縱 帥，徐萍萍，顧 兵，郝婷婷，寇艷波，徐銀海

(1 徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院， 江蘇 徐州 221002； 2 徐州市中心醫(yī)院，江蘇 徐州 221002； 3 徐州醫(yī)科大學感染與免疫實驗室，江蘇 徐州 221004)

·論著·

徐州地區(qū)116株MRSA耐藥性分析與分子流行病學調查

縱 帥1，徐萍萍2，顧 兵1，郝婷婷1，寇艷波3，徐銀海1

(1 徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院， 江蘇 徐州 221002； 2 徐州市中心醫(yī)院，江蘇 徐州 221002； 3 徐州醫(yī)科大學感染與免疫實驗室，江蘇 徐州 221004)

目的 了解耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染現狀和耐藥機制，為臨床合理用藥提供依據。方法 收集徐州地區(qū)2012—2015年各類標本中分離的金黃色葡萄球菌(SA)，用頭孢西丁紙片擴散法初篩MRSA菌株，擴增mecA基因進行確認，K-B法檢測MRSA對藥物的敏感性，E-test法測定萬古霉素的最低抑菌濃度(MIC)，采用多重PCR進行葡萄球菌染色體mec(SCCmec)基因分型。結果 2012—2015年210株SA共檢出MRSA 116株，其中mecA基因陽性114株，MRSA總檢出率為55.24%。MRSA對萬古霉素、奎奴普丁/達福普汀、替考拉寧和利奈唑胺的敏感率均為100%，對氯霉素和呋喃妥因的耐藥率最低，分別為15.52%、1.72%，MRSA對10種抗菌藥物的耐藥率>80%；MRSA對青霉素類、氨基糖苷類、紅霉素、喹諾酮類、磺胺類、利福平、四環(huán)素、克林霉素的耐藥率高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)。2012—2015年萬古霉素對MRSA的MIC均為1.0 μg/mL，MIC90均為1.5 μg/mL，2015年發(fā)現1株MRSA的萬古霉素MIC為2.0 μg/mL。116株MRSA分型結果顯示，SCCmecII型11株(9.48%)，SCCmecIII型85株(73.28%)，SCCmecIV型4株(IVa和IVb型各2株，均為1.72%)，未分型MRSA 16株(13.79%)，未檢出SCCmecI和V型。結論 MRSA呈嚴重的多重耐藥，對萬古霉素MIC無漂移，臨床MRSA分離株以SCCmecIII型為主，臨床應采取感染控制措施，控制MRSA感染。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌； MRSA； 耐藥性； 最低抑菌濃度； MIC； 葡萄球菌染色體mec盒； SCCmec

[Chin J Infect Control，2017，16(2)：104-108]

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureu, MRSA)是目前引起醫(yī)院感染最重要的革蘭陽性菌之一，文獻[1]報道，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus,MSSA)獲得外源性mecA產生耐藥成為MRSA，存在于葡萄球菌染色體mec盒(SCCmec)的mecA基因編碼新的青霉素結合蛋白PBP2a，降低其與β-內酰胺類抗生素的親合力，而產生耐藥。SCCmec還可攜帶除mecA基因外的其他耐藥基因，造成多藥耐藥(multidrug-resistance， MDR)。SCCmec目前主要分為8型，基因型與MRSA的流行背景有關，不同SCCmec型別的菌株結構、耐藥性和流行特點不同，不同地區(qū)的SCCmec基因型分布可能不同。本研究對徐州地區(qū)的MRSA進行相關實驗，明確本地區(qū)MRSA的耐藥表型和分子流行病學特征，為臨床提供相關依據。

1 對象與方法

1.1 菌株來源 210株金黃色葡萄球菌(SA)分離自本地區(qū)4所三級綜合性醫(yī)院2012—2015年臨床送檢的痰、血和分泌物等標本，經培養(yǎng)、分純和微生物全自動鑒定系統鑒定，除去同一患者分離的重復菌株，初步鑒定為MRSA后-80 ℃保存。質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213，購自國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心，MRSA陽性對照菌株為北京大學人民醫(yī)院王輝教授饋贈。

