董悅，胡坤樂，李興林，李清艷，張學(xué)禮

1 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457

2 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

3 河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023

代謝工程改造甘油代謝途徑提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量

董悅1,2*，胡坤樂3*，李興林1，李清艷2，張學(xué)禮2

1 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457

2 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308

3 河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023

董悅, 胡坤樂, 李興林, 等. 代謝工程改造甘油代謝途徑提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(2): 247–260.

Dong Y, Hu KL, Li XL, et al. Improving β-carotene production inEscherichia coliby metabolic engineering of glycerol utilization pathway. Chin J Biotech, 2017, 33(2): 247–260.

甘油是生物柴油的副產(chǎn)物，因其價格低廉和高還原性，成為生物發(fā)酵的重要碳源。為了進(jìn)一步提高工程菌對甘油的利用能力，從而提高萜類化合物的合成能力，本研究從β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌CAR015出發(fā)，對其甘油代謝途徑的多個基因進(jìn)行了調(diào)控。首先敲除了編碼3-磷酸甘油抑制子的glpR基因，然后分別用M1-37、M1-46和M1-93三個不同強(qiáng)度的人工調(diào)控元件對glpFK、glpD和tpiA三組基因進(jìn)行單基因調(diào)控和多基因組合調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)用M1-46調(diào)控glpD基因后β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到了64.82 mg/L，是CAR015的4.86倍，甘油消耗速率也提高了100%；調(diào)控tpiA基因后β-胡蘿卜素產(chǎn)量略有提高；調(diào)控glpFK基因后β-胡蘿卜素產(chǎn)量略有降低。說明GlpD是甘油代謝途徑中的關(guān)鍵限速步驟。Q-PCR結(jié)果表明，降低甘油代謝途徑的glpD和glpFK基因轉(zhuǎn)錄水平，增加tpiA基因轉(zhuǎn)錄水平，可以增加細(xì)胞生長速度、提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量，可能是因?yàn)闇p少了丙酮醛毒性所致。組合調(diào)控glpD和tpiA基因，獲得β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高菌株Gly003，其β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)72.45 mg/L、產(chǎn)率達(dá)18.65 mg/g每克干細(xì)胞，分別是出發(fā)菌株CAR015的5.23倍和1.99倍?？傊珿lpD是甘油代謝途徑中的關(guān)鍵限速步驟，適當(dāng)強(qiáng)度調(diào)控glpD，可以有效提高重組大腸桿菌的β-胡蘿卜素產(chǎn)量。

β-胡蘿卜素，萜類化合物，甘油代謝，大腸桿菌

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素家族中的典型代表，也是生物體內(nèi)合成維生素A的前體物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，廣泛應(yīng)用于化工、化妝品、飼料、食品、保健品以及醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]。目前市場上銷售的β-胡蘿卜素有化學(xué)合成和天然提取，化學(xué)合成法合成的產(chǎn)品存在有害物質(zhì)殘留問題，與化學(xué)合成的產(chǎn)品相比，天然β-胡蘿卜素具有更好的生物活性且無毒副作用，隨著人們生活品質(zhì)的不斷提高以及對綠色天然產(chǎn)品的倡導(dǎo)，天然β-胡蘿卜素的市場需求將會越來越大[3]。微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素不受光照、氣候、產(chǎn)地等條件的限制，且產(chǎn)品具有經(jīng)濟(jì)、安全等優(yōu)勢，因此該技術(shù)受到國內(nèi)外市場的廣泛青睞[4-5]。以大腸桿菌作為出發(fā)菌株，運(yùn)用代謝工程手段構(gòu)建產(chǎn)類胡蘿卜素基因工程高產(chǎn)菌株，成為包括β-胡蘿卜素在內(nèi)的多種類胡蘿卜素產(chǎn)品生產(chǎn)開發(fā)的新模式[4-7]。

