常麗賢，孫聰聰，陳曉娟，楊文鈺，張家源，張英弛，袁衛(wèi)平，竺曉凡

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所，天津 300020

利用CRISPR/Cas9n double nick系統(tǒng)構(gòu)建人DNAH2基因敲除的U2OS細(xì)胞株

常麗賢，孫聰聰，陳曉娟，楊文鈺，張家源，張英弛，袁衛(wèi)平，竺曉凡

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所，天津 300020

常麗賢, 孫聰聰, 陳曉娟, 等. 利用CRISPR/Cas9n double nick系統(tǒng)構(gòu)建人DNAH2基因敲除的U2OS細(xì)胞株. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(2): 284–293.

Chang LX, Sun CC, Chen XJ, et al. Knocking out of humanDNAH2gene in U2OS cells by CRISPR/Cas9n double nick system. Chin J Biotech, 2017, 33(2): 284–293.

基于CRISPR/Cas9n double nick技術(shù)構(gòu)建人DNAH2(Homo sapiens dynein, axonemal, heavy chain 2) 基因敲除的U2OS穩(wěn)定細(xì)胞株，旨在研究DNAH2基因的生物學(xué)功能。首先設(shè)計(jì)并合成A、B兩個(gè)sgRNA (Single guide RNA) 以及各自的互補(bǔ)鏈，退火連接形成DNAH2 sgRNA-A、B雙鏈，再分別與帶有BbsⅠ粘性末端的pX462線性載體相連，形成pX462-DNAH2-A、pX462-DNAH2-B重組真核表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞后，加入嘌呤霉素，以有限稀釋法獲得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，再以蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNAH2蛋白的表達(dá)，最后通過(guò)PCR-基因測(cè)序技術(shù)分析突變特點(diǎn)。結(jié)果顯示A、B sgRNA雙鏈成功插入pX462載體，U2OS-DNAH2-KO單克隆細(xì)胞株中DNAH2蛋白不表達(dá)，DNAH2基因發(fā)生移碼突變，從而證實(shí)利用CRISPR/Cas9n double nick系統(tǒng)成功構(gòu)建人DNAH2基因敲除的U2OS穩(wěn)定細(xì)胞株，為研究DNAH2基因提供有利工具。

DNAH2，CRISPR/Cas9n，基因敲除，穩(wěn)定細(xì)胞株

DNAH2(Homo sapiens dynein，axonemal，heavy chain 2) 基因可以編碼DNAH2蛋白，后者主要表達(dá)于氣管和睪丸部位，可參與精子鞭毛的組成，是呼吸道纖毛主要的動(dòng)力產(chǎn)生蛋白[1-3]。DNAH2基因突變的患者可能會(huì)出現(xiàn)呼吸道抵抗力下降、反復(fù)呼吸道感染、支氣管擴(kuò)張癥等癥狀[2-4]。范可尼貧血 (Fanconi anemia，F(xiàn)A) 是一種主要由FA基因純合或復(fù)合雜合突變引起的常染色體或X連鎖隱性遺傳性疾病[5-7]。目前已發(fā)現(xiàn)并克隆出多個(gè)可致范可尼貧血的突變基因(如FANCA、FANCB、FANCD1、FANCD2等)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)明確診斷為范可尼貧血的5例患者及其父母進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5例患者均有已知FA基因突變，并且含有2個(gè)或2個(gè)以上FA基因的雜合突變，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了其他多個(gè)新的突變基因，其中包括DNAH2基因[8]。然而，目前尚無(wú)DNAH2基因與范可尼貧血的相關(guān)性研究。CRISPR/Cas9 (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9) 系統(tǒng)是一種在sgRNA的指導(dǎo)下，在基因組水平上對(duì)目的基因DNA序列進(jìn)行改造的定點(diǎn)編輯技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)于目的基因的完全敲除。本實(shí)驗(yàn)旨在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立DNAH2基因靶向敲除細(xì)胞株，有助于探討DNAH2基因在范可尼貧血中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