1.2 主要試劑與儀器 VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定分析系統為法國生物梅里埃公司產品，MyCycler PCR熱循環(huán)儀、電泳儀和凝膠成像系統均為美國伯樂(Bio-Rad)公司產品，TaKaRa PCR Amplification Kit和瓊脂糖購自寶生物工程(大連)有限公司，GelGreen核酸染料和DL2000 Plus DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司，所有藥敏紙片為英國OXOID公司產品，E-test試紙條為法國生物梅里埃公司產品，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 藥敏試驗 紙片擴散法(K-B法)檢測MRSA對臨床常用的19種抗菌藥物的敏感性，檢測抗菌藥物為青霉素、苯唑西林、阿莫西林、氧氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、克林霉素、慶大霉素、四環(huán)素、磺胺甲口惡唑、復方磺胺甲口惡唑、氯霉素、利福平、呋喃妥因、奎奴普丁/達福普汀、替考拉寧和利奈唑胺。所有折點判斷采用美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2015標準。

1.4 初步鑒定 采用CLSI 2015版標準推薦的頭孢西丁(30 μg/片)K-B法，紙片抑菌環(huán)直徑≤21 mm判定為MRSA。

1.5 萬古霉素MIC檢測 選用萬古霉素E-test試劑條對初步鑒定的MRSA進行MIC測定。根據MIC測定結果，分別統計出MIC幾何均值、MIC50、MIC90和MIC范圍。

1.6 MRSA確認試驗 初步鑒定的菌株采用煮沸法提取基因組DNA，利用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度，用PCR擴增mecA基因。PCR反應體系為25 μL，內含2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL、250 nmol/L上下游引物各0.5 μL、5 U/μL TakaRa-Taq酶0.25 μL、100 ng DNA模板0.5 μL、10×PCR緩沖液(pH8.3)2.5 μL，余用滅菌蒸餾水補齊。PCR反應條件：94℃10 min預變性；94℃ 30 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72℃再延伸5 min。PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠(含1%GelGreen)中電泳，電壓5 V/cm，電泳30 min，在凝膠成像系統成像。引物見表1。

1.7 SCCmec基因分型 用多重PCR進行SCCmec基因分型，參照Zhang等[2]的方法進行。PCR反應體積為50 μL，包括2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，250 nmol/L上下游引物各0.5 μL，5 U/μL TakaRa-Taq酶 0.5 μL，DNA模板各1 μL，10×PCR緩沖液(pH 8.3)5 μL，余用滅菌蒸餾水補齊。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。PCR產物在瓊脂糖凝膠中電泳，電泳條件同mecA基因。引物見表1。

表1mecA 及SCCmec基因PCR擴增引物及其產物大小

Table 1 PCR amplification primer and size of products ofmecA and SCCmecgenes

目的基因引物序列(5’-3’)產物長度(bp)mecAF:GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA310R:CCAATTCCATGTTTCGGTCTAASCCmecIF:GCTTTAAAGAGTGTCGTTACAGG613R:GTTCTCTCATAGTATGACGTCCSCCmecIIF:CGTTGAAGATGATGAAGCG398R:CGAAATCAATGGTTAATGGACCSCCmecIIIF:CCATATTGTGTACGATGCG280R:CCTTAGTTGTCGTAACAGATCGSCCmecIVaF:GCCTTATTCGAAGAAACCG776R:CTACTCTTCTGAAAAGCGTCGSCCmecIVbF:TCTGGAATTACTTCAGCTGC493R:AAACAATATTGCTCTCCCTCSCCmecIVcF:ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC200R:TTGGTATGAGGTATTGCTGGSCCmecIVdF:CTCAAAATACGGACCCCAATACA881R:TGCTCCAGTAATTGCTAAAGSCCmecVF:GAACATTGTTACTTAAATGAGCG325R:TGAAAGTTGTACCCTTGACACC內標基因mecA147F:GTGAAGATATACCAAGTGATT147R:ATGCGCTATAGATTGAAAGGAT