對產(chǎn)β-胡蘿卜素大腸桿菌的遺傳改造主要集中在過表達(dá)大腸桿菌自身的2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑 (MEP途徑) 中的關(guān)鍵基因和過表達(dá)外源的甲羥戊酸途徑 (MVA途徑)[4-5]。另外，近年來部分研究組通過代謝流分析等，研究了非代謝途徑基因表達(dá)水平對萜類化合物產(chǎn)量的影響。Alper利用代謝流分析，驗(yàn)證了敲除gdhA、aceE、talB、gdhA、aceE和fdhF基因?qū)Ψ鸭t素產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)同時敲除gdhA、aceE和fdhF，產(chǎn)量提高37%[8]。Farmer等通過高表達(dá)pps，平衡PEP和P3G供應(yīng)提高番茄紅素產(chǎn)量[9]。Choi等發(fā)現(xiàn)高表達(dá)pfkA、pgi、fbaA、tpiA、icdA和mdh可以提高番茄紅素產(chǎn)量，fbaA、tpiA和mdh效果最明顯。gdhA和gpmB雙敲除效果最好，同時高表達(dá)mdh和pps，番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到283 mg/L[10]。Zhao等系統(tǒng)研究了中央代謝途徑和ATP合成途徑各基因的轉(zhuǎn)錄水平對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)sucAB、sdhAB和talB基因可以有效提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量，產(chǎn)量比出發(fā)菌株高64%[11]。因此改造大腸桿菌內(nèi)非MEP途徑基因表達(dá)水平成為提高萜烯類化合物合成的重要手段。

甘油是脂肪酸工業(yè)和生物柴油制造工業(yè)不可避免的副產(chǎn)物，曾是我國比較緊缺的化工產(chǎn)品。近年來，隨著國內(nèi)外對生物柴油制造進(jìn)行的研究和應(yīng)用，作為生物柴油的副產(chǎn)物，甘油產(chǎn)量大大增加，價格也大幅度下降[12]。因此，利用甘油作為發(fā)酵原料制造大宗化學(xué)品具有豐富、廉價的優(yōu)勢，同時還可降低生物柴油制造業(yè)處理副產(chǎn)廢物的壓力[13]。此外，與葡萄糖、木糖等糖類底物相比，甘油代謝產(chǎn)生更高的還原力，是發(fā)酵合成還原性化合物的理想碳源[14]。Kim等比較了葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、甘油、半乳糖和乳糖等6種碳源對類胡蘿卜素合成和重組大腸桿菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)使用甘油效果最好，葡萄糖效果最差[15]。Lee等也發(fā)現(xiàn)在LB、2×YT、TB和MR培養(yǎng)基中加入葡萄糖會對類胡蘿卜素的產(chǎn)量產(chǎn)生顯著抑制，而在這些培養(yǎng)基中加入甘油則會提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量[16]。目前報道的甘油轉(zhuǎn)化產(chǎn)品主要有乙醇、丁醇、1,3-丙二醇和丙酸等。許多微生物都可以利用甘油生產(chǎn)有價值的產(chǎn)品。大腸桿菌遺傳背景清晰、基因工程改造手段豐富、營養(yǎng)需求簡單和生長迅速，這些特性使其成為工業(yè)化規(guī)模下利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)大宗化學(xué)品的理想選擇[12]。通過遺傳改良對甘油代謝途徑和產(chǎn)物合成途徑進(jìn)行必要的修飾和改造，有助于實(shí)現(xiàn)在工業(yè)化規(guī)模下高效轉(zhuǎn)化甘油為其他產(chǎn)物[17]。

圖1 大腸桿菌中經(jīng)甘油到萜烯類化合物的代謝途徑表示包含多步催化反應(yīng)Fig. 1 Construction of terpenoid synthetic pathway inE. coliby integrating heterologous gene.

