重組頭孢菌素C?；傅墓潭ɑ芯?/h1>
2017-03-08 03:28朱琳琳常雁紅于慧敏沈忠耀
化學與生物工程 2017年2期
朱琳琳，常雁紅*，姚 舜，羅 暉，于慧敏，沈忠耀
(1.北京科技大學環(huán)境工程系，北京 100083；2.北京科技大學生物科學與工程系， 北京 100083；3.清華大學化學工程系，北京 100084)
表1
粗酶液純化結(jié)果
Tab.1
重組頭孢菌素C?；傅墓潭ɑ芯?/p>
朱琳琳1，常雁紅1*，姚 舜1，羅 暉2，于慧敏3，沈忠耀3
(1.北京科技大學環(huán)境工程系，北京 100083；2.北京科技大學生物科學與工程系， 北京 100083；3.清華大學化學工程系，北京 100084)
將含頭孢菌素C(CPC)?；傅闹亟M大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy在50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵液OD600可達19.5，酶活達到11 542 U·L-1；CPC酰化酶粗酶液經(jīng)1%活性炭純化后，比酶活由6.56 U·mg-1提高到10.77 U·mg-1；然后將純化的CPC?；腹矁r結(jié)合固定在氨基載體LX-1000HA和環(huán)氧基載體LX-1000EPC上，并對固定化酶的熱穩(wěn)定性及pH值穩(wěn)定性進行考察。結(jié)果表明，LX-1000HA固定化酶的初始酶活較LX-1000EPC固定化酶低，但其熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性以及酶與載體的結(jié)合強度均高于LX-1000EPC固定化酶；并且在固定化酶投加量相同時，LX-1000HA固定化酶的催化性能優(yōu)于LX-1000EPC固定化酶。對LX-1000HA固定化酶進行催化批次實驗，在催化39批次時達到半衰期。
重組；頭孢菌素C?；?；固定化酶；穩(wěn)定性；生物催化
頭孢菌素類抗生素是一類高效、低毒、臨床應用廣泛的重要抗生素，是世界上最暢銷的抗感染藥物之一[1]。7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)是合成頭孢菌素的重要中間體，一般由頭孢菌素C(CPC)通過化學法或酶法催化制得。CPC?；甘且环N能直接水解CPC的側(cè)鏈一步生成7-ACA的生物酶[2]，在7-ACA工業(yè)生產(chǎn)中具有非常重要的應用，近年來得到了快速發(fā)展[3-5]。由于游離酶存在反應條件苛刻、穩(wěn)定性差、易失活、不能重復使用等缺點，限制了其在實際工程中的應用，而固定化酶因穩(wěn)定性好、易分離、可重復利用等優(yōu)點備受人們青睞[6-7]。 因此，作者將含CPC?；傅闹亟M大腸桿菌E．coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy在50L發(fā)酵罐中發(fā)酵，經(jīng)純化后獲得活性較高的CPC?；福M而將其固定在不同載體上得到固定化CPC?；福ζ湫阅苓M行考察，以期得到性能優(yōu)良的固定化CPC?；?，為7-ACA工業(yè)生產(chǎn)提供參考。
1 實驗
1.1 菌種與試劑
CPC?；钢亟M菌種E．coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy，參照文獻[8]構建，自行保存。
CPC鈉鹽、7-ACA，河北石家莊九派集團；環(huán)氧基載體LX-1000EPC、氨基載體LX-1000HA，西安藍曉科技有限公司；高效液相色譜用流動相試劑為色譜純；活性炭(顆粒)及其它試劑為分析純；BCA法測蛋白試劑盒、蛋白質(zhì)marker，上海生工生物工程技術服務有限公司。
1.2 CPC?；傅姆蛛x純化
1.2.1 菌種發(fā)酵