U2OS細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存；trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、Taq酶、SDS上樣緩沖液、0.2%通透液購(gòu)自天津科儀嘉欣科技有限公司；真核表達(dá)質(zhì)粒pSpCas9n(BB)-2A-Puro (pX462) 購(gòu)自Addgene；限制性內(nèi)切酶BbsⅠ購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；質(zhì)粒保護(hù)核酸外切酶(PlasmidSafe exonuclease) 購(gòu)自epicentre公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；DNA快速凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；嘌呤霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖匈?gòu)自北京索來(lái)寶科技有限公司；sgRNA序列及基因測(cè)序工作由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promega公司；NeoFect DNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自零客創(chuàng)智有限公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自Pierce公司；鼠源單克隆抗DNAH2抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備；鼠源單克隆抗β-actin蛋白抗體購(gòu)自Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG二抗購(gòu)自KPL公司；BeyoECL Plus (超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒) 購(gòu)于碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA寡核苷酸雙鏈序列設(shè)計(jì)

應(yīng)用http://crispr.mit.edu/網(wǎng)站針對(duì)DNAH2基因 (NM_020877.2) 第1個(gè)外顯子區(qū)的序列“5?-ATGTCCAGCAAAGCTGAGAAGAAGCAG CGATTGAGTGGCCGAGGAAGCTCCCAGGC AAGCTGGTCAGGGCGGGCCACTCGGGCTG CTGTGGCCACACAGGAGCAGGGGAATGCC CCGGCTGTCAGTGAGCCAGAGCTGCAGGCT GAGCTCCCCAAGGAGGAGCCTG-3?”進(jìn)行A、B兩個(gè)sgRNA的靶點(diǎn)選擇及序列設(shè)計(jì)。首先通過(guò)在線網(wǎng)站獲取特定靶點(diǎn)的A、B兩對(duì)sgRNA原始片段，再對(duì)A原始片段進(jìn)行如下修改：1) 去掉由網(wǎng)站設(shè)計(jì)的sgRNA原始片段3′端的“NGG”；5′端添加“CACC”，若“CACC”后非“G”，可加入“G”，以增加酶切效率，從而獲得DNAH2-sgRNA-A序列；2) 去掉由網(wǎng)站設(shè)計(jì)的sgRNA片段3′端的“NGG”；再以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出反向互補(bǔ)序列；5′端添加“AAAC”后即為DNAH2-sgRNA-A序列的互補(bǔ)鏈。然后，依此法對(duì)B原始片段進(jìn)行修改。由此便分別獲得帶有BbsⅠ酶切位點(diǎn)的DNAH2-sgRNA-A、DNAH2-sgRNA-B兩種寡核苷酸雙鏈，具體序列見(jiàn)表1。

1.2.2 DNAH2-sgRNA雙鏈和線性pX462載體的獲取

由公司合成上述的DNAH2 sgRNA序列及其互補(bǔ)鏈；利用Thermo cycler使sgRNA序列與其互補(bǔ)鏈退火連接形成DNAH2-sgRNA-A、B兩個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)，并稀釋至0.5 μmol/L。反應(yīng)體系：100 nmol/L DNAH2-sgRNA-A/B，100 nmol/L sgRNA-A/B的互補(bǔ)鏈，1 μL 10×T4 連接緩沖液，100 U T4 PNK，加超純水至10 μL。退火程序：95 ℃ 5 min；94℃ l min，–l ℃/循環(huán)，22個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30 min；71 ℃ 1 min，–1 ℃/循環(huán)，46個(gè)循環(huán)；4 ℃ 1 h。同時(shí)，以質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖刑崛X462質(zhì)粒，再以BbsⅠ限制性內(nèi)切酶，37 ℃、15 min進(jìn)行酶切線性化。反應(yīng)體系：1 μg pX462載體，1 μLBbsⅠ，1 μLFastAP，2 μL 10×Green Fast Digest Buffer，加超純水稀釋至20 μL。以DNA快速凝膠回收試劑盒回收線性pX462載體。

表1 DNAH2 sgRNA (A-B) 寡核苷酸雙鏈序列Table 1 The double-stranded oligonucleotide sequences of DNAH2 sgRNA (A-B)

1.2.3 pX462-DNAH2-sgRNA的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定

取50 ng線性化pX462質(zhì)粒，1 μL DNAH2-sgRNA雙鏈 (0.5 μmol/L)，1.5 μL 10×T4 DNA連接酶緩沖液，0.5 μL 牛血清白蛋白 (10 g/L)，再加超純水至11 μL體系，室溫孵育60 min。在上述體系中加入1.5 μL 10×質(zhì)粒保護(hù)緩沖液，1.5 μL ATP (10 mmol/L)，1 μL質(zhì)粒保護(hù)核酸外切酶，37 ℃孵育30 min，目的是防止非特異的重組產(chǎn)物。然后，分別將連接的pX462-DNAH2-sgRNA-A、B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆進(jìn)行搖菌擴(kuò)增；再以質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖刑崛蓚€(gè)重組質(zhì)粒pX462-DNAH2-A和pX462-DNAH2-B，分別采用U6啟動(dòng)子序列 (ATACGATACAAGGCTGT TAGAGAGATA) 進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，同時(shí)利用BbsⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染

