朱秀蘭，易艷紅，唐婷，張春暉，劉風(fēng)華*

(1.廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科，廣州 510000；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，深圳 518000)

Synaptotagmin1影響小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和皮質(zhì)反應(yīng)的研究

朱秀蘭1，易艷紅1，唐婷1，張春暉2，劉風(fēng)華1*

(1.廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科，廣州 510000；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，深圳 518000)

目的 探討Synaptotagmin1(Syt1)對(duì)小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程和皮質(zhì)反應(yīng)的影響。 方法 免疫印跡檢測(cè)Syt1在小鼠卵母細(xì)胞的表達(dá)；免疫熒光分析Syt1在卵母細(xì)胞中定位以及對(duì)減數(shù)分裂過(guò)程的影響；活細(xì)胞實(shí)時(shí)拍攝系統(tǒng)觀察皮質(zhì)反應(yīng)以及紡錘體、染色體在降調(diào)Syt1表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。 結(jié)果 (1)Syt1和小鼠卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒完全共定位；(2)降調(diào)Syt1表達(dá)，小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程受到阻礙；(3)活細(xì)胞實(shí)時(shí)拍攝系統(tǒng)證實(shí)了降調(diào)Syt1會(huì)影響中后期轉(zhuǎn)換、第一極體釋放以及進(jìn)一步的皮質(zhì)反應(yīng)。 結(jié)論 Syt1參與調(diào)控卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂的成熟過(guò)程和皮質(zhì)反應(yīng)的發(fā)生。

Synaptotagmin1； 減數(shù)分裂； 皮質(zhì)反應(yīng)； 卵母細(xì)胞

(JReprodMed2017，26(2)：163-167)

Synaptotagmin1(Syt1)是一種神經(jīng)突觸囊泡蛋白，用于調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，近來(lái)被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元樹突和軸突的分化中也有重要的作用[1-3]。目前為止，Syt1在生殖細(xì)胞中的功能研究較少。本文通過(guò)Syt1特定寡核苷酸序列(morpholino，MO)降調(diào)小鼠卵母細(xì)胞Syt1的表達(dá)，深入系統(tǒng)地研究了Syt1在小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程和孤雌激活后的表達(dá)和作用；用活細(xì)胞工作站成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)Syt1參與了小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的成熟過(guò)程和皮質(zhì)反應(yīng)的發(fā)生。

資料與方法

一、研究對(duì)象及試劑

1.研究對(duì)象：4～6周齡ICR品系雌性小鼠(購(gòu)自北京維通利華，SPF級(jí)，SCXK京，2012-0001)。

2.主要試劑：兔抗Syt1抗體(Abcam，英國(guó))；TMA-DPH探針(Molecular Probes，美國(guó))；CY5標(biāo)記的羊抗兔IgG(Jackson，美國(guó))；FITC-LCA，M2/M16培養(yǎng)液及其他化學(xué)用品來(lái)自美國(guó)Sigma公司。

3.主要儀器：激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 510 META，德國(guó)蔡斯)；活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)(Perkin Elmer precisely Ultra VIEW VOX，Perkin Elmer，美國(guó))。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.卵母細(xì)胞的收集和培養(yǎng)：斷頸法快速處死小鼠后取出卵巢，將卵巢切碎于一次性培養(yǎng)皿中，收集GV期卵母細(xì)胞置于M2培養(yǎng)滴中，清洗5～6次后，移至覆蓋有礦物油的M16培養(yǎng)滴或者含有2.5 μM米力農(nóng)(深圳思科達(dá)生物公司，深圳)的M2培養(yǎng)滴，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5% CO2，95%濕度)。培養(yǎng)到不同時(shí)期后取出用于免疫印跡、免疫熒光、激光共聚焦掃描顯微鏡及其活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察。