大腸桿菌中存在兩條甘油代謝途徑[18]。好氧條件下，環(huán)境中的甘油主要通過被動運(yùn)輸進(jìn)入到大腸桿菌細(xì)胞中，首先通過細(xì)胞外膜上的孔道蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞周質(zhì)中，然后再通過細(xì)胞內(nèi)膜上孔道蛋白GlpF (glpF編碼) 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞胞漿 (圖1)[19]。進(jìn)入胞漿后的甘油首先在甘油激酶GlpK作用下以ATP作為磷?；w進(jìn)行磷?；?，然后磷?；母视驮?-磷酸甘油脫氫酶GlpD (glpD編碼) 的作用下氧化獲得磷酸二羥丙酮 (DHAP)，在此過程中醌類物質(zhì)作為電子受體；DHAP在磷酸丙糖異構(gòu)酶TpiA (tpiA編碼)作用下發(fā)生異構(gòu)化形成3-磷酸甘油醛并用于后續(xù)代謝過程[18]。3-磷酸甘油醛和丙酮酸是合成萜烯類化合物的直接前體，因此甘油到3-磷酸甘油醛途徑各基因協(xié)調(diào)表達(dá)，是合成β-胡蘿卜素的重要保證。可以通過改造大腸桿菌好氧條件下甘油代謝途徑的相關(guān)基因來提高其對甘油的利用，促進(jìn)目的產(chǎn)物的合成。

有氧條件下，甘油經(jīng)GlpF、GlpK、GlpD和TpiA催化合成3-磷酸甘油醛，這幾個蛋白分別由glpF、glpK、glpD和tpiA編碼而成，glpF和glpK在同一操縱子下，更換基因組上glpF啟動子，就可以同時對這兩個基因進(jìn)行調(diào)控。本研究從實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的產(chǎn)β-胡蘿卜素工程菌株CAR015出發(fā)[20]，敲除了編碼3-磷酸甘油抑制物的glpR基因，并用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的3個不同強(qiáng)度的調(diào)控元件M1-37、M1-46和M1-93[21]對甘油代謝途徑中的glpFK、glpD和tpiA進(jìn)行單基因調(diào)控和多基因組合調(diào)控，提高重組大腸桿菌合成β-胡蘿卜素能力，同時為利用甘油為碳源合成其他萜烯類化合物及其他目標(biāo)產(chǎn)物提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

氨芐青霉素、氯霉素，購自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自美國Axygen公司；SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自生工生物工程 (上海) 有限公司；Trans 2K Plus DNA Marker、EasyTaqPCR SuperMix DNA聚合酶購自北京全式金物工程公司；RNA提取試劑盒 (RNeasy mini kit，Cat，No 74104) 購自Qiagen公司；PrimeSTARTMHS DNA聚合酶和DNase I (Recombinant DNase I，RNase-free，Cat，No 2270 A) 購自寶生物工程(大連) 有限公司；Gold View I型核酸染色劑購自北京索萊寶科技有限公司；Phusion TM超保真DNA聚合酶購自NEB公司；RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo Scientific；胡蘿卜素標(biāo)品購自美國Sigma公司 (Cat. No. C4582)；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計，Shimadzu UV-2550 spectrophotometer (Shimadzu，Kyoto，Japan)；PCR擴(kuò)增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動凝膠成像系統(tǒng)，AlphaImager HP；電轉(zhuǎn)儀MicroPulser；臺式高速離心機(jī)，Eppendorf 5415D；高速冷凍離心機(jī)，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色譜，Agilent Technologies Series 1200。實(shí)時定量PCR儀，CFX connectTMReal-Time system(Bio-Rad，Hercules，USA)。

1.1.3 菌株和質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒見表1。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化鈉；氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素終濃度分別為100、34、50 μg/mL。LB固體培養(yǎng)基含1.5%的瓊脂。

LB+2%甘油培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g氯化鈉和20 mL甘油。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

無鹽蔗糖培養(yǎng)基：1 L培養(yǎng)基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g蔗糖。無鹽蔗糖固體培養(yǎng)基含1.5%的瓊脂。

1.2.2 β-胡蘿卜素產(chǎn)量和甘油殘留量的檢測方法

保存于?80 ℃ 的菌種在LB平板上劃線活化，挑取單菌落接種到15 mm×100 mm試管 (含4 mL LB培養(yǎng)基) 中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h，1%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL三角瓶 (含10 mL LB+2%甘油培養(yǎng)基) 中，30 ℃、250 r/min 培養(yǎng)24 h。收集菌液用于測定β-胡蘿卜素含量。