將保存的菌種E.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy接種到含有50 mg·L-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中活化。接種量為1%，37 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h。
將上述菌種培養(yǎng)液以2.5%的接種量接種至50 L發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：玉米漿50，酵母粉10，甘油5，NH4Cl 2.5，KH2PO42.3，K2HPO4·2H2O 21.5，乳糖3，用1 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH值至7.5。發(fā)酵條件：28 ℃，攪拌速度300 r·min-1，通氣量2 m3·h-1，料液體積30 L，發(fā)酵時間24 h。發(fā)酵期間定時取樣，測定生物量(OD600)和酶活。
1.2.2 酶的分離純化
活性炭具有高度發(fā)達的孔隙結(jié)構和很大的比表面積，化學穩(wěn)定性好，耐酸堿，不溶于水和有機溶劑，能經(jīng)受水浸及高溫高壓的作用，失效后可以再生，所以常作為吸附劑被廣泛應用。除了作為常規(guī)的吸附劑吸附有色物質(zhì)外，活性炭還可吸附小分子蛋白[9]。因此，本實驗采用活性炭對CPC酰化酶粗酶液進行純化。由于活性炭可能對分子量為86 kDa的CPC?；赣蟹翘禺愋晕?，因此應選擇合適的活性炭添加量。本實驗選擇活性炭添加量分別為粗酶液的0.5%、1%和3%。
將收集的菌體用pH值8.5的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(PB)洗滌2次，再用該緩沖液重懸。用高壓勻漿機(BIOTECH-50BSG型)在800 bar壓強下勻漿3次得到破碎菌液，離心，取上清(即粗酶液)，分別加入0.5%、1%和3%的經(jīng)水洗的活性炭，在搖床中于25 ℃、160 r·min-1振蕩1 h，離心，取上清，即得CPC?；讣兓敢?，測定其酶活和蛋白濃度。
1.3 CPC?；傅墓潭ɑ?/p>
1.3.1 氨基載體LX-1000HA的活化
將10 g LX-1000HA載體加到40 mL 0.1 mol·L-1pH值8.0的PB溶液中，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)pH值至7.8～8.2，于25 ℃搖床振蕩15 min后測pH值，再調(diào)pH值為7.8～8.2，重復上述步驟，直至振蕩后溶液pH值穩(wěn)定在7.8～8.2。然后加入40 mL 2%(體積分數(shù))的戊二醛(用0.1 mol·L-1pH值8.0的PB溶液配制)，25 ℃攪拌1 h，過濾，再用去離子水洗滌3次。由于醛基穩(wěn)定性較差，載體活化后需立即使用。
1.3.2 固定化酶的制備
LX-1000EPC固定化酶的制備：稱取一定量用0.1 mol·L-1pH值8.0的PB溶液洗滌過的LX-1000EPC載體置于錐形瓶中，按300 U·g-1的投加量加入CPC?；讣兓敢?；根據(jù)所加入的酶液的體積，加入2倍酶液體積的1.25 mol·L-1pH值8.0的PB溶液，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)體系pH值至8.0；在25 ℃、160 r·min-1搖床固定化24 h；抽濾，用大量去離子水、0.1 mol·L-1pH值8.5的PB溶液依次洗滌；抽濾，即得LX-1000EPC固定化酶，4 ℃保存。
LX-1000HA固定化酶的制備：取活化的LX-1000HA載體按上述方法固定化20 h，即得。
1.4 CPC?；该富顪y定
