鄧輝+陳乃東+戴軍+陳乃富

[摘要]霍山石斛是名貴中藥材，其多糖的抗腫瘤活性是中藥資源領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，該研究旨在探究霍山石斛多糖抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)以霍山石斛為原料，通過(guò)低鹽溶液浸提和硫酸銨分級(jí)沉淀得到不同的霍山石斛蛋白組分，經(jīng)SDSPAGE電泳染色確定糖蛋白組分，再經(jīng)DEAE離子柱和Sephadex凝膠柱進(jìn)一步分離純化糖蛋白組分，同時(shí)采用MTT比色法檢測(cè)不同產(chǎn)物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的毒活性；結(jié)果獲得3種相對(duì)分子質(zhì)量為225，198，156 kDa 的糖蛋白組分RG1，RG2，RG3，測(cè)得三者復(fù)合物對(duì)HepG2的IC50為53423 mg· L-1，而組分RG1，RG2的IC50分別為43296，41391 mg· L-1，組分RG3對(duì)HepG2無(wú)毒活性?？傊?，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示霍山石斛多糖抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一是相對(duì)分子質(zhì)量為225，198 kDa的2種糖蛋白組分，且具有協(xié)同效用。

[關(guān)鍵詞]抗腫瘤活性； 霍山石斛； 糖蛋白； 細(xì)胞毒活性

蘭科植物霍山石斛Dendrobium huoshanense Tang et Cheng，局限分布于安徽省霍山縣及鄰近地區(qū)，其炮制后的干品名為霍斗或金霍斗[1]，霍山石斛的功效作用一直為明、清本草詳細(xì)記載，具有益精強(qiáng)陰、保肝養(yǎng)胃、生津止渴、補(bǔ)虛贏、輕身延年等功效[2]，從 20 世紀(jì) 50 年代末開(kāi)始，國(guó)內(nèi)科研人員開(kāi)始霍山石斛資源保護(hù)、可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用等方面研究，取得了一系列成果，特別是其顯著的抗癌功效吸引著國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)其開(kāi)展了大量科學(xué)研究[36]。

多糖以2種方式發(fā)揮抗腫瘤的活性：一種方式是通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫力進(jìn)而激活免疫系統(tǒng)引起腫瘤細(xì)胞凋亡[714]；另一種方式是直接以其細(xì)胞毒活性而殺傷腫瘤細(xì)胞[1520]。但目前多糖的抗腫瘤活性的研究只限于分離提純后的多糖組分的藥理藥效實(shí)驗(yàn)，尚無(wú)確切的證據(jù)證明和解釋多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的具體物質(zhì)基礎(chǔ)及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2123]。

霍山石斛多糖具有抗腫瘤活性，那么其基礎(chǔ)活性物質(zhì)到底是什么？本團(tuán)隊(duì)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，采用水提醇沉提取霍山石斛粗多糖，再用Sevage法[24]脫蛋白后得到的脫蛋白多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的毒活性明顯低于沒(méi)有經(jīng)過(guò)脫蛋白處理的霍山石斛粗多糖，國(guó)內(nèi)一些學(xué)者也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象[2526] 。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外有研究顯示植物糖蛋白有較強(qiáng)的抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力的作用[2731] 。因此，根據(jù)對(duì)粗制霍山石斛多糖和脫蛋白多糖抗腫瘤比對(duì)效果，假設(shè)霍山石斛多糖中存在一些能被有機(jī)溶劑破壞或除去的糖復(fù)合物，如糖蛋白，這類(lèi)物質(zhì)是構(gòu)成霍山石斛多糖抗腫瘤的基礎(chǔ)物質(zhì)之一。為驗(yàn)證假設(shè)，利用低鹽溶液浸提加硫酸銨分級(jí)沉淀分離提取出不同的霍山石斛蛋白組分，再經(jīng)DEAE Bsarose Fast Flow 離子柱和SephadexG200凝膠柱分離得到糖蛋白，以粗制多糖、脫蛋白多糖和糖蛋白為研究對(duì)象，檢驗(yàn)霍山石斛糖蛋白是否具備對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的毒活性。

1材料

實(shí)驗(yàn)材料為根系生長(zhǎng)3年以上，當(dāng)年春季抽條越冬后的霍山石斛鮮莖（去葉），按統(tǒng)計(jì)學(xué)方法五點(diǎn)取樣[32]，2016年3月采自安徽省霍山縣衡山鎮(zhèn)柳林河栽培基地（六安臻和生物科技有限公司），由鄧輝副教授鑒定。人肝癌細(xì)胞HepG2（上海奧陸生物科技有限公司），阿霉素 （意大利Actavis Italy SpA， 批號(hào)H20130186）；DEAE Bsarose Fast Flow利穗科技（蘇州）公司產(chǎn)品；Sephadex G200 Sigma 公司產(chǎn)品；NaHCO3、硫酸、苯酚、葡萄糖、無(wú)水乙醇、正丁醇、氯仿、丙酮、考馬斯亮藍(lán)G250/R250、硝酸銀、堿性品紅、偏重亞硫酸鈉、高碘酸、活性炭、甲醇、冰乙酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