測定β-胡蘿卜素產(chǎn)量時，先取500 μL待測菌液，13 000 r/min 離心5 min，無菌水清洗后，用1 mL 丙酮懸浮沉淀，在55 ℃ 黑暗條件下萃取15 min，然后將樣品在14 000 r/min 下離心10 min，含有β-胡蘿卜素的上清過濾后用于測定β-胡蘿卜素產(chǎn)量。用高效液相色譜測定β-胡蘿卜素的濃度[24]。檢測條件：VWD 檢測器，Symmetry C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇∶乙腈∶二氯甲烷(21∶21∶8)，流速1.0 mL/min，時間25 min，柱溫30 ℃，檢測波長450 nm。每個待測樣品分別有3個平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取自3個平行的平均值。用購自Sigma公司的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對于甘油殘留量的測定，取1 mL稀釋10倍的菌液，13 000 r/min 離心5 min，上清液經(jīng)濾膜過濾后用于測定甘油殘留量。用高效液相色譜測定甘油的濃度[24]。檢測條件：VWD檢測器，HPX-87H色譜柱，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，時間30 min，柱溫35 ℃[25]。每個待測樣品分別有3個平行樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取自3個平行的平均值。

1.2.3 一步同源重組調(diào)控基因

目前往往通過質(zhì)粒高表達(dá)外源或內(nèi)源基因，質(zhì)粒表達(dá)基因可以引起質(zhì)粒不穩(wěn)定、代謝負(fù)荷等弊端[26-27]；同時大腸桿菌具有多個基因在同一個操縱子下調(diào)控的現(xiàn)象，要高表達(dá)同一操縱子下多個基因，必然需要構(gòu)建較大質(zhì)粒，構(gòu)建質(zhì)粒難度更大、質(zhì)粒穩(wěn)定性更低。染色體上直接用高強(qiáng)度啟動子調(diào)控基因，避免克隆大片段基因，提高改造效率[11]。另外菌株改造時，有時候需要降低某些基因的轉(zhuǎn)錄水平。本研究在染色體上可以通過一步同源重組和兩步同源重組的方法對基因進(jìn)行調(diào)控。一步同源重組調(diào)控可以快速找出多個基因中的限速步驟[28]。兩步同源重組方法在染色體上直接對基因進(jìn)行調(diào)控，可以進(jìn)行無痕操作，減少殘留條帶對后續(xù)操作的影響[11-22]；采用一步同源重組的方法，用3個不同強(qiáng)度的啟動子M1-37、M1-46、M1-93對甘油代謝途徑的3個基因glpD、glpFK、tpiA分別進(jìn)行單基因調(diào)控。相對于大腸桿菌中誘導(dǎo)后lacZ啟動子，調(diào)控元件M1-46、M1-37和M1-93的強(qiáng)度分別是它的1.7、2.5 和5倍[11-21]。用一對引物gene-FRT-up/gene-RBS-down來擴(kuò)增用于轉(zhuǎn)化的條帶。對于glpD基因，使用glpD-FRT-up/glpD-RBS-down引物 (表2)，分別以M1-37、M1-46和M1-93的基因組DNA為模板擴(kuò)增DNA片段，將片段電轉(zhuǎn)入含有pKD46的菌株Gly001的感受態(tài)細(xì)胞中，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板中過夜培養(yǎng)，挑選單克隆，用引物Kan-F/glpD-373-I-r進(jìn)行PCR驗(yàn)證(表2)[21-28]。驗(yàn)證正確的克隆。采用同樣的方法調(diào)控glpFK和tpiA基因，所用引物序列在表2中列出。

