徐逸，韓靜，王偉，朱舟

·論著·

大麻素對星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放的影響及機制研究

徐逸1a，韓靜2，王偉1b，朱舟1b

目的：觀察人工合成大麻素HU210對體外培養(yǎng)中腦腹側(cè)被蓋（VTA）區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放的影響，并探討抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放的藥物治療途徑。方法：體外培養(yǎng)大鼠VTA腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞，RT-PCR及免疫熒光染色檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）及大麻素受體1（CB1R）的表達(dá)。將培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞分為4組：對照組（培養(yǎng)基中只加入0.2%DMSO），HU210組（培養(yǎng)基中加入3 μM HU210），HU210+ AM281組（培養(yǎng)基同時加入3 μM HU210及3 μM AM281）和HU210+Riluzole組（培養(yǎng)基同時加入3 μM HU210及3 μM Riluzole），各組4孔。干預(yù)30 min后，采用谷氨酸檢測試劑盒觀察各組星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中谷氨酸濃度。再培養(yǎng)VTA腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞，分為對照組（培養(yǎng)基中只加入0.2%DMSO）和Riluzole組（培養(yǎng)基中加入3 μM Riluzole），干預(yù)30 min后，利用Western Blot印跡分析Riluzole干預(yù)后谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1（GLT-1）表達(dá)水平的變化。結(jié)果：RT-PCR及免疫熒光染色顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有廣泛CB1R的表達(dá)。與對照組比較，HU210組星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸的釋放顯著增加（P＜0.01），HU210+AM281組及HU210+Riluzol組星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸的釋放較HU210組均顯著降低（P＜0.01）；且HU210+Riluzol組星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1表達(dá)較對照組升高（P＜0.05）。結(jié)論：HU210可能通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞的CB1R促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸。Riluzole可能通過升高星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)HU210所致的谷氨酸釋放。

星形膠質(zhì)細(xì)胞；HU210；谷氨酸；大麻素受體1；利魯唑

大麻是全球使用最廣泛的成癮物質(zhì)[1,2]，其成癮機制尚不明確，暫無有效治療方法。目前研究認(rèn)為藥物成癮的機制與突觸可塑性相關(guān)學(xué)習(xí)記憶機制有關(guān)[3,4]。突觸可塑性改變包括長時程增強（long-term potentiation，LTP）和長時程抑制（long term depresion，LTD）。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）的多巴胺神經(jīng)元被認(rèn)為是參與藥物成癮的重要腦區(qū)[5]。本課題組前期在大鼠腦片記錄場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potentials，fEPSCs），發(fā)現(xiàn)慢性大麻素暴露能導(dǎo)致VTA區(qū)的LTD，而利用TAT-谷氨酸受體（glutamic acid receptors，GluR）2阻斷突觸，能抑制人工合成大麻素HU210導(dǎo)致的條件位置偏愛（conditioned place preference，CPP），說明大麻誘導(dǎo)的LTD的確參與了大麻的成癮行為[6]。LTD的產(chǎn)生依賴于谷氨酸釋放增多及谷氨酸受體的激活[7,8]，但目前研究認(rèn)為大麻能減低突觸前神經(jīng)元的谷氨酸的釋放[9]，那么誘導(dǎo)LTD的谷氨酸從何而來？

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，除神經(jīng)元外，星形膠質(zhì)細(xì)胞上也廣泛分布大麻素受體1（cannabinoid 1 receptor，CB1R），且可被外源大麻素激活[10]，目前該受體對突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用仍不清楚。猜測大麻素能激活VTA區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞上的CB1R，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸，激活N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）誘導(dǎo)VTA多巴胺神經(jīng)元LTD的形成。為證實此猜想，本項目擬研究人工合成大麻素HU210對體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放的影響，闡明大麻素誘導(dǎo)LTD產(chǎn)生的細(xì)胞分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、小牛血清、胎牛血清購于Hyclone公司；MEM培養(yǎng)基購于Sigma公司；TRIzol reagent購于Life Technologies公司；小鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）單克隆抗體購于Chemicon公司，兔抗CB1R抗體、兔抗谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1（glutamate transporter-1，GLT-1）抗體購于 Santa Cruz Biotechnology公司，熒光二抗羊抗小鼠Alexa Fluor 488和羊抗兔Alexa Fluor 568購于Molecular Probes公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas公司；谷氨酸檢測試劑盒購于Labor Diagnostika Nord公司；蛋白裂解試劑盒購于PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 0～2 d的SD大鼠幼崽取大腦，剔除軟腦膜，取大腦皮質(zhì)，眼科剪剪成小塊后吹打分散成細(xì)胞懸液，100目鋼絲網(wǎng)篩過濾，制成密度為106/mL懸液，接種于涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中，放置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第2天更換培養(yǎng)基，以后每3天換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)第6天將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫?fù)u床振搖（150 rpm）2 h，棄上清。繼而用0.125%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，吹打成細(xì)胞懸液后以1∶2分散種于新的培養(yǎng)瓶，以種植密度106個/cm2接種于涂有多聚賴氨酸的蓋玻片的6孔板。對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行特異性蛋白GFAP熒光標(biāo)記和DAPI染核，取5張蓋玻片，每張蓋玻片計數(shù)互不重疊的4個視野，統(tǒng)計同一視野內(nèi)GFAP陽性細(xì)胞占所有培養(yǎng)細(xì)胞的百分比，計算星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)純度。

