王禹錕 孫越 董文杰 吳婷

成釉細(xì)胞瘤患者的EPO/EPOR-JAK2-STAT5信號(hào)傳導(dǎo)通路研究

王禹錕 孫越 董文杰 吳婷

目的探討促紅細(xì)胞生成素(EPO)/促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)-激活的蛋白酪氨酸激酶-2(JAK2)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子5(STAT5)信號(hào)通路在成釉細(xì)胞瘤(AB)中的表達(dá)及意義,就AB的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探索。方法采用免疫組化法對(duì)34例AB、8例牙源性角化囊腫(OKC)及7例牙胚(TG)三組標(biāo)本中上述四種蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果EPOR多分布于AB、OKC及TG的上皮成分的胞膜上與胞漿中；TG與AB比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；OKC表達(dá)與另兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。叢狀型AB表達(dá)明顯高于濾泡型AB,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。無(wú)細(xì)胞變異型AB的表達(dá)明顯高于顆粒細(xì)胞型AB,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而叢狀型AB當(dāng)中,許多腫瘤細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈。EPO于上皮細(xì)胞成分相應(yīng)胞漿當(dāng)中較多分布,在AB與TG中具有較為相似的表達(dá)水平,而對(duì)于在OKC中的表達(dá)而言,其相比于TG,要明顯弱于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。許多AB表達(dá)于中央星網(wǎng)狀細(xì)胞、立方細(xì)胞或外周柱狀細(xì)胞。諸多濾泡型AB的立方細(xì)胞或外周柱狀細(xì)胞,在顏色方面,均略強(qiáng)于中央多邊形細(xì)胞。AB、OKC與TG組間JAK2在細(xì)胞核及細(xì)胞漿中的表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；JAK2在顆粒細(xì)胞亞型、棘皮瘤亞型及細(xì)胞變異亞型表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論EPO/EPOR-JAK2-STAT5信號(hào)傳導(dǎo)通路在AB、OKC及TG之間,以及AB的各亞型及各分型間均具有顯著的表達(dá)。EPO/EPOR在AB中、瘤樣病變及牙源性組織當(dāng)中,利用JAK2-STAT5信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)其作用的充分發(fā)揮,另外,EPO/EPOR-JAK2-STAT5通路相應(yīng)異?；罨cAB的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。

成釉細(xì)胞瘤；促紅細(xì)胞生成素；促紅細(xì)胞生成素受體；激活的蛋白酪氨酸激酶；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子

AB乃是來(lái)源于上皮且具有最高發(fā)病率的牙源性腫瘤,當(dāng)前以對(duì)此存有諸多病理分型,盡管均為良性腫瘤,但具有一些惡性腫瘤的相應(yīng)生物學(xué)行為,存在惡變潛能、侵襲性生長(zhǎng)及高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn),所以有學(xué)者將其劃定為臨界瘤［1-5］。近些年來(lái),有關(guān)AB當(dāng)中蛋白與基因異常的表達(dá)日益報(bào)道增多［6-13］,但在研究AB發(fā)生與發(fā)展方面的型號(hào)傳導(dǎo)通路卻比較少。本次研究通過(guò)運(yùn)用免疫組化方法,將OKC與TG作為對(duì)照組,將AB及其亞型、分型作為實(shí)驗(yàn)組,就AB、TG和OKC當(dāng)中EPO/EPOR-JAK2-STAT5信號(hào)傳導(dǎo)通路的意義與表達(dá),因此就其在OKC與AB的發(fā)生、發(fā)展,以及其在TG發(fā)育中所發(fā)揮出的作用予以明確。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2007年6月～2016年6月在本院口腔頜面外科行手術(shù)切除治療的34例AB標(biāo)本為AB組、8例OKC標(biāo)本為OKC組、7例TG標(biāo)本為TG組。TG 組來(lái)自7例下頜阻的第三磨牙時(shí)所收集的處于發(fā)育狀態(tài)的牙胚,男4例,女3例,中位年齡13歲；OKC組8例標(biāo)本分別來(lái)自上頜骨與下頜骨,各4例,男3例,女5例,中位年齡35歲；34例AB標(biāo)本來(lái)自下頜28例,上頜6例,男19例,女15例,中位年齡32歲。依據(jù)組織學(xué)模式將AB組標(biāo)本分類,即亞型包括：23例非細(xì)胞變異型、7例棘皮瘤型、4例顆粒細(xì)胞型；叢狀型15例,濾泡型19例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 試劑：SC-836：兔抗人STAT5多克隆抗體STAT5、SC-695：兔抗人EPOR多克隆抗體、SC-1310：山羊抗人EPO多克隆抗體EPO,均選自Santa Cruz公司。免疫組化S-P染色購(gòu)買自廣州博士德有限公司。全部標(biāo)本均采用中性福爾馬林(10%)浸泡固定,時(shí)間為24 h,運(yùn)用酒精將其逐級(jí)脫水,運(yùn)用二甲苯將其透明,用石蠟將其包埋,持續(xù)切片(3 μm),分別實(shí)施免疫組化染色與組織學(xué)染色。運(yùn)用免疫組織化學(xué)S-P法,各項(xiàng)操作流程均需依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)完成,運(yùn)用已知陽(yáng)性片實(shí)施陽(yáng)性對(duì)照,選用PBS取代第一抗體實(shí)施陰性對(duì)照,其他流程均相同。

