霍金海，張海燕，王偉明，2#（.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所，哈爾濱 50036；2.黑龍江省林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱 50040）

一測多評法同時(shí)測定北青龍衣藥材中胡桃醌和胡桃酮的含量Δ

霍金海1＊，張海燕1，王偉明1，2#（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所，哈爾濱 150036；2.黑龍江省林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱 150040）

目的：建立同時(shí)測定北青龍衣藥材中胡桃醌、胡桃酮含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，以胡桃醌為內(nèi)參物，計(jì)算其對胡桃酮的相對校正因子（RCF），通過RCF計(jì)算北青龍衣藥材中胡桃酮的含量；以外標(biāo)法測定的胡桃酮含量作實(shí)測值，采用夾角余弦法比較一測多評法的計(jì)算值與實(shí)測值的差異。結(jié)果：胡桃醌、胡桃酮檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為7.6～76.0 μg/mL（r＝0.999 0）、8.2～82.0 μg/mL（r＝0.999 4）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為95.37%～97.94%（RSD＝1.04%，n＝6）、99.13%～100.10%（RSD＝0.33%，n＝6）。計(jì)算值與實(shí)測值之間的夾角余弦值為0.999 84，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于北青龍衣藥材中胡桃醌、胡桃酮含量的同時(shí)測定。

北青龍衣；一測多評；高效液相色譜法；校正因子；胡桃醌；胡桃酮；含量

北青龍衣為胡桃科胡桃屬植物核桃楸Juglans mandshurica Maxim.的未成熟外果皮，主產(chǎn)于東北三省，以黑龍江省資源蘊(yùn)藏量最大。萘醌類為公認(rèn)的北青龍衣抗腫瘤主要成分，文獻(xiàn)表明從胡桃屬植物中已分離獲得60多種萘醌類化合物[1]，其中以胡桃醌、胡桃酮為主要活性成分。目前國內(nèi)外學(xué)者多集中于胡桃醌的含量測定方法研究，但胡桃醌化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，致使測定結(jié)果不理想。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，北青龍衣鮮品中胡桃醌含量較高，在干燥、貯存過程中能夠轉(zhuǎn)化成胡桃酮，二者總和相對穩(wěn)定。因此，同時(shí)測定北青龍衣藥材中胡桃醌、胡桃酮的總量，對于北青龍衣藥材質(zhì)量控制及品質(zhì)評價(jià)具有實(shí)際意義。

目前，胡桃醌有化學(xué)合成對照品，而胡桃酮僅有少數(shù)植物化學(xué)家從胡桃屬植物中分離獲得，難以商品化，筆者也未見其含量測定方法的報(bào)道。近年來，一測多評技術(shù)采用一個(gè)對照品實(shí)現(xiàn)對多個(gè)成分的同步測定，對于一些制備困難或價(jià)格昂貴的對照品具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。該方法在白芍[2]、木香[3]等藥材中得到發(fā)展和驗(yàn)證，黃連的一測多評標(biāo)準(zhǔn)已被2010年版《中國藥典》（一部）采納[4]。2015年版《中國藥典》（一部）繼續(xù)收錄了丹參等品種的一測多評含量測定方法[5]。本試驗(yàn)針對北青龍衣藥材中主要指標(biāo)成分胡桃醌、胡桃酮建立一測多評方法，解決了難以獲得胡桃酮對照品的困擾，為北青龍衣藥材的質(zhì)量控制及采收期的確定奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1315B DAD二級管陣列檢測器（美國Agilent公司）；2010型HPLC儀，包括紫外雙波長檢測器（日本Shimadzu公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：300 W，頻率：40 kHz）；BP211D型電子分析天平、BSA224S-CW型電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試劑

胡桃醌對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：H-075-131230，純度：＞99%）；胡桃酮對照品（筆者自制，經(jīng)氫譜、碳譜檢測結(jié)構(gòu)，HPLC面積歸一化法測定純度：＞98%）；磷酸、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

北青龍衣藥材于2014年7—8月采自黑龍江省不同產(chǎn)地（見表1），經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院初東君主任藥師鑒定為真品。剝?nèi)⊥夤?，通風(fēng)處陰干，7 d后用于樣品制備（含水量均符合小于10%的要求）。