采用比色法測定游離CPC?；该富頪10-11]：用0.1 mol·L-1pH值8.5的PB溶液配制20 mg·mL-1的CPC溶液，并用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5。取20 μL CPC?；讣兓敢杭拥?0 μL經(jīng)37 ℃預熱的20 mg·mL-1CPC溶液中，吹打均勻，于37 ℃水浴放置5 min后加入200 μL終止液(50 mmol·L-1的NaOH溶液與20%的醋酸溶液按1∶2的體積比混合)，吹打均勻。將上述混合液于12 000 r·min-1離心3 min，取上清200 μL加入40 μL質(zhì)量濃度為0.5%的顯色液[對二甲氨基苯甲醛(PDAB)的甲醇溶液]，室溫顯色10 min后測定OD415。
游離酶的酶活定義：在37 ℃、pH值8.5、底物濃度一定的條件下，每分鐘催化CPC生成1 μmol 7-ACA所需的酶量定義為1個酶活力單位。
固定化CPC?；?以下簡稱固定化酶)酶活測定方法及酶活定義與游離酶相同。
1.5 固定化酶性質(zhì)的測定
1.5.1 固定化酶的熱穩(wěn)定性
將固定化酶加到20 mmol·L-1pH值8.0的PB溶液中，在50 ℃溫育不同時間，定時測定固定化酶酶活，計算殘余酶活(以零時刻初始酶活值為100%的相對酶活，下同)。
1.5.2 固定化酶的pH值穩(wěn)定性
將固定化酶置于pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的20 mmol·L-1PB溶液中，25 ℃下溫育不同時間，定時測定固定化酶酶活，計算殘余酶活。
1.5.3 酶與載體的結(jié)合強度
十二烷基磺酸鈉(SDS)與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合會破壞其折疊結(jié)構，形成穩(wěn)定的SDS-蛋白質(zhì)復合物。用2%的SDS溶液處理固定化酶，取上清進行蛋白質(zhì)電泳[12]，考察CPC酰化酶與LX-1000HA載體和LX-1000EPC載體的結(jié)合強度。
1.6 固定化酶催化性能評價與反應批次
固定化酶的催化反應器為攪拌釜反應器[13]。具體操作如下：按8 U·mL-1投加量加入固定化酶，通循環(huán)冷卻水預熱到25 ℃，加入已預熱的25 mg·mL-1CPC溶液，同時開始攪拌，催化產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分析，考察固定化酶對底物CPC生成7-ACA的催化性能。通過自動電位滴定儀滴加2 mol·L-1的氨水保證反應體系pH值為8.5，采用夾套中的循環(huán)水調(diào)節(jié)反應體系的溫度。當?shù)孜顲PC轉(zhuǎn)化率達到95%時，即認為一批反應結(jié)束。用去離子水清洗固定化酶并投入下一批催化反應中。
色譜條件：色譜柱為Phenomenex Luna C18(4.6 mm×150 mm)，流動相為15%甲醇-7.5%乙腈-1%乙酸，流速為0.8 mL·min-1，檢測波長為254 nm。
2 結(jié)果與討論
2.1 重組菌的發(fā)酵
50 L發(fā)酵罐中CPC?；钢亟M菌的生長曲線和CPC酰化酶酶活變化曲線如圖1所示。
圖1 50 L發(fā)酵罐中重組菌的生長曲線和酶活變化曲線
由圖1可知，在整個發(fā)酵過程中，菌體濃度一直呈上升趨勢，發(fā)酵26 h時的OD600達到19.5；酶活隨著發(fā)酵時間的延長而升高，發(fā)酵24 h時的酶活達到11 542 U·L-1，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，酶活僅略有升高。表明，CPC?；钢亟M菌具有較好的發(fā)酵特性。此外，由于本發(fā)酵過程采用了乳糖自動誘導的發(fā)酵培養(yǎng)基，CPC?；傅拿富钆c菌體濃度保持了較好的一致性，有利于進一步通過提高菌體濃度來提高酶活。
