王瑩　陳浩杰　曹帆帆　彭彬　張雪　張登海

[摘要] 目的 研究雷公藤紅素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1975的增殖抑制作用及相關(guān)機(jī)制。 方法 以不同濃度雷公藤紅素（0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L）分別作用于H1975細(xì)胞12 h或24 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；小室侵襲法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力；Western blot法檢測(cè)雷公藤紅素對(duì)H1975細(xì)胞EGFR信號(hào)通路蛋白及其下游基因表達(dá)水平的調(diào)控作用；裸鼠成瘤體內(nèi)驗(yàn)證雷公藤紅素對(duì)H1975細(xì)胞增殖的抑制作用。 結(jié)果 雷公藤紅素對(duì)H1975細(xì)胞增殖有較明顯的抑制作用，且這種抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性；雷公藤紅素能夠顯著抑制H1975細(xì)胞的侵襲能力；雷公藤紅素對(duì)EGFR通路蛋白及其下游基因表達(dá)水平均有不同程度的抑制作用。 結(jié)論 雷公藤紅素通過同時(shí)抑制EGFR及其下游信號(hào)通路蛋白的表達(dá)抑制H1975細(xì)胞的增殖與侵襲能力。

[關(guān)鍵詞] 雷公藤紅素；非小細(xì)胞肺癌；T790突變；EGFR通路

[中圖分類號(hào)] R285.5；R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）32-0033-04

酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）是治療含有EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的一個(gè)有效措施，但是幾乎所有的患者最終均會(huì)產(chǎn)生耐藥導(dǎo)致治療失敗，研究發(fā)現(xiàn)50%的EGFR-TKI耐藥與T790位點(diǎn)的突變有關(guān)[1-3]。

雷公藤紅素（celastrol）是從中藥雷公藤中提取的生物活性成分，常用來治療炎性和自身免疫性相關(guān)的疾病[4-6]，近年來其在腫瘤方面的作用受到研究者的關(guān)注。本研究通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究雷公藤紅素對(duì)含有T790突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1975增殖能力的影響，并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探索，為臨床NSCLC治療提供有效治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

H1975細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存；本實(shí)驗(yàn)所使用試劑：雷公藤紅素（Sigma，美國(guó)）；抗體（Cell Signaling Technology，美國(guó)）；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑（ECL）（Santa Cruz Biotechnology）；侵襲小室（Millipore）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)）；5周齡BALB/c雄性裸鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

H1975細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清和1%雙抗（100 U/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Western blot

收集細(xì)胞，RIPA緩沖液裂解后離心取上清。Bradford法測(cè)定蛋白濃度，10%SDS-PAGE分離后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，抗體（1∶1000）室溫保溫1 h，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10000）室溫保溫1 h，ECL化學(xué)發(fā)光，顯影。

1.4 CCK-8分析實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（1×104/100 μL/孔）。24 h后加入不同濃度的雷公藤紅素，以含等體積 DMSO的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，每孔加入CCK-8 10 μL，震蕩混勻后于培養(yǎng)箱中靜置30 min～2 h，于450 nm測(cè)定吸光度。細(xì)胞存活率=（對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組）/（對(duì)照組-空白組）×100%。

1.5小室侵襲實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，取 200 μL加入到小室內(nèi)，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，擦去膜上層細(xì)胞，將膜取下。甲醛室溫固定30 min，結(jié)晶紫染色后用刀片裁下膜，置于載玻片上，封片觀察。

1.6荷瘤鼠模型的建立

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，PBS 洗滌2～3次。用PBS 稀釋為2×107/mL，接種至裸鼠背部皮下，每只小鼠接種0.15 mL。接種后5 d 選取1.5×1.5×1.5 mm3大小的腫瘤塊的裸鼠進(jìn)行隨機(jī)分組。按照1 mg/（kg·d）給藥，連續(xù)給藥18 d，對(duì)照組注射和實(shí)驗(yàn)組同等體積和濃度的DMSO，隔天測(cè)量腫瘤的體積，腫瘤體積（mm3）=1/2×長(zhǎng)×寬2。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1雷公藤紅素對(duì)H1975細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，0.25 μmol/L的雷公藤紅素處理24 h后，H1975細(xì)胞的增殖活性受到一定程度的抑制（84.22±3.05）%，雷公藤紅素達(dá)到1.0 μmol/L時(shí)，其存活率受到的抑制明顯增強(qiáng)（79.39±1.86）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.303，P=0.038）。隨著雷公藤紅素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，這種增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，呈明顯的時(shí)效和量效關(guān)系。1.0 μmol/L雷公藤紅素處理12 h和24 h細(xì)胞存活率分別降至（87.48±1.92）%（t=5.085，P=0.024）和（79.39±1.86）%（t=4.597，P=0.032），2.0 μmol/L雷公藤紅素處理12 h和24 h細(xì)胞存活率分別降至（82.01±2.15）%（t=4.252，P=0.039）和（70.36±1.54）%（t=5.085，P=0.024）（圖1）。