表1 北青龍衣藥材來源Tab 1 Source of J.mandshurica

2 方法與結(jié)果

2.1 原理

在一定線性范圍，成分的量（質(zhì)量或濃度）與檢測器響應(yīng)值成正比。在多指標(biāo)（s，a，b，…，i，…）質(zhì)量評價(jià)時(shí)，以藥材/成藥中某一典型有效成分作內(nèi)參物（s），建立內(nèi)參物對其他待測成分（a，b，…，i，…）間的相對校正因子（RCF），按下式計(jì)算：

式中，As為內(nèi)參物對照品s峰面積，cs為內(nèi)參物對照品s濃度，Ai為待測成分對照品i峰面積，ci為待測成分對照品i濃度。

在方法學(xué)建立時(shí)，主要是求出內(nèi)參物與各待測成分間的RCF，并將其作為一個(gè)常數(shù)用于含量測定中。

應(yīng)用RCF（fsa，fsb，fsc，…），結(jié)合內(nèi)參物（s）實(shí)測值cs，計(jì)算待測成分（a，b，…，i，…）的濃度：

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（45∶55，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：265 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以胡桃酮、胡桃醌峰計(jì)均＞3 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液 取待測成分對照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成胡桃醌、胡桃酮質(zhì)量濃度分別為0.076、0.082 mg/mL的混合對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.2 供試品溶液 取樣品粉末（過60目篩）1 g，精密稱定，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對照品溶液1、2、3、5、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得胡桃醌、胡桃酮回歸方程分別為y＝32.22x+79.04（r＝0.999 0）、y＝33.04x+ 111.3（r＝0.999 4）。結(jié)果表明，胡桃醌、胡桃酮檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為7.6～76.0、8.2～82.0 μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，胡桃醌、胡桃酮峰面積的RSD分別為0.98%、0.95%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，胡桃醌、胡桃酮峰面積的RSD分別為0.51%、2.85%（n＝7），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（編號：1）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，胡桃醌、胡桃酮平均含量分別為0.462 6、1.956 1 mg/g，RSD分別為2.91%、2.55%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（編號：1）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.9 RCF的計(jì)算

以胡桃醌為內(nèi)參物，按“2.1”項(xiàng)下公式（1）計(jì)算，結(jié)合“2.4”項(xiàng)下系列混合對照品溶液所得峰面積數(shù)據(jù)，計(jì)算胡桃醌對胡桃酮的RCF。結(jié)果，胡桃醌對胡桃酮的RCF為1.131。

2.10 RCF耐用性考察

2.1 0.1 色譜條件考察 取“2.3.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，分別考察不同流動(dòng)相[甲醇-0.2%磷酸溶液（55∶45，V/V）、甲醇-水（45∶55，V/V）]、不同流動(dòng)相比例[甲醇-水（45∶55，V/V）、（50∶50，V/V）]、不同柱溫（20、30、40℃ ）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）對RCF的影響，詳見表3～表6。

表3 不同流動(dòng)相對RCF的影響（n＝6）Tab 3 Effect of different mobile phases on RCF（n＝6）

表4 不同流動(dòng)相比例對RCF的影響（n＝6）Tab 4 Effect of different mobile phase ratios on RCF（n＝6）

2.1 0.2 色譜柱和HPLC儀考察 取“2.3.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，分別考察不同HPLC儀（安捷倫1100、島津2010）和不同色譜柱[Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3種色譜柱，詳見表7。

表5 不同柱溫對RCF的影響（n＝6）Tab 5 Effect of different column temperature on RCF（n＝6）

表6 不同流速對RCF的影響（n＝6）Tab 6 Effect of different velocities on RCF（n＝6）

表7 不同儀器和色譜柱對RCF的影響（n＝6）Tab 7 Effect of different instruments and chromatographic columns on RCF（n＝6）

2.1 0.3 實(shí)驗(yàn)室考察 取“2.3.1”項(xiàng)下混合對照品溶液考察3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室對RCF的影響，詳見表8。

表8 不同實(shí)驗(yàn)室對RCF的影響（n＝6）Tab 8 Effect of different laboratories on RCF（n＝6）

以上研究表明，該一測多評方法在流動(dòng)相組成及比例、柱溫、流速發(fā)生小幅度變化，以及更換色譜柱、HPLC色譜儀、實(shí)驗(yàn)室等條件下均具有較好耐用性，RSD均小于5%。