1.2.4 兩步同源重組調(diào)控或敲除基因

兩步同源重組敲除或調(diào)控基因，在改造位點(diǎn)不留任何不必要的序列，有利于進(jìn)行后續(xù)工程改造。用兩步同源重組的方法調(diào)控或敲除基因包括以下步驟，第一步同源重組，在將要敲除或調(diào)控基因位點(diǎn)插入一個catsacB基因片段；第二步同源重組中，將帶有敲除位點(diǎn)兩端同源臂的片段替換catsacB基因片段，完成敲除或調(diào)控。兩步同源重組敲除基因流程如圖2所示。首先，用電轉(zhuǎn)到已經(jīng)轉(zhuǎn)化了pKD46的CAR015感受態(tài)細(xì)胞中，用glpR-catsacB基因片段替換glpR基因，用引物cat-up/glpR-300-O-R來驗(yàn)證成功轉(zhuǎn)化的菌，glpR-catsacB基因片段是以pXZ-CZ質(zhì)粒為模板[22]，用引物glpR-cat-up/glpR-cat-down (表2) 擴(kuò)增得到 (圖2A)。第二步同源重組，glpR-catsacB基因片段被glpR-Deletion DNA片段取代，glpR-Deletion是以大腸桿菌ATCC 8739的基因組為模板，用引物glpR-D-up/glpR-300-O-R擴(kuò)增得到，其中g(shù)lpR-D-up引物包含glpR基因ATG前50 bp同源臂序列和20 bp與glpR基因TAA后20 bp同源序列，glpR-300-O-R為位于glpR基因后300 bp位置的一段反向互補(bǔ)序列，PCR擴(kuò)增得到的第二步同源重組片段分別含glpR上游50 bp同源臂和下游300 bp同源臂序列。經(jīng)第二步同源重組，可敲除掉glpR基因 (圖2B)。第二步重組正確菌株在含有蔗糖的無鹽LB培養(yǎng)基富集。在蔗糖存在的情況下，表達(dá)sacB基因的菌株因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過程中積累果聚糖對細(xì)胞產(chǎn)生毒性而被殺死。cat-sacB基因簇被替換掉的細(xì)胞被初步富集[11,28-29]。隨后，挑單菌落分別在LB和氯霉素平板上進(jìn)行抗性篩選，挑選LB上生長而氯霉素上不生長的菌，用引物glpR-400-O-F/glpR-300-O-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將敲除glpR的菌命名為Gly001。

[11]所述方法兩步同源重組調(diào)控基因glpF、glpD和tpiA。所用引物見表2，構(gòu)建菌株及所用質(zhì)粒見表1。

圖2 基因敲除流程圖 (A：第一步同源重組；B：第二步同源重組)Fig. 2 Modulation of gene deletion by the two-step recombination method. (A) The first recombination step. (B) The second recombination step.

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this work

續(xù)表2

1.2.5 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平測定

為了確定人工調(diào)控元件調(diào)控相應(yīng)基因后轉(zhuǎn)錄水平，我們用實(shí)時定量PCR (Q-PCR) 的方法，測定調(diào)控前后基因轉(zhuǎn)錄水平的改變。將待測菌取單菌落接種于含3 mL LB的試管中，培養(yǎng)過夜，以1%的接種量轉(zhuǎn)接，30 ℃培養(yǎng)5 h后，按照RNA提取試劑盒要求收集一定菌體，液氮速凍后，RNA提取試劑盒提取RNA，并用DNase I去除污染的DNA，用RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit準(zhǔn)備cDNA，用Q-PCR儀進(jìn)行Q-PCR。16S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計算基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。Q-PCR引物見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1glpR基因的敲除

GlpR是三磷酸甘油的阻遏蛋白，在葡萄糖存在下對大腸桿菌的甘油代謝起阻遏作用[30-33]。因此，本研究首先敲除編碼GlpR的基因glpR，防止GlpR對甘油代謝的阻抑作用，同時，為重組工程菌共代謝葡萄糖和甘油做準(zhǔn)備。

本研究用兩步同源重組的方法，敲除出發(fā)菌株CAR015中的glpR，特異引物驗(yàn)證陽性克隆 (圖3)。

結(jié)果如圖3所示，用引物glpR-400-O-F/ glpR-300-O-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，出發(fā)菌株CAR015為模板，擴(kuò)增出1 500 bp條帶，而敲除glpR后，用同樣引物擴(kuò)增，得到約700 bp條帶，因此敲除成功，獲得菌株命名為Gly001。

發(fā)酵Gly001，發(fā)現(xiàn)敲除glpR后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量比CAR015降低約8%，生長基本不受影響 (圖4)，可以作為出發(fā)菌株，調(diào)控甘油代謝途徑各基因。