2.2 雷公藤紅素對(duì)H1975細(xì)胞侵襲能力的影響

小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2），與對(duì)照組比較，1.0 μmol/L的雷公藤紅素處理后穿過基質(zhì)膜的H1975細(xì)胞數(shù)量明顯減少，由（487±47）降至（272±36），與DMSO對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.303，P=0.038）；2.0 μmol/L的雷公藤紅素處理后穿過基質(zhì)膜的H1975細(xì)胞數(shù)量更是降至（98±14），與DMSO對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.649，P=0.00064），以上結(jié)果說明雷公藤紅素對(duì)H1975細(xì)胞的侵襲能力有顯著的抑制作用。

2.3雷公藤紅素對(duì)EGFR及其下游信號(hào)通路的影響

為了進(jìn)一步揭示雷公藤紅素抑制H1975細(xì)胞增殖侵襲能力的可能機(jī)制，我們探討了雷公藤紅素對(duì)H1975細(xì)胞EGFR及其下游信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示（圖3），與對(duì)照組比較，1.0 μmol/L雷公藤紅素處理 H1975細(xì)胞24 h后p-EGFR的表達(dá)量明顯減少，下降（14.18±3.11）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其下游的p-STAT3、p-AKT、p-ERK各自受到不同程度的抑制，活性分別減少（31.61±4.51）%、（78.32±2.84）%和（42.75±3.72）%。結(jié)果說明，雷公藤紅素可能是通過同時(shí)抑制EGFR及其下游信號(hào)通路的活性對(duì)H1975細(xì)胞的惡性增殖發(fā)揮遏制作用。

2.4 雷公藤紅素對(duì)H1975細(xì)胞成瘤能力的影響

結(jié)果顯示（圖4），與注射DMSO的對(duì)照組相比，注射雷公藤紅素的小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度從第5天開始明顯降低，最后一次給藥后DMSO組腫瘤體積（2189.156±217.925）mm3，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積為（1158.386±209.364）mm3，說明雷公藤紅素能夠顯著降低腫瘤的生長(zhǎng)速度，與DMSO組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.754，P=0.0031）。

3 討論

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其中NSCLC約占肺癌75%～80%。NSCLC對(duì)常規(guī)化療藥的敏感性較差，因此，到目前為止NSCLC的死亡率仍居高不下[7]。近年來以酪氨酸激酶抑制劑為代表的靶向治療為臨床治療帶來了希望，但是由于T790M突變引起的繼發(fā)耐藥成為NSCLC治療的障礙，因此尋找能夠有效克服T790M突變引起的EGFR-TKI耐受的藥物仍是目前亟待解決的重要任務(wù)。

EGFR正常表達(dá)于哺乳動(dòng)物的上皮細(xì)胞膜上，其異常表達(dá)將導(dǎo)致其下游信號(hào)通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中的表達(dá)發(fā)生上調(diào)，其中包括NSCLC。T790M突變引起的EGFR-TKI耐受使EGFR下游信號(hào)通路持續(xù)活化，從而促進(jìn)NSCLC發(fā)展。EGFR的激活突變常見于NSCLC中，在美國(guó)每年有超過20 000的患者檢測(cè)到EGFR發(fā)生激活突變。EGFR活化主要通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路[8]、MAPK/MEK/ERK信號(hào)通路[9]、Src信號(hào)通路[10]以及JAK/STAT3信號(hào)通路[11-14]。其中，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路和MAPK/MEK/ERK信號(hào)通路是EGFR最重要的兩條下游通路，EGFR的激活突變導(dǎo)致該信號(hào)通路的活化，通過磷酸化凋亡調(diào)節(jié)分子Bad、Bim、Bcl-2等調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。

生物活性小分子雷公藤紅素具有顯著的抗炎作用，近年來其在抗腫瘤方面的作用受到了研究者的關(guān)注[15]，研究表明celastrol能夠抑制包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖，體內(nèi)試驗(yàn)也證實(shí)其對(duì)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制作用[16-18]，另外，celastrol能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物[19]和放射治療的敏感性[20]。

本研究及其他研究組的研究結(jié)果均表明celastrol對(duì)EGFR下游的多種信號(hào)蛋白具有抑制作用，其中包括PI3K/AKT、ERK/MEK。Celastrol是否對(duì)含T790突變NSCLC細(xì)胞的惡性增殖有抑制作用及該作用是否是通過對(duì)EGFR及其下游信號(hào)途徑調(diào)控發(fā)揮作用目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，雷公藤紅素能顯著抑制含T790突變的H1975細(xì)胞的增殖侵襲能力，體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素雖然對(duì)H1975細(xì)胞中EGFR的活性抑制能力不是很強(qiáng)（14.18±3.11）%，卻能夠直接阻斷EGFR下游JAK/STAT3、MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，尤其是對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制率達(dá)到（78.32±2.84）%。因此采用雷公藤紅素進(jìn)行治療，有可能通過直接抑制EGFR的活性，同時(shí)抑制其下游的JAK/STAT3、MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路，共同發(fā)揮抑制H1975細(xì)胞惡性增殖的作用，達(dá)到治療NSCLC的效果。

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（收稿日期：2016-09-06）