韓霜　王曉丹　肖鋼　李瑞蓮　張振乾　鄔賢夢(mèng)　陳浩

摘要 miRNAs是內(nèi)源的小分子RNA，在生物體生長(zhǎng)發(fā)育、生物體代謝途徑以及抵抗生物或非生物脅迫中起著非常重要的作用。綜述了miRNA在水稻、玉米、油菜、棉花等主要農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控的應(yīng)用研究進(jìn)展，最后探討了miRNA未來(lái)研究熱點(diǎn)，并對(duì)其在農(nóng)作物研究中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 miRNA；農(nóng)作物；應(yīng)用；研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào) S5；Q522 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）21-0014-03

miRNAs（microRNA）在生物體生長(zhǎng)發(fā)育、生物體代謝途徑以及抵抗生物或非生物脅迫中起著非常重要的作用[1-2]。miRNA是內(nèi)源的小分子RNA，約占整個(gè)真核生物基因組基因總數(shù)的2%，能通過(guò)RNase Ⅲ的Dicer酶和/或α蛋白家族的精確剪切，產(chǎn)生具有反向重復(fù)的轉(zhuǎn)錄物[3]。植物miRNA通過(guò)與 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合，切割靶mRNA，介導(dǎo)靶DNA甲基化抑制靶mRNA的翻譯或來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)[4-5]，在植物生長(zhǎng)素信號(hào)、葉片發(fā)育、花器官形成等生命活動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控及植物響應(yīng)干旱、低溫等逆境生理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6-8]。

研究植物中miRNA功能的方法有如下幾種：一是生化與分子生物學(xué)方法測(cè)定miRNA指導(dǎo)下mRNA的剪切反應(yīng)的精確位點(diǎn)，該方法可將miRNA與其調(diào)控的生化反應(yīng)聯(lián)系在一起[4-5]；二是導(dǎo)入抗miRNA的靶基因，使原本被miRNA抑制的基因得到表達(dá)，植物的表型變化就可反映出miRNA的功能；三是通過(guò)上調(diào)miRNA的表達(dá)，然后從表型的變化分析miRNA的功能。綜述了該技術(shù)在農(nóng)作物研究中的應(yīng)用，以期為農(nóng)業(yè)科研研究提供參考。

1 在主要農(nóng)作物研究中的應(yīng)用

水稻、玉米、油菜、小麥等作為重要的糧食作物，miRNA在這些作物中生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用。

1.1 在水稻研究中的應(yīng)用

水稻是全球第二大糧食作物，miRNA的發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充了研究人員對(duì)水稻基因調(diào)控機(jī)制的理解。

1.1.1 水稻生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。Zhu Q等[9-11]研究表明，植物miRNA通過(guò)與靶基因的序列互補(bǔ)造成靶基因的降解或翻譯的阻斷，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源基因的負(fù)調(diào)控。在miRNA代謝途徑中，核酸酶Dicer和PPD家族蛋白Argonaute對(duì)于miRNA的合成發(fā)揮作用。

1.1.2 根的發(fā)育。在植物中，Meng Y等[12]對(duì)miRNA介導(dǎo)的生長(zhǎng)素信號(hào)途徑進(jìn)行了深入研究，如miR164、miR160等通過(guò)生長(zhǎng)素應(yīng)答因子（ARF）影響植物不定根的發(fā)生、側(cè)根的發(fā)育及根冠的形成。Meng Y等[12]研究證明，水稻中存在著miR390-TAS3-ARF2/ARF3/ARF4和miR167-ARF6/8-CH3通路來(lái)調(diào)控根的發(fā)育。此外，Bian H等[13-14]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá) miR393導(dǎo)致靶基因AFB2（Auxin signaling F-BOX）和TIR1（transport inhibitor response 1）的表達(dá)水平下調(diào)，出現(xiàn)了水稻根冠和主根增長(zhǎng)的表型。

1.1.3 花的發(fā)育。Yamaguchi等[15]研究表明，AP2（Apetala2）基因調(diào)控花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變，參與花器官的形態(tài)發(fā)育。Peng等[16]研究發(fā)現(xiàn)了miRNA在雄配子體發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制，并證明miR167和miR160能夠切割5種生長(zhǎng)素應(yīng)答因子ARF，這些ARF在花粉母細(xì)胞發(fā)育到二孢花粉粒的過(guò)程中高度表達(dá)。Zhu Q等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR172可以調(diào)控AP2基因，控制水稻花的發(fā)育。

1.1.4 幼穗的發(fā)育。Peng H等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)OsSPL14的轉(zhuǎn)基因水稻在生殖期促進(jìn)幼穗的分支，并提高水稻產(chǎn)量，而 miRNA156不能切割突變后的OsSPL14，突變水稻從而表現(xiàn)出產(chǎn)量提高、抗倒伏等性狀。Tong H等[18-19]研究表明，miRNA397通過(guò)下調(diào)編碼漆酶蛋白的OsLAC基因的表達(dá)。