色譜柱（26 cm×55 cm， 16 cm×80 cm），利穗科技（蘇州）有限公司；UV2100 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，天津市紐森科技有限公司；Mini垂直電泳儀，北京六一儀器廠；Allegra15R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)BECKMAN公司； CO150型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司。

2方法和結(jié)果

21霍山石斛多糖的分離提取將同一種石斛切成薄片后混合，60 ℃烘干至恒重，85 ℃無(wú)水乙醇索氏提取至回流液無(wú)色，揮干溶劑，藥渣按照料液比1∶5加入蒸餾水于80 ℃水浴冷凝回流提取4次，每次3 h[12]。合并濾液并減壓濃縮獲得粗多糖溶液。上述粗多糖溶液，按1∶4加入無(wú)水乙醇，4 ℃冰箱靜置24 h，4 000 r min-1離心5 min，循環(huán)操作3～4次[13]，合并沉淀，60 ℃干燥至恒重，即為粗制多糖[33]。

采用Sevage法[1415]脫蛋白，具體步驟：加入適量蒸餾水，按照樣品溶液萃取劑4∶1加入Sevage試劑（氯仿正丁醇 4∶1），混勻，振蕩30 min。以4 000 r·min-1離心5 min，棄除下層氯仿及中層變性蛋白。取上部水層重復(fù)去蛋白操作，至無(wú)明顯中層為止。收集去蛋白后的上部水層備用。將上述多糖水溶液，通過(guò)超濾裝置超濾，濾膜截留相對(duì)分子質(zhì)量為1 000，脫去小分子物質(zhì)，得到純化后的多糖濃縮溶液。按1∶4加入無(wú)水乙醇，4 ℃冰箱靜置12 h，4 000 r·min-1離心10 min，循環(huán)操作3次[13]，合并沉淀，60 ℃干燥至恒重，即為脫蛋白多糖。

22霍山石斛多糖的細(xì)胞毒活性檢測(cè)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞HepG2，用025%胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)并用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×104～3×104個(gè)/mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，放置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔分別加入25，50，100，200，400，600，800，1 000 mg·L-1的樣液100 μL，設(shè)6 個(gè)平行孔。給樣后于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄上清液，每孔加入200 μL 新鮮配制的05 g·L-1 MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加二甲基亞砜（DMSO）150 μL 溶解，微型振蕩器振蕩混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定A，參考波長(zhǎng)490 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm，以RPMI 1640 培養(yǎng)液作陰性（空白）對(duì)照，以阿霉素作陽(yáng)性對(duì)照。按以下公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，生長(zhǎng)抑制率=[1-（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組） /（A對(duì)照組-A空白組） ]×100%，按文獻(xiàn)計(jì)算測(cè)試樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50） [34]。MTT比色法檢測(cè)結(jié)果顯示，霍山石斛脫蛋白多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的IC50為95915 mg·L-1，霍山石斛粗制多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的IC50為78638 mg·L-1，陽(yáng)性對(duì)照阿霉素的IC50為092 mg·L-1。

23霍山石斛蛋白的分離提取將干燥粉碎均勻的霍山石斛粉末進(jìn)行低鹽溶液浸提（Nacl 03 mol·L-1、料液比1∶15，室溫，12 h），離心（4 ℃，8 000 r·min-1，20 min），取上清液，用飽和度為30%，70%，100%硫酸銨溶液依次分級(jí)沉淀（4 ℃，12 h），離心（4 ℃，8 000 r·min-1，20 min），流水透析48 h（02 g·L-1疊氮化鈉），聚乙二醇濃縮，分裝為蛋白溶液PRⅠ，PRⅡ，PRⅢ，進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)。

24霍山石斛蛋白的SDSPAGE電泳及蛋白染色和糖染色SDSPAGE電泳[3536]，制備5%濃縮膠、12%分離膠，恒壓電泳，考馬斯亮藍(lán)染色和PAS染色，采用凝膠成像系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理軟件，根據(jù)蛋白Marker，計(jì)算出糖蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。SDSPAGE 電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，可知霍山石斛蛋白溶液PRⅠ，PRⅡ，PRⅢ泳道中均含有未知蛋白條帶，但只有蛋白溶液PRⅡ泳道中含有3條較明顯的糖蛋白條帶，采用凝膠成像權(quán)自配的成像數(shù)據(jù)處理軟件，以蛋白Marker相對(duì)遷移率為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出這3種糖蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為225，198，156 kDa。選擇蛋白溶液PRⅡ組分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