1.2.2 免疫熒光染色 取出培養(yǎng)皿中蓋玻片，PBS沖洗3次后100%甲醇固定30 min，10%牛血清白蛋白封閉30 min，在不同的玻片上分別加入小鼠抗GFAP單克隆抗體（1:500）和兔抗CB1R抗體（1:300），4℃孵育過夜，PBS充分洗去一抗，加入羊抗小鼠Alexa Fluor 488（1: 500）和羊抗兔Alexa Fluor 568（1:500），PBS充分漂洗后在熒光顯微鏡（Zeiss，LSM510 META）下分別檢測CB1R和GFAP的表達(dá)，陰性對照用PBS替代一抗。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription，RT-PCR）Trizol法提取星形膠質(zhì)細(xì)胞RNA，紫外分光光度計測量總RNA的OD260和OD280值，調(diào)整為1 g/L，-70℃保存?zhèn)溆?。按Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作。從Genebank中獲取大鼠CB1R及GAPDH全長cDNA序列，應(yīng)用Primer5.0軟件自行設(shè)序，引物序列如下：CB1R 5’-GCCTATAAGAGGATCGTCACC-3’和5’-GTTCAGCAGGCAGAGCATACTG-3’；GAPDH 5’-CCTTCATTGACCTCAACTAC-3’和5’-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3’。擴增片段長度為500 bp（CB1R）和594 bp（GAPDH）。配制1.5%瓊脂糖凝膠，每孔加樣5 μLPCR產(chǎn)物，以100 V恒壓電泳50 min，SynGene凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行電泳條帶分析。

1.2.4 谷氨酸測定 12孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)的融合的星形膠質(zhì)細(xì)胞用D-hank’s液清洗后，換為不含谷氨酸的MEM培養(yǎng)基，分為4組：對照組（培養(yǎng)基中只加入0.2% DMSO），HU210組（培養(yǎng)基中加入3 μM HU210），HU210+AM281組（培養(yǎng)基同時加入3 μM HU210及3 μM AM281）和HU210+Riluzole組（培養(yǎng)基同時加入3 μM HU210及3 μM Riluzole），各組4孔。干預(yù)30 min后取培養(yǎng)基用谷氨酸檢測試劑盒進(jìn)行谷氨酸檢測。

1.2.5 Western Blot檢測 12孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)的融合的星形膠質(zhì)細(xì)胞用D-hank’s液清洗后，換為不含谷氨酸的MEM培養(yǎng)基，分為對照組（培養(yǎng)基中只加入0.2% DMSO）和Riluzole組（培養(yǎng)基中加入3 μM Riluzole），各組3孔。干預(yù)30 min后棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，蛋白裂解試劑盒對細(xì)胞沉淀進(jìn)行裂解，檢測蛋白濃度，將等量煮沸變性蛋白質(zhì)（30 μg/lane）在SDS聚丙烯酰胺凝膠（分離膠12%，積層膠5%）進(jìn)行垂直電泳分離，然后全濕式電轉(zhuǎn)法經(jīng)電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉2 h，加入一抗（GLT-1）(1:500)及actin（1:500）4℃慢搖過夜。第2天TBS-T充分漂洗后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗，在室溫下?lián)u動孵育2 h，TBS-T室溫充分漂洗，加入Pierce試劑，用CCD數(shù)字成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行條帶分析，以測定目的基因的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的CB1表達(dá)

免疫熒光染色顯示，純化培養(yǎng)后星形膠質(zhì)細(xì)胞百分率為（99.05±2.20）%，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有廣泛CB1R的表達(dá)。見圖1A-C。RT-PCR結(jié)果顯示，VTA區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存在CB1R表達(dá)。

2.2 谷氨酸濃度檢測

檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，HU210組星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸的釋放顯著增加（P＜0.01），HU210+AM281組及HU210+Riluzol組星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸的釋放較HU210組均顯著降低（P＜0.01），見圖3。

圖2 RT-PCR擴增產(chǎn)物條帶

圖3 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放濃度比較結(jié)果

2.3 Riluzole抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)

Westen blot結(jié)果顯示，干預(yù)后30 min，HU210+ Riluzol組星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1表達(dá)較對照組升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 Weston blot檢測結(jié)果

3 討論

桑科植物大麻是最早被人類認(rèn)識的成癮性植物之一，大麻素目前已被認(rèn)為對多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有治療效果：如缺血性腦卒中、多發(fā)性硬化、帕金森病、阿爾茨海默病、睡眠障礙等[11,12]。但因大麻的成癮性等不良影響，阻礙了醫(yī)用大麻素的合法化使用。因此，探討大麻的成癮機制，找到有效途徑阻止其不良影響將對大麻的合法治療起到關(guān)鍵推動作用。