2.MO和β5-tubulin-GFP mRNA、H2B-RFP mRNA聯(lián)合注射：MO是經(jīng)過(guò)修飾的人工合成反義寡核苷酸鏈小分子。本實(shí)驗(yàn)所用的MO購(gòu)自美國(guó)GENE TOOLS 公司。Syt1-MO序列信息如下：5'-GACTGGCACTCACCATTTTTGGTTC-3'；對(duì)照MO序列信息如下：5'-CCTCTTACCTCAgTTACAATTT ATA-3'。用Sigma水稀釋，工作濃度為4 mM。通過(guò)注射5～10 pL的4 mM MO或者和同體積的β5-tubulin-GFP mRNA(紡錘體)和H2B-RFP mRNA(染色體)的混和物。然后卵母細(xì)胞在含2.5 μM米力農(nóng)的M2培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。新鮮M2培養(yǎng)液中洗5遍，置于新鮮M16培養(yǎng)液培養(yǎng)約2～3 h，然后放置活細(xì)胞工作站繼續(xù)培養(yǎng)14～15 h左右，并實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察其變化。注射過(guò)程中GV期卵母細(xì)胞均置于含有2.5 μM米力農(nóng)的M2培養(yǎng)液中，30 mins內(nèi)完成操作。

3.卵母細(xì)胞的活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)：向GV期卵母細(xì)胞中注射上述Syt1或?qū)φ誐O和mRNA的混合物用于追蹤紡錘體、染色體在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。經(jīng)注射的卵母細(xì)胞培養(yǎng)至GVBD(約4～5 h)后放置Perkin Elmer precisely Ultra VIEW VOX 活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)，繼續(xù)培養(yǎng)14～15 h左右，使用窄帶通濾波器和一個(gè)綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白30%的削減中性密度日色度過(guò)濾器，根據(jù)tubulin-GFP和H2B-RFP的熒光強(qiáng)度，曝光時(shí)間在300毫秒到800毫秒之間，用IP Lab(Scanalytics) 或 AQM6(Andor/Kinetic-imaging)的軟件系統(tǒng)支持?jǐn)?shù)字化的延時(shí)成像技術(shù)。

4.孤雌激活和皮質(zhì)反應(yīng)的觀察：為明確Syt1對(duì)小鼠卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒發(fā)生皮質(zhì)反應(yīng)的影響，首先收集正常培養(yǎng)的MⅡ期成熟卵母細(xì)胞，臺(tái)氏酸去除透明帶，放置在現(xiàn)配現(xiàn)用的SrCl2-CZB培養(yǎng)液(10 mM)中進(jìn)行孤雌激活，收集激活后不同時(shí)間點(diǎn)的受精卵用免疫印跡法檢測(cè)Syt1的表達(dá)水平。其次用活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察降調(diào)Syt1的表達(dá)對(duì)卵母細(xì)胞SrCl2孤雌激活后的皮質(zhì)反應(yīng)是否有影響。向GV期卵母細(xì)胞中注射Syt1-MO或者對(duì)照MO，每個(gè)卵母細(xì)胞大約注射10 pL。經(jīng)注射的卵母細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h。收集Syt1降調(diào)后仍有第一極體釋放和對(duì)照組的MⅡ卵母細(xì)胞，同上方法進(jìn)行孤雌激活，同時(shí)用TMA-DPH探針標(biāo)記皮質(zhì)顆粒。然后放置Perkin Elmer precisely Ultra VIEW VOX活細(xì)胞共聚焦成像系統(tǒng)觀察。

三、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、Syt1和皮質(zhì)顆粒在小鼠卵母細(xì)胞中的共定位和表達(dá)

體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞0 h、8 h和12 h分別對(duì)應(yīng)GV、MⅠ和MⅡ期，用免疫印跡法半定量檢測(cè)其表達(dá)水平，結(jié)果顯示：在小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有Syt1的表達(dá)(圖1A)。免疫熒光檢測(cè)Syt1和皮質(zhì)顆粒的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示Syt1和皮質(zhì)顆粒兩者完全共定位，主要分布在皮質(zhì)區(qū)，MⅠ期，染色體靠近的1/3皮質(zhì)區(qū)域沒(méi)有表達(dá)(圖1B)。

