張科東，朱彩俠，劉小科

·論 著·

羧甲司坦對氣道黏蛋白Muc5AC的抑制作用研究

張科東1，朱彩俠2，劉小科1

目的 研究羧甲司坦對急性肺損傷小鼠氣道黏蛋白的抑制作用。方法 用脂多糖(LPS)刺激C57小鼠，建立急性肺損傷(ALI)的動物模型，同時用羧甲司坦進行干預，實驗共分為4組：正常對照組、LPS組、羧甲司坦組和LPS+羧甲司坦組。采用細胞分類計數法觀察各組小鼠BALF中炎性細胞的分布變化，酶聯免疫吸附測定(ELISA)等方法檢測羧甲司坦對ALI小鼠肺泡灌洗液(BALF)中黏蛋白Muc5AC、腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達水平的影響。結果 正常對照組小鼠BALF中淋巴細胞占絕大多數，單獨給予羧甲司坦對BALF細胞分布無影響；LPS所致的ALI小鼠BALF中炎性細胞總數明顯增加，且以中性粒細胞占多數，羧甲司坦能夠明顯抑制ALI小鼠BALF中炎性細胞總數及中性粒細胞數；羧甲司坦能夠明顯抑制ALI小鼠BALF中氣道黏蛋白Muc5AC及TNF-α的表達水平。結論 羧甲司坦能夠明顯抑制ALI小鼠氣道炎性細胞及炎性因子TNF-α的表達水平，同時明顯降低氣道Muc5AC的表達水平。

羧甲司坦；Muc5AC；急性肺損傷；抑制作用

氣道黏液高分泌是多種急慢性呼吸系統(tǒng)疾病的共同特點[1]，黏蛋白是氣道黏液的重要組成部分，持續(xù)的氣道黏液過度分泌以及流變學特性的改變會導致黏液纖毛清除功能受損、喪失，使細菌定植成為可能，甚至發(fā)生炎性改變。過多的黏液還會導致小氣道阻塞、氣流受限、氣體交換功能障礙等，導致氣道炎癥遷延難愈[2]。羧甲司坦(carbocisteine，CAR)是經典的氣道黏液溶解劑[3]，但其對氣道黏蛋白的作用機制目前并不清楚。本研究通過用羧甲司坦干預急性肺損傷(ALI)的小鼠模型，發(fā)現羧甲司坦能夠明顯抑制氣道炎性細胞數量及黏蛋白Muc5AC的表達水平，從而減少氣道黏液的分泌，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料：健康雄性C57小鼠，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，6～8周齡，體重20～23 g，無特定病原體(SPF)級環(huán)境中喂養(yǎng)，實驗獲得廣州醫(yī)科大學動物管理和使用委員會批準。

1.2 主要試劑：羧甲司坦粉劑由廣州白云山制藥有限公司捐贈(純度≥99%)，脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司，小鼠抗Muc5AC抗體購自美國Abcam公司，小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒購自美國Ebioscience公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組：將小鼠按照隨機數字表分為4組，分別為正常對照組、羧甲司坦組、LPS組和LPS+羧甲司坦組，每組8～10只小鼠。正常對照組為生理鹽水處理組，將小鼠麻醉后經鼻滴入50 μl生理鹽水；羧甲司坦組為經腹腔注入羧甲司坦(100 mg/kg)處理組；LPS組為經鼻滴入終濃度為1 mg/kg LPS處理組；LPS+羧甲司坦組為羧甲司坦干預LPS組。

1.3.2 小鼠ALI模型的建立：具體建模方法為，用1%戊巴比妥(80 mg/kg，肌注)麻醉各組小鼠，麻醉滿意后，經鼻滴入LPS(1 mg/kg)，干預組為在上述操作前2 h，將羧甲司坦(100 mg/kg)經腹腔注射入相應組別的小鼠，2 h后再經鼻腔滴入LPS。24 h后，觀察小鼠出現咳嗽、呼吸急促、體溫升高等情況，正常對照組為經鼻滴入等量生理鹽水(50 μl)，將各組小鼠再次麻醉，經眼球取血后，采集相應的標本。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的提?。悍蛛x小鼠頸部軟組織，暴露氣管，氣管剪開后插入灌洗管，深度適中，結扎后，注入0.6 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，回收，連續(xù)6次，灌洗液匯總收集。將BALF離心(800 r/ min)后，取上清液，-80 ℃凍存待檢。

1.3.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)免疫細胞檢測：將離心后獲得的BALF中的沉淀細胞混勻，裂解去除紅細胞，統(tǒng)計總細胞數，剩余細胞沉淀涂片后，4%多聚甲醛固定，行蘇木素-伊紅(H&E)染色，對各炎性細胞進行分類計數，分別計數100個細胞內巨噬的細胞、中性粒細胞和淋巴細胞的數量。