26霍山石斛糖蛋白復(fù)合物的細(xì)胞毒活性檢測(cè)MTT 比色法檢測(cè)霍山石斛糖蛋白復(fù)合物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的IC50，操作步驟同22。結(jié)果顯示，霍山石斛糖蛋白復(fù)合物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的IC50為53423 mg·L-1，陽(yáng)性對(duì)照阿霉素的IC50為091 mg·L-1。

27霍山石斛糖蛋白的凝膠排阻色譜純化取糖蛋白復(fù)合物濃縮液，用Sephadex G200 凝膠柱（16 cm×80 cm）進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，水洗脫，收集洗脫液，在考馬斯亮藍(lán)G250染色測(cè)定蛋白的量；用苯酚硫酸法檢測(cè)糖的量。合并同一個(gè)檢出峰中既有蛋白又有糖的檢出管，結(jié)果從多糖蛋白復(fù)合物中得到霍山石斛糖蛋白R(shí)G1，RG2，RG3組分，其糖和蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1122%，1348%，1837%和8878%，8652%，8163%，然后分別裝入透析袋透析，直至AgNO3檢測(cè)透析液無(wú)渾濁后，聚乙二醇濃縮4 ℃保存。

物質(zhì)基礎(chǔ)之一。為此，分別制備了霍山石斛粗制多糖、脫蛋白多糖和多糖蛋白復(fù)合物，并采用MTT方法檢測(cè)對(duì)其進(jìn)行了人肝癌細(xì)胞HepG2的毒活性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的毒活性，霍山石斛多糖蛋白復(fù)合物>粗制多糖>脫蛋白多糖；實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分離純化了霍山石斛多糖蛋白復(fù)合物，得到了3種小分子量糖蛋白組分RG1，RG2和RG3，前兩者具有細(xì)胞毒活性，且具有協(xié)同作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果印證了推測(cè)，當(dāng)然實(shí)驗(yàn)并不排除多糖和蛋白本身也具有抗腫瘤活性。同時(shí)，上述純化的糖蛋白組分是否為單一成分，是否同時(shí)具備增強(qiáng)免疫的功效，其主要構(gòu)成單元和抗腫瘤的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是什么，仍需開(kāi)展更多的研究工作。

[參考文獻(xiàn)]

[1]鄧輝，陳乃富，李耀亭，等 霍山產(chǎn)3種藥用石斛及其雜交優(yōu)勢(shì)種的ISSRPCR分子標(biāo)記鑒別[J] 種子， 2009， 28（2）：43

[2]吳胡琦，羅建平 霍山石斛的研究進(jìn)展[J] 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2010， 21（1）：208

[3]溫云飛 霍山石斛人工快繁及其活性成分的提取分離與結(jié)構(gòu)、藥理學(xué)檢測(cè)和誘導(dǎo)人癌細(xì)胞進(jìn)入Apoptosis過(guò)程的研究[D] 合肥：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)， 1998

[4]張丹丹，黃森，查學(xué)強(qiáng)，等 霍山石斛多糖對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用[J] 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2014， 33（5）：542

[5]張靜，連超群，吳守偉，等 霍山石斛提取物對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep2增殖和凋亡的影響及其機(jī)制[J] 中國(guó)生物制品學(xué)雜志， 2011， 24（5）：522

[6]鮑麗娟 四種石斛抗腫瘤活性的研究[D]合肥：合肥工業(yè)大學(xué)， 2007

[7]Ohashi Y， Watanabe M， Ikeda M， et al Regression of metastatic hepatic cancer from gastric cancer by polysaccharide K and UFT administration——a case report[J] Gan To Kagaku Ryoho， 2009， 35（13）：2409

[8]Hu K， Liu Q， Wang S， et al New oligosaccharides prepared by acid hydrolysis of the polysaccharides from Nerium indicum Mill and their antiangiogenesis activities[J] Carbohydr Res， 2009， 344（2）：198

[9]Liu X N， Zhang C Y， Jin X D， et al Inhibitory effect of schisandrin B on gastric cancer cells in vitro[J] World J Gastroenterol， 2007， 13（48）：6506

[10]黃靜， 李勝立， 趙宏偉，等 霍山石斛多糖對(duì)四氯化碳致急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用[J] 中國(guó)中藥雜志， 2013， 38（4）：528

[11]金樂(lè)紅， 劉傳飛， 唐婷，等 石斛多糖抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J] 中國(guó)藥學(xué)雜志， 2010， 45（22）：1734

