吳沂蕓++陳翠平+任超翔+吳清華+陳江+裴瑾

[摘要]記錄并計(jì)算紅花開花1～7 d的平均產(chǎn)量，采用HPLC檢測紅花中羥基紅花黃色素A（HYSA）、槲皮素、柚皮素和山柰酚的含量，使用Realtime PCR檢測chs，chi的相對表達(dá)量，并進(jìn)行相關(guān)性分析。紅花平均產(chǎn)量、HYSA和柚皮素的含量及基因表達(dá)量之間呈現(xiàn)相似的變化趨勢。平均產(chǎn)量于開花第3天達(dá)到最大值，與HYSA含量存在較高正相關(guān)性（r=0756，P<005），與chi的相對表達(dá)量存在極高正相關(guān)性（r=0892，P<001）；柚皮素含量與chs的相對表達(dá)量存在較高正相關(guān)性（r=0766，P<005）。該研究為紅花中黃酮類成分合成及調(diào)控機(jī)制研究提供理論依據(jù)，為研究紅花品質(zhì)差異形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]紅花； 黃酮類成分； 平均產(chǎn)量； 功能基因； chs； chi

紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctorius L的干燥花，夏季花由黃變紅時采摘，陰干或曬干[1]，是臨床常用的活血化瘀要藥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，《中國藥典》2015年版收載含紅花的中成藥達(dá)近百種。目前紅花主產(chǎn)于新疆準(zhǔn)噶爾盆地邊緣、伊犁河谷地帶，年產(chǎn)量達(dá)27×104～36×104 t，占全國紅花種植面積和總產(chǎn)量的80%左右。

羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）、槲皮素（quercetin）、柚皮素（naringenin）和山柰酚（kaempferol）均為紅花中的黃酮類成分，是活血化瘀的主要有效成分。黃酮類成分合成途徑可分為2個階段：第一階段通過莽草酸途徑和乙酸丙二酸途徑合成黃酮類基本骨架前體物質(zhì)——4香豆酰輔酶A（4coumaroylCoA）及丙二酰輔酶A（malonylCoA）。第二階段是黃酮類代謝的關(guān)鍵步驟，即1分子4香豆酰輔酶A及3分子丙二酰輔酶A在各類酶的作用下形成醌式查爾酮類、二氫黃酮類、二氫黃酮醇類及黃酮醇類等化合物。查爾酮合成酶（chalconesynthase，CHS）是紅花黃酮類成分生物合成途徑的第一個關(guān)鍵酶，可形成具有C13架的黃酮類化合物——查爾酮，可作為中間產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化構(gòu)成醌式查爾酮類和柚皮素[2]。查爾酮異構(gòu)酶（chalconeflavononeisomerase，CHI）是紅花黃酮類成分生物合成途徑分支上的第一個關(guān)鍵酶[3]，可催化分子內(nèi)的環(huán)化反應(yīng)，使查爾酮類結(jié)構(gòu)異構(gòu)形成柚皮素，繼而在各類酶的作用下形成二氫黃酮類、二氫黃酮醇類及黃酮醇類等化合物[4]。chs與chi分別在燈盞花、桑、決明等的研究中證明為黃酮類成分合成途徑中的關(guān)鍵酶基因。

因此，本研究對開花1～7 d的紅花進(jìn)行平均產(chǎn)量、黃酮類成分動態(tài)累積量及功能基因相對表達(dá)量的檢測，并進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，為紅花中黃酮類成分合成及調(diào)控機(jī)制研究提供理論依據(jù)，同時也為研究紅花品質(zhì)差異形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料

紅花種子來源于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院——簡陽市石盤鎮(zhèn)中藥材資源基地，種植于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園內(nèi)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)裴瑾教授鑒定為菊科植物紅花C inctorius于2015年1月24日播種，2015年5月31日開花。于開花1～7 d每日上午8：00采摘，清潔并吸干水分后置凍存管內(nèi)，立即放入液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室，一部分直接提取RNA，質(zhì)量合格者反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置-20 ℃冰箱中備用；一部分低溫冷凍干燥24 h，IKA液氮打粉機(jī)粉碎，用于含量測定。