1.3 結(jié)果判定 本次研究采用Leica DM 2500顯微鏡,Motic6.0采集系統(tǒng)［14］。由病理專家審閱免疫組織化學(xué)片與H.E片子。本次試驗(yàn)所獲取的蛋白,若在胞核、胞膜及胞漿中呈現(xiàn)為棕黃色顆粒狀,則將其定為陽(yáng)性著色。牙源性腫瘤與牙源性組織相應(yīng)免疫組化結(jié)果所持有的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù),將其劃分為三組,即＞65%細(xì)胞染色強(qiáng)度,則反映此樣本所持有的免疫組化反應(yīng)性：(-)陰性,細(xì)胞不存在著色狀況；(+)表示弱陽(yáng)性至中度陽(yáng)性,顏色從淺黃色至棕黃色；(++)表示強(qiáng)陽(yáng)性,顏色為棕褐色［15］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Rversion 2.4.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kruskal-Wallis test及Mann-Whitney U-test對(duì)組間差異進(jìn)行檢測(cè)。P＜0.05表示存有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

EPOR多分布于AB、OKC及TG的上皮成分的胞膜上與胞漿中；TG與AB比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；OKC表達(dá)與另兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。部分TG上皮能夠發(fā)現(xiàn)處于增殖活躍狀態(tài)的上皮島,而對(duì)TG上皮島及上皮均存在有十分強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)。叢狀型 AB表達(dá)明顯高于濾泡型AB,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。無(wú)細(xì)胞變異型AB的表達(dá)相比于顆粒細(xì)胞型AB,前者明顯高于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而叢狀型AB當(dāng)中,許多腫瘤細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈。對(duì)于一些濾泡型AB,其呈現(xiàn)出一種相應(yīng)芽樣生長(zhǎng)狀態(tài),陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)烈。針對(duì)AB當(dāng)中帶有牙齦黏膜的組織切片,通過(guò)對(duì)牙齦黏膜下方進(jìn)行觀察,可發(fā)現(xiàn)其間質(zhì)當(dāng)中的serres上皮仍然存在有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。EPO于上皮細(xì)胞成分相應(yīng)胞漿當(dāng)中較多分布,在AB與TG中具有較為相似的表達(dá)水平,而對(duì)于在OKC中的表達(dá)而言,其相比于TG,要明顯弱于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。許多AB表達(dá)于中央星網(wǎng)狀細(xì)胞、立方細(xì)胞或外周柱狀細(xì)胞。諸多濾泡型AB的立方細(xì)胞或外周柱狀細(xì)胞,在顏色方面,均略強(qiáng)于中央多邊形細(xì)胞。針對(duì)叢狀型AB而言,不管是中央細(xì)胞還是外周細(xì)胞,其多數(shù)情況均具有較強(qiáng)的表達(dá)。AB、OKC與TG組間JAK2在細(xì)胞核及細(xì)胞漿中的表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；JAK2在顆粒細(xì)胞亞型、棘皮瘤亞型及細(xì)胞變異亞型表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1,表2。