2.11 樣品含量測定

取表1中的樣品各適量，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，見表9。采用一測多評法和外標(biāo)法測得的胡桃酮的計(jì)算值和實(shí)測值之間的夾角余弦值為0.999 84，表明兩種方法所得含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

表9 樣品含量測定結(jié)果（n＝6）Tab 9 Results of contents determination of samples（n＝6）

筆者對不同流動(dòng)相pH、流動(dòng)相組成比例、柱溫、流速和檢測波長等因素進(jìn)行了考察，結(jié)果RCF均無較大偏離（RSD＜5%）；通過方法學(xué)、方法的耐用性、系統(tǒng)適用性考察對一測多評法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果一測多評法計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明試驗(yàn)建立的RCF準(zhǔn)確可信。

預(yù)試驗(yàn)中還檢測了北青龍衣鮮、干品中胡桃醌和胡桃酮含量，發(fā)現(xiàn)鮮品中無胡桃酮，且胡桃醌含量較高；然而鮮品中胡桃醌含量與干品中胡桃醌、胡桃酮含量之和相當(dāng)；可見北青龍衣鮮、干品中胡桃醌、胡桃酮含量總和相對穩(wěn)定。而單一測定胡桃醌的含量，受干燥方法和貯存時(shí)間的限制，難以準(zhǔn)確反映北青龍衣藥材真實(shí)質(zhì)量。

綜上所述，一測多評方法不僅能夠準(zhǔn)確計(jì)算胡桃酮成分含量，并且實(shí)現(xiàn)了在對照品短缺的情況下，多指標(biāo)成分的含量測定，為北青龍衣藥材的質(zhì)量控制研究提供了更加科學(xué)準(zhǔn)確的研究方法。

[1] Sun JX，Zhao XY，F(xiàn)u XF，et al.Three new naphthalenyl glycosides from the root bark of Juglans cathayensis[J]. Chem Pharm Bull：Tokyo，2012，60（6）：785-789.

[2] 黃山君，楊琪偉，石燕紅，等.一測多評法測定白芍中芍藥苷與芍藥內(nèi)脂苷的含量[J].中國中藥雜志，2011，36（6）：780-783.

[3] 楊憲，劉筱琴，張雪，等.HPLC一測多評法用于木香及3種含木香中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量評價(jià)[J].中國藥房，2014，25（11）：1030-1034.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：285.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年

版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：76.

Simultaneous Determination of Contents of Juglone and Regiolone in Juglans mandshurica by Quantitative Analysis of Multi-components by Single-maker

HUO Jinhai1，ZHANG Haiyan1，WANG Weiming1，2（1.Institute of Chinese Medicine，Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150036，China；2.Heilongjiang Forest Economy Collaborative R&D and Innovation Center Resource Utilization，Harbin 150040，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of juglone and regiolone in Juglans mandshurica.METHODS：HPLC was used and regiolone was used as internal reference，the relative correction factor（RCF）of regiolone and juglone wascalculated，then calculated the content of juglone based on RCF；the juglone content was used as measured value，which was determined by external standard method，angle cosine method was used to compared the difference of calculated value in quantitative analysis of multi-components by single-maker and measured value in external standard method.RESULTS：The lin-ear range was 7.6-76.0 μg/mL for juglone（r＝0.999 0）and 8.2-82.0 μg/mL for regiolone（r＝0.999 4）；RSDs of precision，stability and reproducubility tests were lower than 3.0%；recoveries were 95.37%-97.94%（RSD＝1.04%，n＝6）and 99.13%-100.10%（RSD＝0.33%，n＝6）.The cosine of the included angle between the calculated and measured values was 0.999 84，and there was no significant difference（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of juglone and regiolone in J.mandshurica.

Juglans mandshurica；Quantitative analysis of multi-components by single-maker；HPLC；Correction factor；Juglone；Regiolone；Content

R284.1

A

1001-0408（2017）03-0380-04

2016-02-06

2016-05-16）

（編輯：張 靜）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81503348）；國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題（No.2009ZX09102-138）

＊副研究員。研究方向：中藥品質(zhì)評價(jià)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。電話：0451-55653086。E-mail：jinhaihuo@126.com

#通信作者：研究員。研究方向：中藥新藥研發(fā)。電話：0451-55665478。E-mail：zyyjy@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.26