色譜純乙腈、甲醇（美國Fisher公司）；分析純磷酸（成都市科龍化工試劑廠）；超純水（自制）；羥基紅花黃色素A對照品（批號 MUST15072815，成都曼斯特生物科技有限公司）；Agilent 1200高效液相色譜儀（包括化學(xué)工作站）、Agilent 1260 DAD紫外檢測器（美國 Agilent Technologies公司）；電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；2×Taq PCR Master Mix、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑（天根生化科技有限公司）；熒光定量PCR儀（美國BioRad公司）。

2方法

21紅花平均產(chǎn)量計(jì)算

采摘開花1～7 d整個花序的管狀花，隨機(jī)取50朵長度15 cm左右的管狀花，清潔并吸干水分后稱重（M）；隨機(jī)標(biāo)記10個花序，于開花1～7 d每日對開放管狀花進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值（N）。計(jì)算紅花平均產(chǎn)量（開花1～7 d每個花序管狀花的平均質(zhì)量）=M·N/50。

22HPLC測定黃酮類成分含量

221HYSA含量測定[5] 精密稱取紅花粉末04 g，精密量取25%甲醇50 mL，稱量，25 ℃超聲（300 W，50 kHz）處理40 min，取出后稱重并補(bǔ)足失重。用045 μm濾膜過濾得供試品溶液。Agilent Zorbax Eclipse XDBC18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇乙腈07%磷酸溶液（26∶2∶72）為流動相，等度洗脫；檢測波長 403 nm；流速 08 mL·min-1；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。

222槲皮素、柚皮素和山柰酚含量測定精密稱取紅花粉末10 g，精密量取甲醇25 mL，95 ℃回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液15 mL，置平底燒瓶中，加鹽酸溶液（取15～37 mL）5 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。Agilent Zorbax Eclipse XDBC18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇04%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫；檢測波長 360，254 nm；流速 10 mL·min-1；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量 20 μL。

23chs基因表達(dá)分析[6] 查閱文獻(xiàn)[3]，得到紅花chs（上游引物5′GTCGTCCTCTTCGTTGTGGT3′；下游引物5′CAAAGGCGAAAAGACGATTC3′）和內(nèi)參基因25s（上游引物5′GGAGGTTGAGGGAAAAGGAG3′，下游引物5′GTGACCTCGTCACCCGTAGT3′）的Realtime PCR引物序列。擴(kuò)增體系10 μL：Thunderbird SYBR qPCR Mix，5 μL；上游引物 05 μL；下游引物 05 μL；cDNA模板，1 μL；ddH2O，3 μL?？疾煲飻U(kuò)增曲線、溶解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察Realtime PCR條件（退火溫度以50～65 ℃梯度考察）：94 ℃，3 min；30個循環(huán)（94 ℃ 30 s，50～65 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min）；72 ℃ 5 min。確定條件并測定紅花chs和內(nèi)參基因25s的表達(dá)量。

24chi基因表達(dá)分析[5] 查閱文獻(xiàn)[7]，得到內(nèi)參基因Ct60s（上游引物5′CATCCATTATCCAACAATC3′，下游引物5′AAGAGTAATCAGTCTCCA3′）的Realtime PCR引物序列。擴(kuò)增體系20 μL：Thunderbird SYBR qPCR Mix，10 μL；上游引物 1 μL；下游引物 1 μL；cDNA模板 5 μL；dd H2O 3 μL?？疾煲飻U(kuò)增曲線、溶解曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察Realtime PCR條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s；Plate Read（52～60 ℃，30 s），40個循環(huán)；95 ℃ 30 s；Plate Read（65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s）。確定條件并測定紅花chi和內(nèi)參基因Ct60s的表達(dá)量。

25數(shù)據(jù)分析利用BioRad CFX Manager軟件分析chs及chi的相對表達(dá)量。然后，利用SPSS 170統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，考察平均產(chǎn)量、有效成分動態(tài)積累及基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性。

3結(jié)果

31紅花平均產(chǎn)量的計(jì)算對紅花開花1～7 d的花序形態(tài)進(jìn)行記錄、描述，并對平均產(chǎn)量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見圖1，表1。紅花開花1～7 d管狀花依次開放，3～4 d開放完全，并于5～7 d逐漸枯萎，顏色由淺黃逐漸加深為橘紅。由表1可知，紅花平均產(chǎn)量逐漸增大，于第3天達(dá)到最大值，后逐漸減小。