1.1.5 分蘗。過(guò)表達(dá)miR393的轉(zhuǎn)基因水稻中出現(xiàn)分蘗數(shù)增加，同時(shí)水稻分蘗抑制因子OsTB1、生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)因子OsAUX1 以及生長(zhǎng)素受體因子（TIR1和AFB）表達(dá)水平均下調(diào)。據(jù)此推測(cè)，miR393的過(guò)表達(dá)可能通過(guò)抑制生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)因子和生長(zhǎng)素受體因子的表達(dá)，抑制了腋芽處分蘗抑制因子OsTB1的表達(dá)，最終引起分蘗的增加[10]。

1.1.6 種子發(fā)育。Lu S等[9，19]研究表明，在水稻種子發(fā)育相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，miRNA通過(guò)控制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成和運(yùn)輸發(fā)揮重要的作用。

1.1.7 胚的發(fā)育。Bian H等[13，16]研究培養(yǎng)水稻愈傷組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR156、miR397等miRNA在愈傷組織中表達(dá)水平較高，在水稻愈傷組織中miR156也可能是通過(guò)負(fù)調(diào)控OsSPL的表達(dá)，加快水稻胚的發(fā)育和細(xì)胞分裂。Xie K等[20]研究表明，miR160通過(guò)調(diào)控靶基因ARF17，造成異常胚胎對(duì)稱(chēng)。

1.2 在玉米研究中的應(yīng)用

1.2.1 籽粒。Chuck G等研究發(fā)現(xiàn) miRl68是下調(diào)表達(dá)，其靶基因是上調(diào)表達(dá)，miRl68的顯性抑制可能抑制其他miRNAs靶基因[21]。各種因素相互調(diào)控，使玉米雜交種最終表現(xiàn)出優(yōu)于親本的雜種優(yōu)勢(shì)。

1.2.2 根。Zhang等利用Solexa測(cè)序的方法對(duì)冠根miRNAs的測(cè)序發(fā)現(xiàn)，miR528在冠根中具有最高的表達(dá)量但在總根中表達(dá)量很低[22]；mil59、164、167、169、319和396家族在總根中表達(dá)量很高；miR156、166、167和168家族在玉米苗期總根大量表達(dá)；由此說(shuō)明miRNAs的表達(dá)豐度在不同類(lèi)型的根中存在顯著差異。Zhang L F等[23-25]研究發(fā)現(xiàn)，玉米中miR166的靶基因是HD-ZIP III基因，能夠調(diào)控側(cè)根生長(zhǎng)及種子成熟。

1.2.3 穗。張志明等[21]利用生物信息學(xué)挖掘玉米中的microRNA及其靶基因，通過(guò)與玉米EST 和GSS數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，共篩選到23條新的玉米miRNA。陶家風(fēng)等[22]以對(duì)紋枯病抗性不同的自交系R15和掖478為研究對(duì)象，初步探討miRNA與玉米抗真菌病害調(diào)控機(jī)制存在明顯的關(guān)系。唐朝榮等[22，26]推測(cè)miR171與細(xì)胞壁的抵抗能力有關(guān)聯(lián)。

Lauter N等[27]發(fā)現(xiàn)miR172已被證明能夠下調(diào)基因光澤15，促進(jìn)幼穗階段的維持。同時(shí)，Mallory等[28-31]研究miR172e可能會(huì)控制無(wú)限小穗1和姊妹無(wú)限小穗1，通過(guò)翻譯抑制和mRNA降解方式，對(duì)玉米莖尖細(xì)胞分化和小穗性別起決定作用。Allen E等[32-33]也發(fā)現(xiàn)，miR390通過(guò)切割反式作用干擾小RNA產(chǎn)生多片段，這些片段在一系列RNA酶作用下，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。

1.2.4 花瓣。Aukferman等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在玉米中miR156 a-1從玉米幼穗至成熟過(guò)渡階段可能作用于幾個(gè)Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白基因，可能是通過(guò)SPL間接地激活miR172；miR172功能的缺失將延遲花的發(fā)育或造成花發(fā)育異常，相比之下，過(guò)表達(dá)的miR172將導(dǎo)致花期提前。

1.3 在油菜研究中的應(yīng)用

1.3.1 灌漿。Yi R等[35]研究發(fā)現(xiàn)，miR164介導(dǎo)的生長(zhǎng)素調(diào)控機(jī)制能夠調(diào)控種子灌漿。

1.3.2 胚胎。Zhao等[36]研究發(fā)現(xiàn)，miR390通過(guò)反式作用反干擾小RNA介導(dǎo)的生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與了油菜早期胚胎的發(fā)育過(guò)程。