二、降調(diào)Syt1對(duì)小鼠卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂前中期/中期阻滯及極體排出率的影響

使用Syt1特異性反義寡核苷酸MO注射，結(jié)果顯示Syt1-MO顯著降調(diào)了Syt1的表達(dá)(圖2A)。經(jīng)注射的GV期卵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到M16培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)10 h或者12 h，10 h收集AI期卵母細(xì)胞，Syt1-MO注射組Pro-MⅠ/MⅠ阻滯率為91.80 %(n=49)，較對(duì)照MO注射組31.48%(n=54)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)(表1)；12 h收集的卵母細(xì)胞中，Syt1-MO注射組極體排出率(45.33%，n=154)與對(duì)照組(60.76 %，n=161)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)(表2)。

GV：生發(fā)泡期卵母細(xì)胞，MⅠ：第一次減數(shù)分裂中期卵母細(xì)胞，MⅡ：第二次減數(shù)分裂中期卵母細(xì)胞；CGs：皮質(zhì)顆粒。圖1 Syt1和皮質(zhì)顆粒在小鼠卵母細(xì)胞中的共定位和表達(dá)。1A：小鼠卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)GV、MⅠ、MⅡ時(shí)期Syt1的表達(dá)，Syt1和標(biāo)準(zhǔn)量β-actin的分子量分別為47 kDa 和42 kDa；1B：Syt1和皮質(zhì)顆粒的亞細(xì)胞定位，Syt1(粉紅色)，CGs(綠色)，DNA(紅色)，merge(sytl+CGs+DNA)。

組別無(wú)Pro-MⅠ/MⅠ阻滯有Pro-MⅠ/MⅠ阻滯Syt1-MO組4/49(8.20)*45/49(91.80)*對(duì)照MO組37/54(68.52)17/54(31.48)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.001

表2 Syt1-MO組與對(duì)照組極體排出率的比較[n(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.005

三、降調(diào)Syt1對(duì)小鼠卵母細(xì)胞染色體分離和第一次減數(shù)分裂過(guò)程的影響

向卵母細(xì)胞內(nèi)注射了β5-tubulin-GFP mRNA、H2B-RFP mRNA和Syt1-MO或?qū)φ?MO的混合物，并應(yīng)用活細(xì)胞工作站延時(shí)拍攝系統(tǒng)去捕捉紡錘體和染色體的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，對(duì)照組中約GVBD后2 h開始形成紡錘體，之后完整的雙極紡錘體逐漸移至皮質(zhì)區(qū)，接著中后期轉(zhuǎn)換完成，約觀察7 h發(fā)現(xiàn)第一極體(圖2B)。共觀察約40個(gè)對(duì)照組卵母細(xì)胞，幾乎所有細(xì)胞在不同的減數(shù)分裂時(shí)期均呈現(xiàn)出對(duì)應(yīng)各時(shí)期的正常形態(tài)紡錘體和排列正常的染色體，大部分均能完成第一極體釋放。然而，在Syt1-MO注射組卵母細(xì)胞出現(xiàn)各種形態(tài)異常的紡錘體，染色體不能正確分離，染色體和紡錘體均出現(xiàn)紊亂分散在胞內(nèi)，且部分染色體脫離紡錘體，接著出現(xiàn)異常的紡錘體和染色體重新聚合又分離現(xiàn)象，直至最后仍無(wú)第一極體出現(xiàn)(圖2C)。大部分卵母細(xì)胞均出現(xiàn)類似上述現(xiàn)象，只有少數(shù)卵母細(xì)胞出現(xiàn)第一極體釋放。

圖2 降調(diào)Syt1對(duì)染色體分離及第一次減數(shù)分裂過(guò)程和極體釋放的影響。2A：免疫印跡驗(yàn)證降調(diào)Syt1的表達(dá)；2B：對(duì)照MO組卵母細(xì)胞紡錘體和染色體的動(dòng)態(tài)變化；2C：Syt1-MO組卵母細(xì)胞紡錘體和染色體的動(dòng)態(tài)變化。Tubulin(綠色)；DNA(紅色).