2.2 調(diào)控甘油代謝途徑基因?qū)Ζ?胡蘿卜素產(chǎn)量影響

采用一步同源重組方法，用M1-37、M1-46和M1-93號人工調(diào)控元件調(diào)控甘油代謝途徑中的glpFK、glpD和tpiA基因。

結(jié)果表明，M1-37、M1-46和M1-93調(diào)控glpFK基因后，生長分別為Gly001的0.96、0.76和0.57倍，β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別為Gly001的0.96、0.76和0.54倍，甘油消耗分別為CAR015的1.16、1.13和1.12倍，說明3個固定強(qiáng)度調(diào)控glpFK后，對細(xì)胞生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量都有一定抑制作用。TpiA調(diào)控后，生長基本不受影響(圖4A)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量略高于Gly001，分別比Gly001提高了29%、24%和17%，說明，改變tpiA的強(qiáng)度可以提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量。

M1-37和M1-93調(diào)控glpD基因后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別降低了8%和19%，而生長基本沒有影響 (圖4)，但是，用M1-46號人工調(diào)控元件調(diào)控glpD后，生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量明顯升高，β-胡蘿卜素產(chǎn)量和產(chǎn)率分別達(dá)64.82 mg/L和16.44 mg/g DCW，分別為CAR015的4.86倍和2.64倍。OD600達(dá)12.19，為CAR015的1.84倍，說明適當(dāng)強(qiáng)度的人工調(diào)控元件調(diào)控glpD，可以有效提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量。

2.3 兩基因組合調(diào)控提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量

因?yàn)镸1-46調(diào)控glpD后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量明顯提高，所以從glpD調(diào)控菌株出發(fā)，分別與glpFK和tpiA組合調(diào)控，觀察兩基因組合調(diào)控后，對細(xì)胞生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。

為了便于對基因組合調(diào)控，都用兩步同源重組的方法調(diào)控各基因。首先從Gly001出發(fā)，兩步法用M1-46號啟動子調(diào)控glpD基因，得到測序正確菌株，命名為Gly002。Gly002和glpD-M1-46相比，兩者都為M1-46調(diào)控，但是在glpD-M1-46的啟動子前面有一個FRT-Km-FRT片段，從β-胡蘿卜素產(chǎn)量來看，Gly002產(chǎn)量為68.9 mg/L，略高于glpD-M1-46 (產(chǎn)量為64.82 mg/L) (圖5)。

從Gly002出發(fā)，用M1-37、M1-46和M1-93人工調(diào)控元件分別調(diào)控glpFK和tpiA基因，觀察兩基因組合調(diào)控對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。

圖4 單基因調(diào)控后菌株β-胡蘿卜素產(chǎn)量及生長Fig. 4 β-carotene production and cell growth after modulating single gene.

圖5 雙基因調(diào)控后菌株β-胡蘿卜素產(chǎn)量及生長Fig. 5 β-carotene production and cell gowth after modulating double genes.

結(jié)果表明，單獨(dú)調(diào)控tpiA基因時，M1-37號調(diào)控后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高 (圖4)。在Gly002基礎(chǔ)上調(diào)控tpiA時，M1-37號調(diào)控后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量反而更低，說明同樣的調(diào)控元件，在不同菌株中，對目標(biāo)產(chǎn)物的影響不同。GlpFK調(diào)控后，產(chǎn)量沒有提高，反而下降，分別比出發(fā)菌株Gly002降低8%、13%和17%。雙基因組合調(diào)控得到β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高菌株為Gly002，tpiA-M1-46，產(chǎn)量達(dá)72.45 mg/L，比Gly002提高了8%，命名為Gly003。

