解潤芳 李玉雯 解繼明

綜述

免疫組化技術在氯胺酮誘導致精神分裂癥中的應用進展

解潤芳 李玉雯 解繼明

本文闡述了精神分裂癥的發(fā)病機制，提出了用新型毒品氯胺酮建立精神分裂癥SD大鼠動物模型，并提出用免疫組化技術對大鼠海馬及前額葉皮質區(qū)的精神分裂癥陽性細胞進行定位的方法，同時也講述了免疫組化技術的應用，這將為精神分裂癥的鑒定及個性化治療提供依據(jù)。

精神分裂癥；氯胺酮；動物模型；免疫組化

作者單位：650500 昆明，昆明醫(yī)科大學法醫(yī)學院（解潤芳）；650011昆明，云南省第三人民醫(yī)院（李玉雯，解繼明）（通訊作者：解繼明，E-mail: 1196531552@qq.com）

1 精神分裂癥

精神分裂癥病例臨床發(fā)病機制過于復雜，由于未能深入了解其細胞生物學特征以及發(fā)病機制等信息，因此在病因學的專項研究方面還處于滯后狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，NMDA型受體拮抗劑所致精神分裂癥臨床癥狀較之于DA受體激動劑而言更為廣泛，以苯環(huán)利定為例，該藥物除了可能使機體出現(xiàn)陽性癥狀外，還可能會有認知功能降低問題、陰性癥狀等同時出現(xiàn)。而通過分析精神分裂癥病例，發(fā)現(xiàn)當動物或者人應用聯(lián)苯西平、苯環(huán)利定或者氯胺酮等谷氨酸NMDA型的受體拮抗劑后，其行為會出現(xiàn)異常，而且伴隨著精神分裂癥相關疾病癥狀出現(xiàn)。氯胺酮在臨床上屬于苯環(huán)己哌啶物質的一種衍生物，同時還是NMDA型受體拮抗劑中的一種非競爭性藥物，不僅會使動物或者人出現(xiàn)妄想癥狀或者幻聽癥狀等陽性癥狀，而且還可能有認知缺陷問題、情感淡漠問題等陰性癥狀等出現(xiàn)。針對此情況，針對該疾病，通過制作專業(yè)動物模型，并以猴以及嚙齒動物為對象，觀察其特征，發(fā)現(xiàn)其應用NMDA型受體拮抗劑后，會有拒絕社會交往行為、多動問題、認知運動異常問題、動作呆板行為等發(fā)生，以至于精神分裂癥相關疾病癥狀出現(xiàn)。本文提出用新型毒品氯胺酮建立精神分裂癥的SD大鼠模型，此模型能更好地模擬精神分裂癥的陰性及陽性癥狀。

1.1 精神分裂癥病理、生理的基本部位以及生化指數(shù)研究 有神經精神遺傳的研究者Weinberger調查研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥即大腦內最高層級的信息整理過程發(fā)生異常，主要表現(xiàn)在患者本身的神經系統(tǒng)皮層微循環(huán)的生長及平穩(wěn)性出現(xiàn)異?；蚴鞘軗p。大量臨床資料結果顯示，前額葉皮層（prefrontal cortex,PFC）于NMDA受體拮抗劑引發(fā)的人類與動物罹患的精神分裂癥樣病癥中起關鍵作用。NMDA受體大多出現(xiàn)在PFC的外部區(qū)域內，而PFC即NMDA受體拮抗劑引發(fā)的精神分裂癥這一疾病的病理及生理基本部位，急性予以NMDA受體拮抗劑可以提升大鼠PFC內Glu的擴散，讓細胞之外的谷氨酸濃度提升，進而發(fā)揮興奮型神經毒性功能。當前，精神分裂癥患者還沒有普遍認證的特異型生化指數(shù)。有研究指出精神分裂癥患者本身的血清肌酸激酶（creatine kinase,CK）濃度對比普通人而言更多[8-11]。之后，又有研究提出急性功能型精神病初始階段的血清肌酸磷酸激酶（creatine phosphokinase,CPK）濃度也會上升。Meltzer氏提出了精神分裂癥患者本身的CPK活性上升，其一是于精神病出現(xiàn)的第1周；其二是需要長期住院進行治療及需要大劑量的神經鎮(zhèn)定性藥品進行治療；最后是伴隨精神行為量表值上升，且引發(fā)很多幻覺與興奮狀況。近幾年各個國家的資料均表明，精神分裂癥患者本身會出現(xiàn)一氧化氮（nitric oxide,NO）的水平異常。