1.3.3 花瓣。Zhang Y等[37]也發(fā)現(xiàn)MADS-box因子在甘藍(lán)型油菜花瓣形成中扮演了重要的角色，miRNA靶基因也在抗生物和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。此外，還參與F-box蛋白、plantacyanin 類(lèi)蛋白（參與生殖和結(jié)實(shí)）和激素刺激蛋白降解（TIR1-like）的漆酶（細(xì)胞壁代謝酶）等。過(guò)表達(dá)Bna-miR1140甘藍(lán)型油菜株系表現(xiàn)開(kāi)花推遲、分枝增多，表明其參與調(diào)控甘藍(lán)型油菜生長(zhǎng)發(fā)育。

1.3.4 穗。Peng T等[38]研究發(fā)現(xiàn)，miR164是生長(zhǎng)素相關(guān)的miRNA，存在于水稻劣質(zhì)穗和優(yōu)質(zhì)穗中，且在優(yōu)質(zhì)穗中表達(dá)量更高。miR164通過(guò)靶向NAC轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)植物內(nèi)部生長(zhǎng)素平衡。

1.3.5 葉片。Han等[39]研究了甘藍(lán)型油菜旗葉和發(fā)育中的種子，一共有2 869個(gè)miRNA調(diào)控3 491個(gè)靶基因，而白菜中2 910個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)著4 591個(gè)靶基因，平均每個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因數(shù)目分別為1.2和1.6。在多倍體化后，每個(gè)miRNA的調(diào)控的靶基因的數(shù)目明顯增加，增強(qiáng)了多倍體物種的基因表達(dá)的調(diào)控的復(fù)雜性。已知的miRNA與新的miRNA調(diào)控的靶基因數(shù)目進(jìn)行比較，后者是前者的3倍多，說(shuō)明新的miRNA調(diào)控靶基因更復(fù)雜。Addo-Quaye C等[40]利用混合的甘藍(lán)型油菜根、莖、葉柄、葉片中RNA樣進(jìn)行高通量測(cè)序，共獲得包含有自由的5′單磷酸和3′polyA尾巴的 -20 ntRNA序列8 356 060條。

1.3.6 分枝。Fu Liang Xie等[41]研究miRNA參與調(diào)控油菜分枝形成和發(fā)育的遺傳控制機(jī)理，可以完善高等植物發(fā)育生物學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1.3.7 分子生物學(xué)研究。Addo-Quaye C等[40-42]前人研究表明，植物體內(nèi)絕大多數(shù)的miRNA是利用剪切作用調(diào)控靶基因的表達(dá)，且剪切常發(fā)生在miRNA 與mRNA互補(bǔ)區(qū)域的第10位核苷酸上，因此在mRNA序列的某個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)的波峰是候選的 miRNA剪切位點(diǎn)。Addo-Quaye C等[43]發(fā)現(xiàn)，大多已知的保守甘藍(lán)型油菜miRNA靶基因?qū)儆诓煌易宓霓D(zhuǎn)錄因子，諸如NAC域蛋白、NF-Y亞基、SPLs、ARFs、MYBs、MADS-box factors、SCLs、AP2-like factors。這些轉(zhuǎn)錄因子大多已被發(fā)現(xiàn)通過(guò)不同途徑參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。

1.4 在小麥研究中的應(yīng)用

韓 冉等[44]在known miRNA中，miR160、miR164、miR166和miR169在籽粒中偏愛(ài)性表達(dá)，miR164和miR160的豐度在5、10、20 d籽粒依次升高，而miR169的豐度卻依次降低，說(shuō)明不同miRNA在籽粒發(fā)育各個(gè)階段協(xié)調(diào)地發(fā)揮著不同的功能。Tang Y等[45]發(fā)現(xiàn)MiR164在5-d seed 中的豐度為135，但在20-dseed的豐度為244，這種差異說(shuō)明miR164在小麥籽粒發(fā)育過(guò)程中具有一定的作用。在Uauy C等[46]研究發(fā)現(xiàn)，miR168是總豐度最高的miRNA，且在各個(gè)組織中的表達(dá)差異也比較大。

2 前景展望

miRNAs是內(nèi)源的小分子RNA，處于基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)核心位置。在油菜、水稻等農(nóng)作物的根、花等器官發(fā)育方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，對(duì)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)改良有很重要的參考價(jià)值。

目前已經(jīng)取得了廣泛的研究，近年來(lái)，越來(lái)越多與種子發(fā)育相關(guān)的miRNA通過(guò)降解組測(cè)序、大規(guī)模平行測(cè)序、基因芯片等技術(shù)在多種植物中得到鑒定。參與種子發(fā)育的miRNA 及其靶基因目前已得到廣泛的研究。

未來(lái)的研究熱點(diǎn)：高通量測(cè)序技術(shù)[40-43]對(duì)miRNA作用的靶基因篩選有很好的促進(jìn)作用，結(jié)合生物信息學(xué)分析優(yōu)勢(shì)，確定降解片段與miRNA精確的配對(duì)信息。目前，在miRNA的調(diào)控機(jī)制方面的研究很少，因此今后研究的重點(diǎn)可能集中在此，利用miRNA研究改良作物的品質(zhì)和產(chǎn)量也將是今后研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

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