2.4 調(diào)控對轉(zhuǎn)錄水平的影響

M1-37和M1-93調(diào)控glpD后，β-胡蘿卜素產(chǎn)量有一定降低，而生長基本沒有影響 (圖4)，但是，用M1-46號人工調(diào)控元件調(diào)控glpD后，生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量明顯升高。glpFK和tpiA調(diào)控后，對細(xì)胞生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量也有一定影響。本文所用的3個不同強(qiáng)度的啟動子是組成型啟動子，對不同基因可能啟動強(qiáng)度不同；另外，所調(diào)控基因在細(xì)胞中原始轉(zhuǎn)錄水平不同，調(diào)控后相對轉(zhuǎn)錄水平是升高還是降低，結(jié)果必定不同。為了研究對基因調(diào)控后，轉(zhuǎn)錄水平與生長及β-胡蘿卜素產(chǎn)量的關(guān)系，本文用Q-PCR方法，測定了基因調(diào)控菌株中，相對應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平的改變。本文以出發(fā)菌株Gly001中相對應(yīng)的基因?yàn)?，來計算改造后基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。

圖6 調(diào)控對轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig. 6 Relative expression level ofglpF,glpK,glpDandtpiAafter modulated by M1-37, M1-46 and M1-93.

由圖6可知，從Gly001出發(fā)單獨(dú)調(diào)控glpFK，M1-37、M1-46和M1-93調(diào)控使glpF和glpK轉(zhuǎn)錄水平依次升高 (圖6)。調(diào)控后glpF基因的轉(zhuǎn)錄水平都低于對照的轉(zhuǎn)錄水平，但是，只有M1-37調(diào)控使glpK的轉(zhuǎn)錄水平低于對照，是對照的0.6倍，M1-46和M1-93調(diào)控都使glpK轉(zhuǎn)錄水平高于對照，分別是對照的1.2和4.6倍，因此，目前glpFK的轉(zhuǎn)錄水平依然高，推測進(jìn)一步降低glpFK的轉(zhuǎn)錄水平可以提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量，增加細(xì)胞生長速度，建議進(jìn)一步用調(diào)控元件文庫調(diào)控glpFK基因，以實(shí)現(xiàn)提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量，增加細(xì)胞生長速度的目的。

M1-37和M1-93調(diào)控使glpD轉(zhuǎn)錄水平升高，分別是對照的1.75和5.28倍 (圖6)，M1-46調(diào)控使glpD轉(zhuǎn)錄水平降低了68%，調(diào)控菌株glpD-M1-46細(xì)胞生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量明顯提高，說明glpD轉(zhuǎn)錄水平降低，有利于細(xì)胞生長及β-胡蘿卜素合成。

M1-37、M1-46和M1-93調(diào)控使tpiA轉(zhuǎn)錄水平依次升高，分別是對照的1.78、2.72和5.63倍 (圖6)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量都有一定提高(圖4)，說明提高tpiA的強(qiáng)度可以提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量。

甘油代謝包括有氧代謝和厭氧代謝兩條途徑。改造甘油厭氧代謝途徑基因集中在提高乙醇、乳酸等產(chǎn)物生成[17-34]；Mazumdar 等在微氧條件下過表達(dá)甘油有氧代謝中的glpK和glpD加速了甘油利用，提高了L-乳酸和D-乳酸的產(chǎn)量[18-35]。Applebee 在進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化研究時發(fā)現(xiàn)，降低glpK轉(zhuǎn)錄水平，可以減少丙酮醛(Methyglyoxal) 積累，降低細(xì)胞毒性，有利于細(xì)胞生長[36]。本研究發(fā)現(xiàn)在有氧條件下，催化甘油轉(zhuǎn)化成DHAP的glpFK和glpD轉(zhuǎn)錄水平降低，有利于細(xì)胞生長和β-胡蘿卜素合成，而分解DHAP的tpiA轉(zhuǎn)錄水平提高有利于細(xì)胞生長和β-胡蘿卜素產(chǎn)量。丙酮醛主要來自甘油代謝途徑的DHAP，經(jīng)丙酮醛合成酶催化形成。本研究中降低glpFK和glpD轉(zhuǎn)錄水平，可以通過減少DHAP合成，進(jìn)而減少丙酮醛積累，從而加快細(xì)胞生長和提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量。