表1 牙胚、牙源性角化囊腫和成釉細(xì)胞瘤中EPO和EPOR的免疫組化表達(dá)(n)

表2 牙胚、牙源性角化囊腫和成釉細(xì)胞瘤中STAT5在胞漿和胞核中的免疫組化表達(dá)(n)

3 討論

EPO要想發(fā)揮出其作用,首先需將EPOR激活,然后將下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路激活,由此方能實(shí)現(xiàn)。JAK2是EPOR直接而又單獨(dú)性的下游信號(hào)分子。老鼠實(shí)驗(yàn)可知,如若缺乏JAK2,會(huì)因紅細(xì)胞生成出現(xiàn)障礙,而幼鼠死于子宮中,也就是缺乏JAK2的細(xì)胞,沒(méi)有應(yīng)答上游 EPO。而對(duì)于STAT5而言,其乃是JAK2所持有的下游底物,關(guān)系到紅系祖細(xì)胞能夠長(zhǎng)久生存。另外,如若小鼠STAT5a缺乏,還會(huì)導(dǎo)致泌乳能力逐漸喪失的狀況,此結(jié)論一致于STAT5 是一種乳腺因子。當(dāng)STAT5b缺乏時(shí),則兩性分化能力則會(huì)由此而喪失。由此可知,JAK-STAT 信號(hào)通路對(duì)胚胎發(fā)育具有良好的作用。又有研究可知,相比于處于正常狀態(tài)的口腔黏膜當(dāng)中的微弱表達(dá),處于發(fā)育狀態(tài)的STAT5與JAK2,其牙胚當(dāng)中的表達(dá)更強(qiáng)。由此可知,針對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路,可利用旁分泌及自分泌方式,積極參與到人類牙胚的發(fā)育過(guò)程中。另外,在胞漿中的表達(dá),JAK2要明顯強(qiáng)于胞核,而在胞核當(dāng)中,STAT5的表達(dá)也要強(qiáng)于胞漿,由此知曉兩者的定位位置。通過(guò)本次研究可知,EPOR多分布于AB、OKC及TG的上皮成分的胞膜上與胞漿中；TG與AB比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；OKC表達(dá)與另兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。部分TG上皮能夠發(fā)現(xiàn)處于增殖活躍狀態(tài)的上皮島,而對(duì)TG上皮島及上皮均存在有十分強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)。叢狀型 AB表達(dá)明顯高于濾泡型AB,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。無(wú)細(xì)胞變異型AB的表達(dá)相比于顆粒細(xì)胞型AB,前者明顯高于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而叢狀型AB當(dāng)中,許多腫瘤細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈。對(duì)于一些濾泡型AB,其呈現(xiàn)出一種相應(yīng)芽樣生長(zhǎng)狀態(tài),陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)烈。針對(duì)AB當(dāng)中帶有牙齦黏膜的組織切片,通過(guò)對(duì)牙齦黏膜下方進(jìn)行觀察,可發(fā)現(xiàn)其間質(zhì)當(dāng)中的serres上皮仍然存在有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。EPO于上皮細(xì)胞成分相應(yīng)胞漿當(dāng)中較多分布,在AB與TG中具有較為相似的表達(dá)水平,而對(duì)于在OKC中的表達(dá)而言,其相比于TG,要明顯弱于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。許多AB表達(dá)于中央星網(wǎng)狀細(xì)胞、立方細(xì)胞或外周柱狀細(xì)胞。諸多濾泡型AB的立方細(xì)胞或外周柱狀細(xì)胞,在顏色方面,均略強(qiáng)于中央多邊形細(xì)胞。針對(duì)叢狀型AB而言,不管是中央細(xì)胞還是外周細(xì)胞,其多數(shù)情況均具有較強(qiáng)的表達(dá)。AB、OKC與TG組間JAK2在細(xì)胞核及細(xì)胞漿中的表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；JAK2在顆粒細(xì)胞亞型、棘皮瘤亞型及細(xì)胞變異亞型表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由此可知,上述因子程度差異性與牙源性腫瘤及牙源性組織的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；EPO/EPORJAK2-STAT5a信號(hào)通路不僅對(duì)于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌相應(yīng)侵襲性當(dāng)中存在作用,而且在頭頸部組織及牙源性腫瘤當(dāng)中,同樣發(fā)揮著作用,由此表明,此通路可能在頭頸部腫瘤當(dāng)中廣泛存在；基于形態(tài)學(xué)角度來(lái)講,觀察到了口腔黏膜、serras上皮剩余及殘余牙胚上皮等,乃是造成AB組織發(fā)生與發(fā)展的重要誘因。