在6孔板內(nèi)以高糖-DMEM培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清)，5% CO2、37 ℃常規(guī)培養(yǎng)U2OS細(xì)胞。以去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒，包括pX462-DNAH2-A、pX462-DNAH2-B及空載體對(duì)照pX462。當(dāng)U2OS細(xì)胞達(dá)60%?70%匯合時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基，1 h后根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以NeoFect轉(zhuǎn)染試劑對(duì)U2OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照pX462，以制備U2OS-DNAH2-WT細(xì)胞株；或共轉(zhuǎn)染pX462-DNAH2-A、pX462-DNAH2-B質(zhì)粒，以制備U2OS-DNAH2-KO細(xì)胞株。

1.2.5 細(xì)胞穩(wěn)定株的單克隆篩選

以6孔板常規(guī)培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染的U2OS細(xì)胞，分別以加入20、10、5、2.5、1.25和0.62 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，確定將所有未轉(zhuǎn)染的U2OS細(xì)胞殺死的最低濃度為2.5 μg/mL。然后在上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，更換培養(yǎng)基為含有2.5 μg/mL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后撤去嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，以胰酶消化后鋪到15 cm皿中，平均每個(gè)顯微鏡低倍鏡視野中有3?5個(gè)細(xì)胞即可。待細(xì)胞長(zhǎng)出單克隆集落時(shí)，以高壓滅菌過(guò)的細(xì)棉簽將單克隆集落輕輕刮取，分別移至96孔板中培養(yǎng)，并進(jìn)行編號(hào)。待96孔板長(zhǎng)滿，移至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)鑒定

分別將上述各孔細(xì)胞再接種至6 cm皿中擴(kuò)大培養(yǎng)。對(duì)同一單克隆來(lái)源的細(xì)胞分為兩部分，一部分進(jìn)行蛋白印跡鑒定，另一部分繼續(xù)培養(yǎng)，用于鑒定成功后的細(xì)胞凍存。待細(xì)胞融合至80%?90%，先以1×磷酸緩沖液 (PBS) 溶液洗滌細(xì)胞3次，再加入預(yù)冷的1×NP-40裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞后4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清獲得全細(xì)胞裂解液；再以BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度；裂解液中加入SDS上樣緩沖液，99 ℃熱變性5 min，進(jìn)行6% SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，以濕轉(zhuǎn)法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉3 h，分別加入鼠源單克隆抗DNAH2或抗β-actin一抗 (1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG二抗 (1∶15 000) 室溫孵育1 h，TBST溶液再次洗膜3次，10 min/次。加入BeyoECL Plus (超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)后暗室曝光。

1.2.7 PCR-基因測(cè)序分析

常規(guī)培養(yǎng)單克隆細(xì)胞株，提取基因組DNA，以PCR法擴(kuò)增包含第1個(gè)外顯子的DNA片段，再以DNA快速凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物后送測(cè)序，分析第1個(gè)外顯子區(qū)的序列特點(diǎn)。相關(guān)引物序列見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 pX462-DNAH2-sgRNA的構(gòu)建

首先提取pX462質(zhì)粒 (圖譜見(jiàn)圖1A)，并以BbsⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理，膠回收含BbsⅠ粘性末端的pX462線性片段；由公司合成DNAH2 sgRNA-A、B以及其互補(bǔ)鏈，退火連接形成含BbsⅠ粘性末端的寡核苷酸雙鏈結(jié)構(gòu)(圖1B)；然后以T4 DNA連接酶將pX462線性片段分別與DNAH2 sgRNA-A、B寡核苷酸雙鏈結(jié)構(gòu)相連形成pX462-DNAH2-A、pX462-DNAH2-B重組真核表達(dá)質(zhì)粒。將這兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)2OS細(xì)胞中，可表達(dá)DNAH2 sgRNA-A、B和Cas9n蛋白。在sgRNA引導(dǎo)下，Cas9n蛋白識(shí)別DNAH2基因的第1個(gè)外顯子進(jìn)行剪切、重組，最終實(shí)現(xiàn)DNAH2基因的敲除 (圖1C)。