1.8 統計學方法 應用WHONET 5.6軟件和SPSS 11.5軟件對數據進行分析，率的比較采用χ2檢驗，MIC均值比較采用方差分析。

2 結果

2.1 MRSA檢出率 經頭孢西丁紙片初篩試驗，2012—2015年210株SA共檢出116株MRSA，檢出率為55.24%；4年分別檢出MRSA 23、25、33、35株，檢出率分別為57.50%、52.08%、56.90%、54.69%，4年間檢出率比較，差異無統計學意義(χ2=0.35，P=0.95)。見表2。

表2 2012—2015年分離的SA中MRSA檢出情況

Table 2 Detection of MRSA among SA isolated in 2012-2015

年份SA株數MRSA株數檢出率(%)χ2P2012402357.500.350.952013482552.082014583356.902015643554.69合計21011655.24

2.2 藥敏試驗結果 MRSA對萬古霉素、奎奴普丁/達福普汀、替考拉寧和利奈唑胺的敏感率為100%；MRSA對氯霉素和呋喃妥因的耐藥率最低，分別為15.52%和1.72%，MRSA對檢測的10種抗菌藥物的耐藥率>80%。MRSA對青霉素類、氨基糖苷類、紅霉素、喹諾酮類、磺胺類、利福平、四環(huán)素、克林霉素的耐藥率高于MSSA，差異均有統計學意義(均P<0.01)。見表3。

表3 MRSA和MSSA對20種抗菌藥物的耐藥率(%)

Table 3 Resistance rates of MRSA and MSSA to 20 kinds of antimicrobial agents(%)

抗菌藥物MRSA(n=116)MSSA(n=94)χ2P青霉素100.0081.9122.830.00苯唑西林100.000.00210.000.00阿莫西林94.8315.96134.060.00慶大霉素85.3411.70112.890.00萬古霉素0.000.00--替考拉寧0.000.00--奎奴普丁/達福普汀0.000.00--利奈唑胺0.000.00--四環(huán)素82.7625.5369.440.00氯霉素15.528.512.350.13紅霉素87.0747.8737.650.00克林霉素69.8339.3619.580.00環(huán)丙沙星88.7921.2897.540.00氧氟沙星93.9712.77140.200.00諾氟沙星90.5214.89120.930.00左氧氟沙星88.795.32144.840.00呋喃妥因1.720.00-0.50*復方磺胺甲口惡唑60.3428.7220.890.00磺胺甲口惡唑56.9029.7915.430.00利福平38.796.3829.660.00

*：采用Fisher 精確概率法

2.3 萬古霉素對MRSA的MIC 2012—2015年萬古霉素對MRSA 的MIC50均為1.0 μg/mL，MIC90均為1.5 μg/mL；2012—2014年MIC 范圍為(0.5～1.5)μg/mL，2015年MIC 范圍為(0.5～2.0)μg/mL。2015年發(fā)現1株MRSA的萬古霉素MIC為2.0 μg/mL；2012—2015年萬古霉素對MRSA的MIC幾何均值分別為1.15、1.09、1.24和1.26 μg/mL，4年幾何均值總體比較，差異無統計學意義(F=2.35，P=0.18)。見表4。

表4 2012—2015年萬古霉素對MRSA的MIC(μg/mL)

Table 4 MICs of vancomycin to MRSA strains in 2012-2015(μg/mL)

年份MIC范圍MIC的幾何平均值MIC50MIC9020120.5～1.51.151.01.520130.5～1.51.091.01.520140.5～1.51.241.01.520150.5～2.01.261.01.5

2.4 MRSA確認試驗 116株頭孢西丁檢測為MRSA，其中114株菌mecA基因PCR擴增為陽性，在310 bp有目的條帶。見圖1。

M：DL2000 DNA Marke；1：陰性對照；2：陽性對照；3—16：臨床菌株mecA基因陽性

圖1 MRSAmecA基因PCR產物電泳圖

Figure 1 PCR product electrophoresis map of MRSAmecA gene

2.5 SCCmec分型結果 116株MRSA多重PCR分型結果顯示，SCCmecII型11株(9.48%)，SCCmecIII型85株(73.28%)，SCCmecIV型4株(IVa和IVb型各2株，均為1.72%)，僅內標基因陽性的未分型MRSA 16株(13.79%)，未檢出SCCmecI和SCCmecV型。見圖2。