四、小鼠卵母細(xì)胞孤雌激活后Syt1的蛋白表達(dá)

體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞12 h對(duì)應(yīng)MⅡ期成熟卵母細(xì)胞，觀察SrCl2孤雌激活后30 min、1 h、2 h、8 h、12 h和24 h的Syt1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：孤雌激活后30 min和1 h時(shí)表達(dá)量最少，之后隨著受精卵的形成表達(dá)逐漸增加(圖3)。

圖3 Syt1在SrCl2孤雌激活后的表達(dá)：Syt1和標(biāo)準(zhǔn)量GADPH的分子量分別為47 kDa和36 kDa

五、降調(diào)Syt1的表達(dá)對(duì)卵母細(xì)胞皮質(zhì)反應(yīng)的發(fā)生影響

用活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察降調(diào)Syt1的表達(dá)對(duì)卵母細(xì)胞SrCl2孤雌激活后的皮質(zhì)反應(yīng)是否有影響，觀察TMA-DPH熒光強(qiáng)度的變化，計(jì)算熒光強(qiáng)度快速增強(qiáng)時(shí)變化的時(shí)間，結(jié)果顯示:Syt1-MO注射組時(shí)間為(10.80±2.47)s(n=10)，較對(duì)照MO注射組(4.61±1.40)s(n=15)顯著延長(zhǎng)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表3)。

組別Mean±SD(s)t值P對(duì)照MO組4.61±1.40Syt1-MO組10.80±2.474.20.01

討 論

Syt1是神經(jīng)突觸囊泡蛋白，與神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞中鈣離子結(jié)合引起神經(jīng)遞質(zhì)和內(nèi)分泌細(xì)胞顆粒釋放進(jìn)一步引起相應(yīng)的生物學(xué)行為甚至導(dǎo)致疾病的發(fā)生[4-6]。本研究我們對(duì)Syt1在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過(guò)程和皮質(zhì)反應(yīng)的新功能進(jìn)行了探討。MO廣泛應(yīng)用于降調(diào)特定基因的表達(dá)，比如，MO降調(diào)SGK1基因會(huì)改變成年鳉魚中囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)的表達(dá)從而改變其生存環(huán)境[7]。紡錘體檢點(diǎn)蛋白阻止后期促進(jìn)因子復(fù)合物(APC)的活性直至所有著絲粒全部連接到紡錘體上，卵母細(xì)胞分裂后期才開始啟動(dòng)[8]，近來(lái)也不斷發(fā)現(xiàn)新的蛋白分子參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程的調(diào)節(jié)[9-10]。紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白Bub3突變會(huì)阻礙SAC激酶Bub1的著絲粒募集，提示其是在減數(shù)分裂信號(hào)通路中所必須[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Syt1在小鼠卵母細(xì)胞中和皮質(zhì)顆粒完全共定位。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用MO方法降調(diào)Syt1的表達(dá)，結(jié)果顯示：卵母細(xì)胞發(fā)育阻滯在Pro-MⅠ/MⅠ階段、第一極體釋放和皮質(zhì)反應(yīng)受阻。

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟過(guò)程經(jīng)歷兩個(gè)重要的調(diào)節(jié)階段：第一次減數(shù)分裂前中期和第一次減數(shù)分裂中期的調(diào)控。正確的染色體分離過(guò)程受多重嚴(yán)密的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，否則會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟障礙、胚胎非整倍體發(fā)生甚至?xí)M(jìn)一步影響到子代健康[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是Syt1降調(diào)的卵母細(xì)胞在分裂進(jìn)程中阻滯在Pro-MⅠ/MⅠ時(shí)期。活細(xì)胞成像系統(tǒng)結(jié)果表明Syt1-MO組卵母細(xì)胞紡錘體異常；染色體分離失敗，部分染色體脫離微管；而且極體釋放受阻；研究結(jié)果提示，Syt1很可能參與了小鼠卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的中后期轉(zhuǎn)換環(huán)節(jié)。