1.2 MAPK信號轉導通路及其與精神分裂癥的相關性 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）主要存在于哺乳動物細胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其是當前臨床已知的一種信號轉導通路分子，此種信號通路包括6個亞類：SAPK/JNK通路、ERK1/ERK2通路、ERK5通路、P38MAPK通路、ERK7通路以及MOK通路；其中，細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）通路是當前臨床研究中最活躍的一種信號轉導通路；其能夠有效調節(jié)細胞分化、增殖等生物反應，除此之外，此種通路還能夠對行為反應以及記憶、學習等認知方面起到關鍵性的作用。MAPK通路能夠由多種激化因子活化，而一旦ERK通路激活以后，此通路中各組分，特別是激活以前、激活以后通路組分亞細胞的定位改變，信號激活持續(xù)的強度和時間，支架蛋白和通路擔保之間相互的作用以及和其他通路交叉影響等均能夠參與到即刻早期基因（immediate early genes,IEG）編碼蛋白穩(wěn)定性的調節(jié)中，進而誘導出更為寬泛的下游蛋白表達，并在細胞生理應答調節(jié)中起到中藥的作用。

大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂患者的小腦蚓部MAPK表達的水平呈增高的趨勢，有學者通過基因工程法研究I型神經纖維母細胞瘤（nerve fibroblastoma type-I,NF1）和神經發(fā)育遲緩相關性時發(fā)現(xiàn)，海馬Ras/ERK信號通路缺損和學習功能下降呈正相關。近幾年來，隨著臨床研究的深入，腦內長時程增強形成、MAPK/ERK信號通路和學習極易的功能之間存在重要的關聯(lián)。且愈來愈多的研究對信號分子ERK功能有了更進一步的認識，為ERK信號通路能夠參與到記憶形成的神經元可塑性中是研究最重要的一個發(fā)現(xiàn)。另有學者研究還發(fā)現(xiàn)，在注射PCP的精神分裂大鼠中，PCP呈現(xiàn)出劑量依賴性上調ERK2、ERK1磷酸化水平；此種研究結果僅僅出現(xiàn)在大鼠小腦部位，而大鼠腦干、額前葉皮質、海馬部位均未出現(xiàn)上調的情況；由此表明，精神分裂發(fā)展與發(fā)展和MAPK信號通路呈正相關。

2 免疫組化

免疫組化是應用了抗體與抗原特異性的結合原理，此原理作為免疫學最基本的原理，其主要是經化學反應對標記抗體進行顯色，以此來確定組織內的細胞抗原，并對其行定性、定位、相對定量研究；臨床中將其稱之為免疫組織化學技術（immunohistochemistry）或免疫細胞化學技術（immunocytochemistry）[1]。

2.1 免疫組化分類 免疫組化的化學技術和分類可依據(jù)標記物種類進行劃分，共分5種：一是免疫熒光技術；二是免疫酶細胞化學法；三是免疫金法；四是免疫天蛋白技術；五是放射免疫自顯影法。這些常用免疫組織化學方法的原理如下：①免疫熒光細胞化學法：此種方法主要是在已知的抗體上，標記熒光素，以此當作探針來檢驗組織或細胞內相應抗原，并在熒光顯微鏡下進行觀察；一旦抗原抗體復合物當中的熒光素受到激發(fā)光照射就會自動發(fā)出波長熒光，進而對組織中抗原定量與定位進行研究和確定。②免疫酶細胞化學法：此種方法是當前免疫組織化學檢驗及研究時最常用的一種；其運用的原理主要是通過酶標記抗體和組織或者細胞作用，將酶底物加入進去，使之產生有色、不溶性地產物，再采用電鏡或光鏡對組織或細胞內相應抗原行定性或定位的研究。③免疫膠體金技術：是用膠體金標記一抗、二抗或其他的能特異性的結合免疫球蛋白的分子等作為探針對組織或細胞內的抗原進行定性、定位或定量研究。

2.2 標本、抗體及常用染色方法[2]①標本：臨床實驗檢驗中所選用的標本主要包括兩大類，一類是組織標本：此標本主要進行的是冰凍與石蠟切片，而石蠟切片主要進行病理切片以及組織芯片；另一大類則是細胞標本：此種標本中囊括了細胞爬片、組織印片以及細胞涂片。在所有的標本中，最為常用且最基礎的制作標本的方法是石蠟標本，其能夠很好地保存組織形態(tài)，而且還能夠進行連續(xù)切片，更好地觀察各種染色對照；除此之外，石蠟標本還能夠進行長期的存檔，以供后期回顧性的研究。而在對石蠟切片進行制作時，組織內的抗原暴露會受到一定影響；但可以對其進行修復，因此，石蠟切片是免疫組化組織標本制作的首選方法。②抗體：在免疫組化檢驗中，常用抗體主要有兩種，一種是單克隆的抗體：此種抗體屬于B淋巴細胞克隆分泌抗體，多用于細胞融合雜交瘤免疫動物的制備過程中；一種是多克隆的抗體：此種抗體主要針對的是純化以后抗原的直接免疫動物，從此種動物的血液中獲取免疫血清；多克隆抗體主要是由多種B淋巴細胞克隆后產生的一種抗體混合物[3]。③常用染色方法：此種方法主要是根據(jù)不同標記物進行分型，可分為親和組織化學法、免疫酶標法以及免疫熒光法；其中，親和組織化學法主要是建立在一種物質對于某種組織成分有較高的親合力上來進行檢測；且此種檢測方法的敏感度較高，能夠更有效地定位亞細胞或細胞中微量抗體（抗原）；而另外一種生物素-抗生素染色方法是臨床最為常用的[4,5]。