表2 PCR及基因測(cè)序引物序列Table 2 The primer sequences of the PCR and gene sequencing

圖1 pX462載體及sgRNA寡核苷酸雙鏈序列Fig. 1 The enzyme digestion of pX462-DNAH2-sgRNA recombinant plasmid. (A) The map of pX462 plasmid. (B) The A, B sgRNAs and complementary strands were designed and synthesized. The double-stranded oligonucleotide structures containingBbsⅠ cohesive ends were formed during annealing. (C) The constructed recombinant eukaryotic expression plasmids, including pX462-DNAH2-A, pX462-DNAH2-B, can lead to the knocking out ofDNAH2gene, through the role of two sgRNAs in the exon 1 regions ofDNAH2gene.

2.2 pX462-DNAH2-sgRNA的酶切與測(cè)序鑒定

分別以BbsⅠ限制性內(nèi)切酶酶切與基因測(cè)序方法對(duì)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pX462-DNAH2-A、pX462-DNAH2-B進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，pX462空載質(zhì)?？杀籅bsⅠ內(nèi)切酶酶切為線性載體 (泳道2)；但成功插入DNAH2 sgRNA-A、B寡核苷酸雙鏈結(jié)構(gòu)的真核表達(dá)質(zhì)粒pX462-DNAH2-A、pX462-DNAH2-B，已經(jīng)破壞了BbsⅠ酶切位點(diǎn)，故不會(huì)被BbsⅠ酶切割為線性質(zhì)粒 (泳道4，6)。同時(shí)，基因測(cè)序結(jié)果(圖3) 表明DNAH2 sgRNA-A、B寡核苷酸雙鏈已成功插入pX462載體。

圖2 pX462-DNAH2-sgRNA重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 2 The enzyme digestion of pX462-DNAH2-sgRNA recombinant plasmid. 1: pX462 vector/BbsⅠ (-); 2: pX462 vector/BbsⅠ (+); 3: pX462-DNAH2- sgRNA-A/BbsⅠ (-); 4: pX462-DNAH2-sgRNA-A/BbsⅠ (+); 5: pX462-DNAH2-sgRNA-B/BbsⅠ (-); 6: pX462-DNAH2-sgRNAB/BbsⅠ (+); M: marker.

圖3 pX462-DNAH2-sgRNA重組質(zhì)粒的基因測(cè)序鑒定Fig. 3 The gene sequencing of pX462-DNAH2-sgRNA recombinant plasmid.

2.3 U2OS-DNAH2-KO單克隆細(xì)胞穩(wěn)定株的蛋白印跡鑒定

通過(guò)篩選，獲得U2OS-DNAH2-KO的3個(gè)單克隆株 (#1?#3) 和U2OS-DNAH2-WT，再分別以NP-40裂解液裂解細(xì)胞獲全細(xì)胞裂解液，以鼠源抗DNAH2、β-actin抗體進(jìn)行蛋白印跡鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，U2OS-DNAH2-WT細(xì)胞 (泳道1) 和U2OS-DNAH2-KO細(xì)胞株的#2號(hào) (泳道3) 表達(dá)DNAH2蛋白，而U2OS-DNAH2-KO細(xì)胞株的#1號(hào) (泳道2) 與#3號(hào) (泳道4) 中DNAH2不表達(dá)。β-actin內(nèi)參蛋白同時(shí)表達(dá)于以上4個(gè)細(xì)胞株。這些證明#1、#3這兩個(gè)細(xì)胞株中的DNAH2基因已被敲除。

2.4 U2OS-DNAH2-KO單克隆細(xì)胞穩(wěn)定株的PCR-基因測(cè)序分析

分別對(duì)U2OS-DNAH2-WT細(xì)胞和U2OSDNAH2-KO細(xì)胞株 (#1、#3) 進(jìn)行PCR-基因測(cè)序分析。結(jié)果如圖5所示，U2OS-DNAH2-WT單克隆細(xì)胞穩(wěn)定株沒(méi)有發(fā)生基因突變；而U2OS-DNAH2-KO (#1) 細(xì)胞株中在sgRNA (A)與sgRNA (B) 識(shí)別區(qū)域間發(fā)現(xiàn)多處點(diǎn)突變，以及8個(gè)堿基的插入突變；U2OS-DNAH2-KO (#3)細(xì)胞株也發(fā)生類似多處點(diǎn)突變和1個(gè)堿基的插入突變。兩者均可導(dǎo)致DNAH2基因發(fā)生移碼突變。