卵母細(xì)胞中存在有皮質(zhì)顆粒，當(dāng)其受精或者孤雌激活時(shí)會(huì)引起皮質(zhì)顆粒和胞膜的融合，發(fā)生皮質(zhì)反應(yīng)，即皮質(zhì)顆粒的胞吐作用。皮質(zhì)反應(yīng)是卵母細(xì)胞受精過(guò)程的初始事件，是阻止多精受精重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)后續(xù)胚胎正常受精及其妊娠是重要的基礎(chǔ)[14]。皮質(zhì)反應(yīng)的具體機(jī)制尚不是很清晰，Bello等[15]最近發(fā)現(xiàn)作為GTP結(jié)合蛋白亞族成員的Rab3A蛋白，可能參與到小鼠卵母細(xì)胞的皮質(zhì)反應(yīng)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Syt1與皮質(zhì)顆粒完全共定位，Syt1在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用。雖然Syt1降調(diào)后對(duì)第一極體釋放有阻礙，但是仍有部分卵母細(xì)胞在Syt1降調(diào)后有極體釋放，所以選擇Syt1降調(diào)后形態(tài)學(xué)上觀察有極體釋放的MⅡ卵母細(xì)胞，用活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察降調(diào)Syt1的表達(dá)對(duì)卵母細(xì)胞SrCl2孤雌激活后的皮質(zhì)反應(yīng)是否有影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Syt1降調(diào)后影響了皮質(zhì)反應(yīng)的發(fā)生，孤雌激活后30 min和1 h Syt1的表達(dá)量很少，之后隨著受精卵的形成Syt1表達(dá)也逐漸增多，這個(gè)變化與皮質(zhì)顆粒發(fā)生皮質(zhì)反應(yīng)的過(guò)程也相符合，推測(cè)Syt1很可能參與到小鼠卵母細(xì)胞的皮質(zhì)反應(yīng)過(guò)程。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Syt1作為神經(jīng)突觸囊泡蛋白分子，在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過(guò)程、第一極體釋放和皮質(zhì)反應(yīng)方面發(fā)揮著重要的功能。

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[編輯：辛玲]

Synaptotagmin 1 affects meiosis and cortical reaction in mouse oocytes

ZHUXiu-lan1，YIYan-hong1，TANGTing1，ZHANGChun-hui2，LIUFeng-hua1*

1.DepartmentofReproductiveHealthandInfertility，MaternalandChildHealthHospitalofGuangdongProvince，GuangzhouMedicalUniversity，Guangdong510000 2.DepartmentofReproductiveMedicinePekingUniversityShenzhenHospital，MedicalCenterofPekingUniversity，Guangdong518000

Objective：To identify the effect of Synaptotagmin 1(Syt1) on meiosis and cortical reaction in mouse oocyte.Methods：Syt1 expression was determined by immunoblotting analysis.The localization of Syt1 in oocytes and the effect on meiosis processes were analyzed by immunofluorescence.Cortical reaction and the dynamics of microtubule and chromosome were filmed with Perkin Elmer precisely Ulta VIEW VOX Confocal Imaging System.Results：Syt1 expression was localized at the same position as cortical granules(CGs) in mouse oocyte.Down-regulation of Syt1 expression interrupted the meiotic process in mouse oocyte.The results of Perkin Elmer precisely Ulta VIEW VOX Confocal Imaging System confirmed that down-regulation of Syt1 affected MI and MII conversion，the first polar body release and further cortical response.Conclusions：Syt1 is involved in mouse oocyte meiotic maturation process and cortical reaction.

Synaptotagmin1； Meiosis； Cortical reaction； Oocyte

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.02.012 ·實(shí)驗(yàn)研究·

2016-10-17；

2016-10-30

國(guó)家自然科學(xué)基金(2013-81300479)&深圳市科創(chuàng)委面上項(xiàng)目(JCY20120616144719076)

朱秀蘭，女，安徽碭山人，博士，主治醫(yī)師，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*

，Email：liushine2006@163.com)