[12]田長(zhǎng)城 霍山石斛保肝多糖的結(jié)構(gòu)表征與功效評(píng)價(jià)[D]合肥：合肥工業(yè)大學(xué)， 2015

[13]姜蘇薇 霍山石斛多糖對(duì)非酒精性脂肪性肝損傷的干預(yù)及改善作用研究[D]合肥：合肥工業(yè)大學(xué)， 2012

[14]崔洪霞，劉永利，蔣雪超，等香菇多糖聯(lián)合FOLFOX4化療方案對(duì)中晚期胃癌患者免疫功能和生活質(zhì)量的影響[J]中國(guó)醫(yī)藥，2015，10（7）：996

[15]荊雪寧，武繼彪 中藥多糖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J] 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2012， 32（8）：1149

[16]許愛(ài)華，陳華圣，孫步蟾，等 銀杏外種皮多糖對(duì)人胃癌細(xì)胞凋亡及其凋亡誘導(dǎo)基因表達(dá)的影響[J] 中藥藥理與臨床， 2003， 19（3）：11

[17]石億心，于蓮，翟美芳，等納米山藥多糖對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的作用[J]中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2016，33（8）：967

[18]楊燕萍，胡冬根 黃芪多糖對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用[J] 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志， 2001， 21（6）：589

[19]李丹青，肖強(qiáng)兵 巴戟天多糖通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路促間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的體外研究[J] 中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志， 2015（5）：1

[20]Wong V K C， Yu L， Chu C H Protective effect of polysaccharides from Angelica sinensis on ulcerative colitis in rats[J] Inflammopharmacology， 2008， 16（4）：162

[21]李曉冰，謝忠禮，朱艷琴，等 靈芝多糖抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展[J] 中國(guó)藥學(xué)雜志， 2013， 48（16）：1329

[22]季宇彬， 高世勇 羊棲菜多糖體外抗腫瘤作用及其作用機(jī)制的研究[J] 中草藥， 2003， 34（12）：1111

[23]吳梧桐，高美鳳，吳文俊 多糖的抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)天然藥物， 2003， 1（3）：182

[24]周慧萍，朱海燕，陳瓊?cè)A 滸苔多糖的分離、純化和分析[J] 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)， 1995（1）：91

[25]季宇彬，袁會(huì)成，高世勇，等 龍葵多糖細(xì)胞毒活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究[J] 中草藥， 2011， 42（11）：2275

[26]張秀娟，楊?yuàn)檴?半枝蓮多糖體內(nèi)抗腫瘤及其免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J] 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥， 2008， 4（2）：54

[27]Shim J U， Lim K T Inhibitory effect of glycoprotein isolated from Cudrania tricuspidata Bureau on expression of inflammationrelated cytokine in bisphenol Atreated HMC1 cells[J] Inflammation， 2009， 32（4）：211

[28]Sarkar K， Goswami S， Roy S， et al Neem leaf glycoprotein enhances carcinoembryonic antigen presentation of dendritic cells to T and B cells for induction of antitumor immunity by allowing generation of immune effector/memory response[J] Int Immunopharmacol， 2010， 10（8）：865

[29]劉主，朱必鳳，彭凌，等 甘薯糖蛋白SPG1抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用研究[J] 食品科學(xué)， 2007， 28（5）：312

[30]韓澄，聶少平，黃丹菲，等 茶葉糖蛋白調(diào)控樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖和CTL活性的影響[J] 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2011， 11（1）：7

[31]單保恩，鄭振海，張子杰，等 一種植物由來(lái)的糖蛋白（鄭氏植物蛋白）——腫瘤相同性抗原的研究[J] 中國(guó)免疫學(xué)雜志， 2003， 19（5）：328

[32]李海燕，齊永志，甄文超 河北省小麥紋枯病菌群體組成及致病力分化[J] 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2015， 42（4）：497

[33]葉振南，邵家坪 粗多糖的提取，分離及結(jié)構(gòu)研究[J] 中國(guó)藥事， 2000， 14（5）：329

[34]牛曉閣，汪森明，丁為民，等 Apogossypolone抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[J] 腫瘤， 2010， 30（12）：1022

[35]Yang J T， Cai W U， Ying L I， et al Identification and purification of an allergic glycoprotein from Ginkgo biloba Kernel[J] Agric Sci China， 2011， 10（4）：631

[36]Nie S X， Ming Y Study on the purification and chemical compositions of tea glycoprotein[J] Carbohydr Polym， 2008， 71（4）：626[責(zé)任編輯孔晶晶]2017年1月 第42卷第1期Vol42， No 1January， 2017

[收稿日期]20160909

[基金項(xiàng)目]河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H2014209214，H2015209094）

[通信作者]*莊鵬宇，博士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)，Tel：（0315） 3726311， Email：zhuangpengyu@163