人工合成大麻素HU210的化學(xué)名為1,l-乙基庚基-1l-羥基四氫大麻酚（1,1-dimethylheptyl-11-hydroxytetrahydrocannabino1），是大麻素的活性成分四氫大麻酚（△9tetrahydrocannabinol，△9THC）的結(jié)構(gòu)類似物，通過作用于CB1R發(fā)揮作用，且其與CB1R受體的親和力較△9THC更強，作用持續(xù)時間更久。

本組前期實驗已證實，慢性大麻暴露能誘導(dǎo)VTA區(qū)的LTD[6]。而LTD的產(chǎn)生依賴于NMDA受體的激活，這意味大麻能升高VTA區(qū)谷氨酸的釋放。但目前研究認(rèn)為大麻能減低VTA區(qū)突觸前神經(jīng)元谷氨酸的釋放，導(dǎo)致中腦谷氨酸能神經(jīng)元的突觸前抑制。那么誘導(dǎo)LTD的谷氨酸從何而來？筆者猜測大麻素能激活VTA區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞CB1R，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸，激活NMDA受體誘導(dǎo)VTA多巴胺神經(jīng)元LTD的形成。本研究證實體外培養(yǎng)VTA區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞有CB1R表達(dá)。

為本研究結(jié)果還證實HU210能顯著促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放，CB1R阻斷劑AM281能逆轉(zhuǎn)HU210所致的谷氨酸釋放，表明HU210增高谷氨酸水平可能是通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞的CB1R實現(xiàn)的。筆者推測大麻素激活了星形膠質(zhì)細(xì)胞上的CBlR，導(dǎo)致谷氨酸大量釋放。隨后谷氨酸激活突觸外含NR2B的NMDA受體引起突觸后膜上AMPA受體的內(nèi)吞[6]，誘導(dǎo)了CBlR依賴的LTD，參與了大麻成癮機制，下一步工作會對此推測進(jìn)行證實。

本研究還進(jìn)一步探討了減少星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放的治療手段。Riluzole是市場上治療肌萎縮側(cè)索硬化癥的藥物，其作用機制尚不清楚，可能與其減少神經(jīng)元突觸前谷氨酸釋放相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)Riluzole能顯著逆轉(zhuǎn)HU210所致的星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸釋放，Riluzole可能是通過升高星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)，促進(jìn)谷氨酸的轉(zhuǎn)運，減少谷氨酸釋放。進(jìn)一步的實驗中將探討Riluzole對HU210在體內(nèi)誘導(dǎo)LTD的抑制作用，為大麻成癮的藥物治療找到新的策略。

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（本文編輯：唐穎馨）

Effect of Cannabinoids HU210 on Glutamate Release of Astrocytes and Its Mechanism

XU Yi1a,HAN Jing2,WANG Wei1b,ZHU Zhou1b.1.a.Department of Neurology,b.Department of Plastic Surgery,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China.2. Key Laboratory of Modern Teaching Technology of Ministry of Education,Shaanxi Normal University,Xian 710062

Objective:To investigate the effect of HU210 on glutamate release of cultured midbrain ventral tegmental area(VTA)astrocytes and its mechanism.Methods:VTA astrocytes were cultured.RT-PCR and immunostaining were used to detect the expression of glia fibrillary acidic protein(GFAP)and cannabinoid 1 receptor (CB1R).The cultured VTA astrocytes were randomly divided into 4 groups(n=4):control group(0.2%DMSO in medium),HU210 group(3 μM HU210 in medium),HU210+AM281group(3 μM HU210+3 μM AM281 in medium)and HU210+Riluzole group(3 μM HU210+3 μM Riluzole in medium).Concentration of glutamate in medium was detected using enzyme immunoassay of glutamate kit.And then the cultured VTA astrocytes were randomly divided into 2 groups(n=3):control group(0.2%DMSO in medium)and Riluzole group(3 μM Riluzole in medium).Western Bolt was used to detect the expression of glutamate transporter-1(GLT-1).Results:Abundant CB1R RNA and the protein were detected in astrocytes.HU210 increased glutamate release from cultured VTA astrocytes,which was suppressed by AM281.Riluzole suppressed HU210-induced glutamate release from cultured VTA astrocytes and increased the expression of astrocytic GLT-1 which served to remove the released glutamate.Conclusion:Cannabinoids HU210 probably activates VTA astrocytic CB1R to release glutamate and Riluzole probably increases the expression of GLT-1,thus suppressing HU210-induced glutamate release.

astrocyte;HU-210;glutamate;cannabinoid 1 receptor;Riluzole

R741;R971

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.01.001

1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院a.整形外科，b.神經(jīng)內(nèi)科武漢 430030 2.陜西師范大學(xué)現(xiàn)代教學(xué)技術(shù)教育部重點實驗室西安 710062

湖北省科技支撐計劃（No.015BKA220）華中科技大學(xué)自主創(chuàng)新研究基金（No.2015ZHYX01 1）

2016-06-02

朱舟zhouzhu@medmail. com.cn