M：DL2000 DNA Marker； 1：陰性對照；2—3：未分型；4—5：SCCmecII型；6—7：SCCmecIII型；8—9：SCCmecIVa型；10—11：SCCmecIVb型

圖2 MRSA SCCmec多重PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure 2 Agarose gel electrophoresis map of multiplex PCR product of MRSA SCCmec

3 討論

MRSA是目前世界性醫(yī)院感染的重要病原菌，多呈多重耐藥，MRSA感染的治療是臨床十分棘手的難題。本研究210株SA檢出116株MRSA，檢出率為55.24%，2012—2015年檢出率比較，差異無統計學意義，在國內外處于較高水平[3-4]，高檢出率除與規(guī)范化送檢有關外，還提示該地區(qū)MRSA感染情況較嚴重。研究[5]表明，地區(qū)性的持續(xù)性協同預防和數據監(jiān)測可以有效阻斷MRSA傳播。

藥敏試驗結果顯示，MRSA對氯霉素和呋喃妥因的耐藥率最低，分別為15.52%、1.72%，MRSA對檢測的10種抗菌藥物的耐藥率>80%，說明多重耐藥情況嚴重。MRSA對萬古霉素、奎奴普丁/達福普汀、替考拉寧和利奈唑胺的敏感率為100%，未發(fā)現耐藥株，可作為MRSA感染初次治療的首選藥物。本研究中MRSA耐藥率高于MSSA，表明MRSA的耐藥情況總體比MSSA更嚴重，且MRSA感染可導致更高的病死率和更長的住院時間[6]，MRSA形成機制使其更易發(fā)生醫(yī)院感染，因此臨床治療MRSA感染時要重視藥敏試驗，根據藥敏結果合理選用抗菌藥物，同時根據患者感染情況制定差異化治療方案[7]，防止或延緩強耐藥株的出現。

萬古霉素仍是目前臨床治療MRSA的最重要抗菌藥物，臨床上將萬古霉素對MRSA仍敏感但其MIC逐年上升的現象稱 “MIC漂移”。 本研究發(fā)現本地區(qū)2012—2015年萬古霉素MIC未發(fā)生漂移，但隨著萬古霉素使用劑量、時間、強度和頻度的增加，萬古霉素對MRSA耐藥壓力選擇增加，不能排除本地區(qū)對MRSA的敏感性有下降趨勢。萬古霉素MIC≥1.5 μg/mL稱為高MIC。研究[8]表明，高MIC與MRSA感染患者治療失敗率和病死率密切相關，高MIC存在潛在的治療失敗風險。臺灣地區(qū)對123例MRSA感染患者的研究[9]結果表明，萬古霉素MIC為2 μg/mL的患者平均住院時間、醫(yī)療費用和病死率均高于MIC<2 μg/mL的患者，因此應監(jiān)控高MIC MRSA感染者，尤其是萬古霉素MIC為2 μg/mL的，降低其感染病死率。

SA獲得外源性基因mecA成為MRSA，因此把mecA基因作為MRSA的分子標志，作為鑒定MRSA的“金標準”[10]。近年發(fā)現，MRSA形成除與mecA基因有關外，某些MRSA還表達mecA同源性基因mecB和mecC[1，11]，MRSA形成機制復雜。本研究經頭孢西丁紙片擴散法116 株SA鑒定為MRSA，其中114株攜帶mecA基因，兩種方法符合率為98.28%，另2株經頭孢西丁紙片擴散法(K-B法)、苯唑西林MIC法和PBP2α膠乳凝集法檢測均鑒定為MRSA，提示 MRSA存在除mecA外的其他耐藥機制。