1.3.5 ELISA法檢測BALF中Muc5AC和TNF-α的表達水平：分別用Muc5AC及TNF-α ELISA試劑盒檢測BALF中Muc5AC及TNF-α的表達水平(具體方法參照試劑盒說明書)。

2 結果

2.1 羧甲司坦對BALF中炎性細胞的影響：通過對各組小鼠BALF中細胞進行計數發(fā)現，正常對照組小鼠BALF中淋巴細胞占絕大多數(占98%)，單獨給予羧甲司坦對小鼠BALF細胞分布無明顯影響，其細胞分布也是以淋巴細胞為主(98%)；LPS所致的ALI小鼠BALF中白細胞數明顯升高(約占84%)，而且是以中性粒細胞占細胞總數的絕大多數，羧甲司坦能夠明顯抑制急性肺損傷小鼠BALF中總白細胞數及中性粒細胞數，2組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 羧甲司坦對Muc5AC的抑制作用：通過ELISA檢測各組小鼠BALF中黏蛋白Muc5AC的表達水平。結果顯示，正常對照組小鼠氣道黏蛋白Muc5AC表達水平極低，單獨給予羧甲司坦對Muc5AC的表達無影響，相對于正常對照組，LPS所致的ALI小鼠氣道Muc5AC表達水平明顯升高，羧甲司坦能夠明顯抑制LPS所致的黏蛋白Muc5AC的高分泌。

2.3 羧甲司坦對TNF-α水平的影響：通過檢測各組小鼠BALF中TNF-α表達水平發(fā)現，正常對照組小鼠BALF中TNF-α表達水平極低，約14.19 pg/mL，羧甲司坦對TNF-α表達無影響，LPS能夠明顯增加ALI小鼠BALF中TNF-α的表達水平，為其濃度257.81 pg/mL，羧甲司坦能夠明顯抑制ALI小鼠TNF-α的表達水平，其濃度約為49.66 pg/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

氣道黏液是由氣道上皮細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞及腺體細胞分泌的分布在氣道及肺泡內表面的一種復合物，包括水、電解質和各種有機化合物。黏蛋白是一種高分子量糖蛋白，是黏液中最重要的成分，決定了黏液的物理學特性(聚集、黏性、粘彈性、潤滑性)和生物(保護)學特性[4]。迄今為止，共發(fā)現有21種黏蛋白，分別以Muc 后不同數字命名，其中12種在氣道有表達，包括Muc1、Muc2、Muc4、Muc5AC、Muc5B、Muc7、Muc8、Muc11、Muc13、Muc16、Muc19、Muc20；按結構特點分，黏蛋白主要分為膜結合型和凝膠形成型兩大類，主要的區(qū)別在于是否具有跨膜區(qū)，后者主要的作用是將黏蛋白錨定在細胞膜上。Muc5AC屬于凝膠形成型黏蛋白，在正常肺的黏蛋白中，Muc5AC占了大約90%，其余10%幾乎全部由Muc1、Muc4和Muc16三種膜結合型黏蛋白組成，其中Muc1又占據了后三者的主要部分，其余8種黏蛋白雖然在肺內也可檢測到表達，但含量極微[5]。

羧甲司坦是臨床常用的黏痰溶解劑，其結構中所含的巰基能與活性氧的親電子基團結合，可以清除氧自由基，促進還原性谷胱甘肽的產生，發(fā)揮直接抗氧化作用[6]。同時，有研究表明，羧甲司坦還可以抑制氣道上皮細胞流感病毒等病原體的感染，從而起抗炎作用[7-8]。本研究也發(fā)現，羧甲司坦能夠明顯抑制ALI小鼠氣道炎性細胞數量、TNF-α表達水平及黏蛋白Muc5AC表達水平，在抑制黏痰中主要成分的同時亦能明顯抑制氣道炎癥水平，但具體機制目前并不清楚。我們之前的研究發(fā)現[9]，LPS能夠通過促進TNF-α的表達上調黏蛋白Muc1的表達，通過抑制TNF-α受體，能夠明顯使Muc1的表達水平下降。因此，我們推測羧甲司坦能夠明顯抑制LPS所致的Muc5AC表達水平升高的機制之一有可能也是通過抑制TNF-α的表達，從而抑制Muc5AC升高的信號轉導通路。這些關于羧甲司坦對炎癥反應及黏蛋白抑制作用的具體機制將是我們接下來研究工作的重點內容。

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The inhibitory effect of Carbocisteine on airway Mucin 5AC in mice with acute lung injury

ZHANG Kedong1,ZHU Caixia2,LIU Xiaoke1.

1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.Department of Rheumatism,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China

Objective To study the inhibitory effect of Carbocisteine on airway Mucin 5AC.Methods Established acute lung injury mice model induced by Lipopolysaccharide (LPS).C57 mice were randomly divided into four groups (8～10 mice in each group) and given the following treatment:intranasal inhalation saline,intraperitoneal injection Carbocisteine,intranasal inhalation LPS and intranasal inhalation LPS+ intraperitoneal injection Carbocisteine.Counting the inflammatory cell numbers in Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) with HE staining method.Detecting the Mucin Muc5AC and tumor necrosis factor α (TNF-α) levels in BALF.Results In BALF of the normal controls,the overwhelming majority of cells were lymphocyte,and Carbocisteine alone did not have effect to cellular distribution of normal mice.In BALF of acute lung injury (ALI) mice induced by LPS,the number of inflammatory cells were marked increased,and most of them were neutrophils.Carbocisteine inhibited significantly the number of total inflammatory cells and neutriphils (P<0.05).In addition,Carbocisteine inhibited significantly the Muc5AC and TNF-α levels in BALF of ALI mice (P<0.05).Conclusion Carbocisteine could inhibit significantly airway inflammation of ALI mice.

Carbocisteine;Muc5AC;Acutelunginjury;Inhibition

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0594

寧夏自然科學基金資助項目(NZ15166)

1.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，寧夏 銀川 750004 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院風濕免疫科，寧夏 銀川 750004

張科東(1976-)，男，博士學位，副主任醫(yī)師，主要從事呼吸研究方向。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0845.014.html

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2017-01-14 [責任編輯]王凱榮