2.3 操作步驟 ①將石蠟進行切片后脫蠟為水。②3%H2O2室溫孵育5 min-10 min，其目的在于將內源性過氧化物酶活性進行消除；③用蒸餾水進行沖洗，PBS浸泡5 min×2（對于需進行抗原修復者，可在此步驟結束后實施修復）。④用5%-10%的正常山羊血清進行封閉以后，放置在室溫下進行10 min的孵育，將血清傾倒，但不要進行清洗。滴加一抗工作液，37oC孵育1 h-2 h或4oC過夜。⑤PBS沖洗，5 min×3次。⑥滴加適量生物素標記二抗工作液，37oC孵育10 min-30 min。⑦PBS沖洗，5 min×3次。⑧滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37oC孵育10 min-30 min。⑨PBS沖洗，5 min×3次。⑩顯色劑顯色3 min-15 min（DAB或NBT/BCIP）。自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

2.4 臨床應用 近年來，隨著免疫組織化學技術的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn)，使許多疑難疾病得到了明確診斷。在常規(guī)疑難疾病理診斷中，5%-10%的病例單靠HE染色難以作出明確的形態(tài)學診斷。免疫組化在疑難疾病診斷和鑒別中的實用價值受到了普遍的認可，其在低分化或未分化疑難疾病的鑒別診斷時，準確率可達50%-75%。

臨床應用免疫組織化學的方面有以下幾個：①對惡性腫瘤進行鑒別與診斷；對轉移性惡性腫瘤原發(fā)的部位進行確定；③進一步對某種腫瘤進行病理分型；④治療軟組織腫瘤時，通常需要精準的組織學分型，但由于組織學的種類較多、組織的形狀較為相似，使得組織來源區(qū)分難度較高；而將多種類型的標志行免疫組化研究，能夠有效確診軟組織腫瘤；⑤使用免疫組織化學檢測能夠及時發(fā)現(xiàn)微小的轉移灶，進而確診臨床治療方案以及手術的范圍；⑥為臨床提供治療方案的選擇[6-8]。

3 研究現(xiàn)狀及展望

病理科作為臨床最為重要的一個部門，其檢查質量的高低對于疾病的治療和預后尤為關鍵[9-11]；免疫組化技術是病理科的一種重要檢查技術，其不僅能夠對疑難病例診治提供有利的依據(jù)，而且還能夠對腫瘤治療與藥物選擇提供指導的依據(jù)。當前我國大型醫(yī)院中，均已經開始運用自動化免疫組化染色儀器進行檢查；但部分中小型的醫(yī)院依然使用人工進行操作。

人體抗原與抗體結合之間有較好的特異性，而免疫組織化學正是運用了此原理將細胞與組織化學物質進行提取以后作為抗原，以進行動物抗體的刺激，進而檢測刺激以后的組織與細胞產生抗體以及組織和細胞同類的抗原[12-14]。免疫組化技術環(huán)節(jié)與過程相對較多，且內容復雜，關鍵步驟符合標準后獲得的檢驗結果才能夠有效可靠，因此看似簡單的技術，其實不是非常容易掌握的?，F(xiàn)在的科學技術發(fā)展快速，臨床中對于醫(yī)護人員的能力要求也是越來越高，對各項標準和規(guī)范認真的執(zhí)行，才可以促進免疫組化的發(fā)展，讓患者的臨床治療獲得可靠的幫助。

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Application of immunohistochemistry in ketamine induced schizophrenia

Runfang XIE1,Yuwen LI2,Jiming XIE2

1School of Forensic Medicine,Kunming Medical University,Kunming 650500,China;2Yunnan Third People's Hospital,Kunming 650011,China

This paper described the pathogenesis of schizophrenia,proposed the use of new drug ketamine to establish schizophrenia SD rat animal model,and proposed by immunohistochemistry on the hippocampus and prefrontal cortex of schizophrenia positive cells,and the application of immunohistochemistry,which will provide the basis for the identification and personalized treatment of schizophrenia.

Schizophrenia; Ketamine; Animal model; Immunohistochemistry

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學應用基礎研究聯(lián)合專項基金項目（No.2014FB013和No.2016FZ007）