3 結(jié)論

本研究在高產(chǎn)β-胡蘿卜素的重組大腸桿菌CAR015基礎(chǔ)上，通過用不同強(qiáng)度的人工調(diào)控元件調(diào)控甘油代謝途徑的glpFK、glpD和tpiA基因，系統(tǒng)研究了甘油代謝途徑各基因轉(zhuǎn)錄水平對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，降低glpD基因的轉(zhuǎn)錄水平可以顯著提高重組大腸桿菌的生長速度和β-胡蘿卜素產(chǎn)量；glpFK基因的轉(zhuǎn)錄水平與β-胡蘿卜素合成能力呈反比，本研究所用固定強(qiáng)度啟動子調(diào)控glpFK都不能使β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高，需要強(qiáng)度更低的調(diào)控元件調(diào)控glpFK基因，以期提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量。提高tpiA的轉(zhuǎn)錄水平可以適當(dāng)增加β-胡蘿卜素的產(chǎn)量；組合調(diào)控glpD和tpiA基因后，得到產(chǎn)量最高菌株Gly003，小搖瓶發(fā)酵24 h，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)72.45 mg/L、產(chǎn)率達(dá)18.65 mg/g DCW，是高產(chǎn)β-胡蘿卜素重組大腸桿菌CAR015的5.23倍和1.99倍。研究結(jié)果表明，適當(dāng)程度表達(dá)甘油代謝途徑的glpD和tpiA基因，可以有效提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量及細(xì)胞生長速度，這個策略可以用于大腸桿菌生產(chǎn)其他萜烯類化合物。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Improving β-carotene production inEscherichia coliby metabolic engineering of glycerol utilization pathway

Yue Dong1,2＊, Kunle Hu3＊, Xinglin Li1, Qingyan Li2, and Xueli Zhang2
1College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin300457,China
2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences,Tianjin300308,China
3College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Techology,Luoyang471023,Henan,China

Glycerol is a byproduct during biodiesel production. It is an important feedstock for fermentation due to its low price and high reduced status. Multiple genes of the glycerol utilization pathway were modulated in a previously engineered high β-carotene producingEscherichia colistrain CAR015 to enhance glycerol utilization capability for improving isoprenoids production. TheglpRgene, encoding glycerol 3-phosphate repressor, was firstly deleted. TheglpFK,glpDandtpiAgenes were then modulated by three artificial regulatory parts, M1-37, M1-46 and M1-93, respectively. β-carotene titer reached 64.82 mg/L after modulatingglpDwith M1-46, which was 4.86 times higher than that of CAR015, and glycerol consumption rate also increased 100%. ModulatingtpiAled to a little increase of β-carotene titer, whereas modulatingglpFKled to a little decrease of β-carotene titer. This demonstrated that GlpD was a rate-limiting step in glycerol utilization pathway. Q-PCR ofglpF,glpK,glpD andtpiAresults showed that decrease the transcription level ofglpF,glpK,glpD, or decrease the transcription level oftpiAcould increase the cell growth and β-carotene production, probably for the decrease of methylglyoxal toxicity. ModulatingglpDandtpiAgenes in combination resulted in the best strain Gly003, which produced 72.45 mg/L β-carotene with a yield of 18.65 mg/g dry cell weight. The titer was 5.23 and yield 1.99 times of that of the parent strain CAR015. Our work suggested that appropriate activation ofglpDandtpiAgenes in glycerol utilization pathway could effectively improve β-carotene production. This strategy can be used for production of other terpenoids inE. coli.

β-carotene, terpenoids, glycerol metabolism,Escherichia coli

s:Xinglin Li. Tel/Fax: 86-22-60601329; Email: lxlszf@tust.edu.cn

Received:July 22, 2016;Accepted:December 6, 2016

Supported by:Natural Science Foundation of Tianjin (No. 15JCYBJC49400), Tianjin Key Technology R&D Program of Tianjin Municipal Science and Technology Commission (No. 12ZCZDSY14700).

Qingyan Li. Tel/Fax: 86-22-84861946; Email: li_qy@tib.cas.cn

*These authors contributed equally to this work.

天津市自然科學(xué)基金 (No. 15JCYBJC49400)，天津市科技支撐計劃重點(diǎn)項目 (No. 12ZCZDSY14700) 資助。

時間：2016-12-27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20161227.1416.001.html