圖4 U2OS-DNAH2-KO細(xì)胞穩(wěn)定株的蛋白印跡實(shí)驗(yàn)Fig. 4 Western blotting of U2OS-DNAH2-KO stable cell lines. 1: U2OS-DNAH2-WT; 2: U2OS-DNAH2-KO (#1); 3: U2OS-DNAH2-KO (#2); 4: U2OS-DNAH2-KO (#3).

圖5 單克隆細(xì)胞株的PCR-基因測(cè)序分析Fig. 5 PCR-gene sequencing analysis of monoclonal cell lines. (A) U2OS-DNAH2-WT. (B) U2OS-DNAH2-KO (#1). (C) U2OS-DNAH2-KO (#3). “CCC”: the complementary “NGG” site for sgRNA-A; “AGG”: the “NGG” site for sgRNA-B; left black line: binding sequence of sgRNA-A; right black line: complementary binding sequence of sgRNA-B; black arrows: point mutation; red dot: insertion mutation.

3 討論

利用siRNA (Small interfering RNA)、shRNA (Small hairpin RNA) 等技術(shù)可以下調(diào)細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)，但這種技術(shù)不能完全敲除細(xì)胞內(nèi)的目的基因。基因編輯技術(shù)則是利用多種基因修飾手段從DNA水平對(duì)目的基因的斷裂區(qū)進(jìn)行缺失、插入、替換和修復(fù)等靶向改造，最終可以導(dǎo)致細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)目的基因的完全敲除[9-12]。目前，最常見(jiàn)的基因編輯系統(tǒng)包括鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases，TALEN) 和CRISPR/Cas9[13]。ZFN系統(tǒng)是由FokⅠ核酸內(nèi)切酶和一系列鋅指蛋白組成，兩個(gè)ZFN分別與目的基因特定位點(diǎn)識(shí)別后激活FokⅠ，后者介導(dǎo)DNA的雙鏈斷裂[14]。TALEN系統(tǒng)是由FokⅠ酶和TALE蛋白組成，利用TALE的序列模塊組裝成模塊化組合蛋白，后者可與DNA序列結(jié)合，激活FokⅠ酶的雙鏈切割功能[15]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)則是由Cas9核酸內(nèi)切酶和CRISPR相關(guān)基因組成，基本原理是首先在前間區(qū)序列鄰近基序 (Protospacer adjacent motif，PAM) 處人工設(shè)計(jì)sgRNA，后者可特異性結(jié)合于目的基因靶序列，形成雜合雙鏈；Cas9酶在sgRNA的引導(dǎo)下，能夠?qū)﹄p鏈進(jìn)行切割，造成DNA的雙鏈斷裂；細(xì)胞通過(guò)錯(cuò)誤傾向的非同源末端連接、同源重組修復(fù)等機(jī)制對(duì)切斷的雙鏈進(jìn)行修復(fù)，在斷裂處插入異常堿基或致使正常堿基缺失，造成移碼突變，最終實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除[16-18]。作為第3代基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可操作性強(qiáng)，已廣泛用于人、細(xì)菌、病毒、動(dòng)物及植物的基因編輯研究，在多種基因敲除或標(biāo)簽標(biāo)記穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建、不同基因敲除或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立和致病突變基因的校正等方面發(fā)揮重要作用[19-21]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的高效性有賴于sgRNA與目的基因靶序列的特異性堿基配對(duì)；錯(cuò)配的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致脫靶效應(yīng) (Off-target effects) 的產(chǎn)生[19,22]。學(xué)者們常通過(guò)軟件分析、特定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)評(píng)估或盡量排除脫靶效應(yīng)的影響，比如同時(shí)采用同一目的基因不同區(qū)域的多個(gè)sgRNAs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察是否出現(xiàn)相同表型，或通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方式使基因敲除細(xì)胞株重新表達(dá)目的基因，觀察敲除基因的表型是否恢復(fù)。另外，也可通過(guò)多種手段或方法從技術(shù)層面來(lái)降低脫靶效應(yīng)，比如設(shè)計(jì)與非靶標(biāo)位點(diǎn)互補(bǔ)性最低的高效sgRNA序列；改造或?qū)ふ腋鼜?qiáng)效的Cas酶；采用確保靶向活性的最低質(zhì)粒濃度以及針對(duì)動(dòng)物模型的多次交配稀釋法[22-25]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已得到不同程度的改進(jìn)及應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)所采用的CRISPR/Cas9n double nick改良系統(tǒng)有助于減少脫靶效應(yīng)的影響[10,22,26-29]。野生型Cas9酶會(huì)對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割，而CRISPR/Cas9n double nick系統(tǒng)采用的是Cas9酶的突變體 (Cas9 nickase，Cas9n)，其只對(duì)與sgRNA結(jié)合的DNA單鏈進(jìn)行切割，后者容易被細(xì)胞修復(fù)。因此，只有當(dāng)兩個(gè)距離相近的一對(duì)sgRNA(A/B) 同時(shí)識(shí)別并結(jié)合目的基因的特定區(qū)域后，Cas9n酶才可通過(guò)兩個(gè)相鄰的單鏈切口來(lái)實(shí)現(xiàn)DNA雙鏈的斷裂，從而降低了脫靶效應(yīng)。