綜上所述,EPO/EPOR-JAK2-STAT5信號(hào)傳導(dǎo)通路在AB、OKC及TG之間,以及AB的各亞型及各分型間,均具有顯著的表達(dá)。EPO/EPOR在AB中、瘤樣病變及牙源性組織當(dāng)中,利用JAK2-STAT5信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)其作用的充分發(fā)揮,另外,EPO/EPOR-JAK2-STAT5通路相應(yīng)異?；罨cAB的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。

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Research of signal transduction pathway of EPO/EPOR-JAK2-STAT5 in ameloblastoma patients

WANG Yu-kun,SUN Yue,DONG Wen-jie,et al.Department of Stomatology,Second Affiliated Hospital of Mudanjiang Medical University,Mudanjiang 157000,China

ObjectiveTo investigate expression and significance by signal transduction pathway of erythropoietin(EPO)/erythropoietin receptor(EPOR)-activated protein tyrosine kinase-2(JAK2)-signal transducers and activators of transcription 5(STAT5) in ameloblastoma(AB),and to make further exploration of pathogenesis in AB.MethodsImmunohistochemistry method was applied to detect expression of the four protein in 34 AB samples,8 odontogenic keratocyst(OKC) samples and 7 tooth germ(TG) samples.ResultsEPOR generally distributed in epithelial cytomembrane and cytoplasm in AB,OKC and TG,and there was no statistically significant difference between TG and AB(P＞0.05),while OKC had statistically significant difference comparing with the other two groups(P＜0.05).Expression of plexiform type AB was obviously higher than follicular type AB,and their difference had statistical significance(P＜0.05).Expression of non-cytometaplasia AB was much higher than granular cell type AB,and the difference had statistical significance(P＜0.05).Tumor cells showed strong expression in plexiform type AB.Distribution of EPO was mainly in epithelial cell cytoplasm,and its expression was similar in AB and TG,while its expression in OKC was obviously lower than TG.The difference had statistical significance(P＜0.05).Main expression of AB occurred in central stellate reticulum,cuboidal cell and peripheral columnar cell.Cuboidal cell and peripheral columnar cell in follicular type AB had darker color than central stellate reticulum.The difference of expression of JAK2 in cell nucleus and cytoplasm across AB,OKC and TG had statistical significance(P＜0.05).The difference of expression of JAK2 had statistical significance acrossgranular cell subtype,acanthoma subtype and cytometaplasia subtype(P＜0.05).ConclusionSignal transduction pathway of EPO/EPOR-JAK2-STAT5 shows remarkable expression in AB,OKC,TG and subtypes of AB.EPO/ EPOR shows its effect fully by signal pathway of JAK2-STAT5 in AB,tumor-like lesion and odontogenic tissues.Abnormal activated EPO/EPOR-JAK2-STAT5 pathway is correlated with occurrence and development of AB.

Ameloblastoma; Erythropoietin; Erythropoietin receptor; Activated protein tyrosine kinase; Signal transducers and activators of transcription

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.01.016

2016-12-09］

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：12541851)

157000 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬二院口腔科(王禹錕董文杰 吳婷)；哈爾濱市第四醫(yī)院口腔科(孫越)

吳婷