SCCmec是一種攜帶mecA基因的可移動遺傳元件，根據其復合體組成不同可將SCCmec分為11個亞型[12]，其中SCCmecI—V型是常見的類型。本研究根據SCCmec各亞型的特異性片段設置引物，通過多重PCR擴增常見的5種SCCmec基因型，多重PCR產物電泳結果除內標基因外，每株細菌僅擴增出一個特異性片段，提示本研究所有分型菌株均只攜帶SCCmec的1個亞型，其中SCCmecIII型占73.28%，為最主要型別，SCCmecII基因型占9.48%，另有4株為SCCmecIV。116株MRSA菌株中100株(86.21%)屬SCCmecII-IV型，與國內某些地區(qū)研究[13]結果相似，但基因型存在明顯的地區(qū)性差異，如杭州地區(qū)SCCmec基因分型以Ⅱ型為主，III型次之[14]。有研究發(fā)現，SCCmecII型基因和SCCmecIII型基因分子結構長，攜帶多種耐藥基因[11]，與多重耐藥相關，是主要的MRSA型別。本組MRSA對多數抗菌藥物耐藥率均>50%，除氯霉素和呋喃妥因外，MRSA耐藥率均高于MSSA(均P<0.01)，進一步提示MRSA嚴重的多重耐藥可能與攜帶mecA及其他耐藥基因相關。

本組研究檢測了徐州地區(qū)MRSA的耐藥表型，萬古霉素MIC漂移情況和SCCmec基因型，對確定本地區(qū)MRSA優(yōu)勢菌株的分子流行病學特征、臨床治療和感染控制均具有重要意義。

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(本文編輯：豆清婭)

Antimicrobial resistance and molecular epidemiology of 116 strains of methicillin-resistantStaphylococcusaureuin Xuzhou area

ZONGShuai1,XUPing-ping2,GUBing1,HAOTing-ting1,KOUYan-bo3,XUYin-hai1

(1TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221002,China； 2XuzhouCentralHospital,Xuzhou221002,China； 3InfectionandImmunityLaboratoryofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,China)

Objective To investigate infection status and antimicrobial resistance mechanism of methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA)，and provide reference for the rational antimicrobial use in clinic. MethodsStaphylococcusaureus(SA) isolated from various specimens in Xuzhou area in 2012-2015 were collected, MRSA strains were preliminarily screened by cefoxitin disk diffusion method, and confirmed by amplification ofmecA gene, antimicrobial resistance of MRSA was determined by Kirby-Bauer method, minimal inhibitory concentration (MIC) was measured by E-test method, genotypes of staphylococcal chromosomal cassettemec(SCCmec) were determined by multiplex PCR. Results A total of 116 strains of MRSA were identified among 210 SA strains in 2012-2015，114 of which were positive formecA gene, the total detection rate of MRSA was 55.24%. Susceptibility rates of MRSA to vancomycin， quinupristin/ dalfopristin, and linezolid were all 100%， resistance rates of MRSA to chloramphenicol and furantoin were both low, which were 15.52% and 1.72% respectively, resistance rates of MRSA to 10 kinds of antimicrobial agents were all>80%; resistance rates of MRSA to penicillins, aminoglycosides, macrolides, quinolones, sulfanilamide, rifampicin, tetracycline, and clindamycin were all higher than methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus(MSSA). MICs of vancomycin to MRSA in 2012-2015 were all 1.0 μg/mL，MIC90were all 1.5 μg/mL， one MRSA isolate was with a vancomycin MIC of 2.0 μg/mL in 2015. MRSA typing results of 116 MRSA isolates showed that SCCmecII, SCCmecIII， and SCCmecIV accounted for 9.48%(n=11), 73.28%(n=85)，and 1.72%(Iva,n=2; IVb,n=2) respectively, 13.79%(n=16) of MRSA isolates were nontypeable, SCCmecI and SCCmecV type strains were not found. Conclusion MRSA is seriously multidrug-resistant，the drift has not been discovered in MIC value of vancomycin against MRSA, the major SCCmecgenotype of MRSA is SCCmecIII， infection control measures should be taken to control MRSA infection.

methicillin-resistantStaphylococcusaureus; MRSA; drug resistance; minimal inhibitory concentration; MIC; staphylococcal chromosomal cassettemec； SCCmec

2016-05-30

徐州市科技局資助項目(KC14SH116)

縱帥(1981-)，男(漢族)，江蘇省徐州市人，主管檢驗師，主要從事臨床微生物檢驗和細菌耐藥機制研究。

徐銀海 E-mail：1755789156@qq.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.02.002

R181.3+2 R378.1+1

A

1671-9638(2017)02-0104-05