含量呈現(xiàn)相似的變化趨勢，均在1～3，4 d（始花期至盛花期）逐漸增加至最大值，在3，4～7 d（盛花期至衰敗期）逐漸降低。將紅花平均產(chǎn)量與HYSA含量進(jìn)行相關(guān)性分析可知，兩者存在較高正相關(guān)性（r=0756，P<005）。綜合本草記載及本研究認(rèn)為：紅花應(yīng)于“夏季盛花期采摘，此時花朵由黃變紅，管狀花充分展開，花冠頂端金黃色、中部橘紅色?！惫视谑⒒ㄆ冢ㄩ_花3～4 d）采摘紅花所得藥材的平均產(chǎn)量和成分含量高、顏色紅黃鮮艷、品質(zhì)最好。

42chs和chi表達(dá)水平與黃酮類成分含量的相關(guān)性分析植物藥材有效成分多為植物的次生代謝產(chǎn)物，是決定藥材質(zhì)量的物質(zhì)基礎(chǔ)；次生代謝產(chǎn)物與個體發(fā)育程度、組織分化相關(guān)，多受外界因素刺激通過影響生物合成基因表達(dá)而調(diào)控。生物合成功能基因調(diào)控有效成分積累，進(jìn)而影響藥材品質(zhì)。本研究以紅花開花1～7 d為研究對象，將紅花中黃酮類成分動態(tài)累積量與2個關(guān)鍵酶的基因表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，從而證實(shí)關(guān)鍵酶的催化作用，對于研究基因表達(dá)調(diào)控有效成分合成具有重要價(jià)值，同時為研究紅花品質(zhì)差異形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

紅花中chs表達(dá)量與柚皮素含量的相關(guān)性較大，chi表達(dá)量與HYSA含量的相關(guān)性較大，因此，可以通過調(diào)節(jié)chs與chi的表達(dá)增加紅花中柚皮素與HYSA的含量。chs表達(dá)量與槲皮素和山柰酚含量的相關(guān)性小，可能由于植物次生代謝產(chǎn)物的合成是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，該系統(tǒng)受環(huán)境因子、調(diào)控因子等多種因素的影響，chs作為紅花黃酮類成分合成路徑上游的關(guān)鍵酶基因，影響因子逐漸增多，致使表達(dá)量與槲皮素和山柰酚含量的相關(guān)性變?nèi)酰粚㈣制に嘏c山柰酚的含量進(jìn)行相關(guān)性分析可知，兩者存在極高的正相關(guān)性（r=0019，P<001），而山柰酚是柚皮素在黃酮類成分合成途徑下游酶的催化下合成的黃酮醇類化合物，說明柚皮素含量可對山柰酚產(chǎn)生影響。在今后的研究中，可進(jìn)行紅花各類成分合成下游基因的表達(dá)量研究，找出基因表達(dá)與成分的關(guān)聯(lián)性，為有效成分合成及調(diào)控機(jī)制研究提供更多的信息。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國藥典一部[S]2015

[2]Koes R E，F(xiàn)rancesca Q，Joseph N M The flavonoid biosynthetic pathway in plants：function and evolution [J]Bioessays，1994，16：123

[3]Huang L L，Yang X，Sun P，et al The first illumina based de novo transcriptome sequencing and analysis of safflower flowers[J] PLoS ONE，2012，7（6）：e38653

[4]Jez J M，Bowman M E，Dixon R A，et al Structure and mechanism of the evolutionarily unique plant enzyme chalconeisomerasse[J].Nat Struct Mol Biol，2000，7（9）：786

[5]陳翠平，裴瑾，吳沂蕓，等紅花查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆分析表達(dá)及HSYA動態(tài)累積關(guān)系[J]中藥材，2016，39（3）：499

[6]康亞蘭，裴瑾，劉薇，等紅花查爾酮合成酶基因的克隆、生物信息學(xué)分析及表達(dá)[J]中草藥，2014，45（14）：2385

[7]劉飛 紅花黃酮類化合物生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與功能驗(yàn)證[D]上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2014[責(zé)任編輯呂冬梅]