene deletion strain namedC. tropicalis1798-pxa1was constructed by homologous single exchange method using PCR fragment. The expression ofctpxa1gene inC. tropicalis1798,C. tropicalis1798-pxa1was detected by semi-quantitative RT-PCR, and the ratio of gray value was 2.03, implying that the expression ofctpxa1inC. tropicalis1798-pxa1was weakened. After 144 h fermentation, the dodecanedioic acid production ofC. tropicalis1798-pxa1was increased 94.3% than the former strain, the maximum yield was 10.3 g/L.

Candida tropicalis, long chain dicarboxylic acid,ctpxa1pgene, peroxisomes

Ruiming Wang. Tel: +86-531-89631076; E-mail: ruiming3k@163.com

Received:June 22, 2016;Accepted:December 6, 2016

Supported by:Shandong Province Independent Innovation and Achievement Transformation Project (No. 201422CX02602).

山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng) (No. 201422CX02602) 資助。