DNAH2基因定位于17p13[3]，可編碼DNAH2蛋白，后者包括4 427個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量約為500 kDa (NP_065928.2)。研究發(fā)現(xiàn)，DNAH2蛋白中的P-loop-NTPase結(jié)構(gòu)域含有經(jīng)典的核苷酸磷酸鹽結(jié)合模序 (Walker A與Walker B模序)，并可通過(guò)三磷酸核苷水解酶的作用釋放能量，介導(dǎo)微管間的相互移動(dòng)，最終參與纖毛的運(yùn)動(dòng)[1-3]。目前，學(xué)者對(duì)于DNAH2基因的研究數(shù)據(jù)非常有限。為了方便探討DNAH2基因的功能，本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9n系統(tǒng)建立了DNAH2基因靶向敲除U2OS細(xì)胞株。另外，考慮到范可尼貧血的相關(guān)突變基因多編碼與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白[5]，利用DNAH2基因敲除細(xì)胞株，從DNA損傷修復(fù)角度深入分析DNAH2基因在范可尼貧血中的作用機(jī)制是本實(shí)驗(yàn)室以后工作的重點(diǎn)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Knocking out of humanDNAH2gene in U2OS cells by CRISPR/Cas9n double nick system

Lixian Chang, Congcong Sun, Xiaojuan Chen, Wenyu Yang, Jiayuan Zhang, Yingchi Zhang, Weiping Yuan, and Xiaofan Zhu
Institute of Hematology and Blood Diseases,Hospital Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Tianjin300020,China

To study the biological function ofDNAH2(Homo sapiens dynein, axonemal, heavy chain 2) gene, we constructed human stable U2OS cell line of DNAH2 gene knockout through CRISPR/Cas9n double nick system. The A, B sgRNAs (Single guide RNA) and complementary strands were designed and synthesized. The double-stranded structures were formed during annealing, and connected with BbsⅠ cohesive ends-containing pX462 linear vector to construct the recombinant eukaryotic expression plasmids, including pX462-DNAH2-A and pX462-DNAH2-B. After the co-transfection of the two plasmids into U2OS cells, the addition of puromycin and limiting dilution method were used to obtain positive monoclonal cell line. Western blotting assay was then performed to detect the expression of DNAH2 protein, and PCR-sequencing technology was finally utilized to analyze the mutation feature. The results showed that A, B sgRNAs duplex was successfully inserted into pX462 vector, and DNAH2 protein was not expressed andDNAH2gene suffered from the frame-shift mutation in U2OS-DNAH2-KO monoclonal cell line. These demonstrated that DNAH2 knockout U2OS stable cell line was successfully constructed through CRISPR/Cas9n double nick system, which providing a useful tool for the study of DNAH2 gene.

DNAH2, CRISPR/Cas9n, knock-out, stable cell line

Xiaofan Zhu. Tel/Fax: +86-22-23909196; E-mail: xfzhu@ihcams.ac.cn

Received:July 21, 2016;Accepted:September 26, 2016

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81500156, 81470339, 81470280, 81300394), Tianjin Science and Technology Project (No.12ZCDZSY18100).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 81500156, 81470339, 81470280, 81300394)，天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 12ZCDZSY18100) 資助。