2.2 酶的純化
CPC?；复置敢旱募兓Y(jié)果如表1所示。
表1
粗酶液純化結(jié)果
Tab.1
Purification results of crude enzyme solution
由表1可知，CPC?；复置敢褐屑尤牖钚蕴亢?，蛋白濃度下降，表明活性炭可能吸附了CPC?；复置敢褐械哪承┬》肿与s蛋白，導致其蛋白濃度下降。對于蛋白濃度為1.07 mg·mL-1的粗酶液，采用1%活性炭對其進行純化，效果較好，純化后的蛋白濃度為0.60 mg·mL-1，比酶活可達到10.77 U·mg-1，酶活收率達到92.0%。表明，用少量的活性炭純化CPC?；复置敢簳r，可以很好地吸附小分子雜蛋白，且對CPC?；该富畹挠绊戄^小。
CPC?；复置敢杭兓腟DS-PAGE圖譜如圖2所示。
1.粗酶液 2.蛋白質(zhì)marker 3.0.5%活性炭純化 4.1%活性炭純化 5.3%活性炭純化
由圖2可以看出，粗酶液目的蛋白由α亞基(28 kDa)與β亞基(58 kDa)組成(泳道1)；加入活性炭后，蛋白條帶明顯減少(泳道3、4、5)，表明不同用量活性炭對CPC?；妇幸欢ǖ募兓饔?，活性炭純化是一種較簡單可行的方法。
2.3 固定化酶性質(zhì)考察
采用1.3.2方法制得的LX-1000EPC固定化酶和LX-1000HA固定化酶的酶活分別為86 U·g-1和55 U·g-1，酶活收率分別為29%和18%。本實驗以游離酶為參照，研究了這2種固定化酶的熱穩(wěn)定性與pH值穩(wěn)定性，同時對酶與載體的結(jié)合強度進行了考察。
2.3.1 熱穩(wěn)定性
LX-1000HA固定化酶、LX-1000EPC固定化酶及游離酶的熱穩(wěn)定性如圖3所示。
由圖3可知，固定化酶的熱穩(wěn)定性遠遠高于游離
圖3 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性(50 ℃)
酶的熱穩(wěn)定性。50 ℃下放置1 h，LX-1000HA固定化酶殘余酶活為72%，LX-1000EPC固定化酶殘余酶活為40%，而游離酶殘余酶活僅5%。固定化酶的酶活與固定化方向、結(jié)合位點及結(jié)合力有關[14]。雖然LX-1000HA固定化酶的初始酶活(55 U·g-1)低于LX-1000EPC固定化酶(86 U·g-1)，但LX-1000EPC固定化酶中酶與載體的結(jié)合力主要為共價結(jié)合力，而LX-1000HA固定化酶除了酶與載體之間的共價結(jié)合力外，還存在載體(帶正電)與酶分子(帶負電)間的靜電引力，因此LX-1000HA固定化酶中酶與載體的綜合結(jié)合力可能大于LX-1000EPC固定化酶，這也許是LX-1000HA固定化酶熱穩(wěn)定性高于LX-1000EPC固定化酶的主要原因。
2.3.2 pH值穩(wěn)定性
LX-1000HA固定化酶、LX-1000EPC固定化酶及游離酶的pH值穩(wěn)定性如圖4所示。
圖4 固定化酶和游離酶的pH值穩(wěn)定性
由圖4可以看出，游離酶的最佳pH值為8.0，放置1 d后的殘余酶活為65%，放置1.5 d后的殘余酶活為50%；LX-1000HA固定化酶在pH值9.0溶液中顯示出較高的穩(wěn)定性，放置3 d后的殘余酶活為95%，放置7 d后的殘余酶活為90%；LX-1000EPC固定化酶在pH值8.0溶液中顯示出較高的穩(wěn)定性，放置3 d后的殘余酶活為55%，放置7 d后的殘余酶活為52%。表明，固定化酶的pH值穩(wěn)定性高于游離酶，其中LX-1000HA固定化酶具有更高的pH值穩(wěn)定性。
2.3.3 酶與載體的結(jié)合強度
CPC?；赣梢粋€α亞基和一個β亞基構成，并且α亞基和β亞基之間沒有二硫鍵。因此，CPC?；冈诓煌d體上的結(jié)合強度可以通過SDS解吸實驗進行評價[15]，結(jié)果如圖5所示。
1.粗酶液 2.LX-1000EPC固定化酶 3.蛋白質(zhì)marker 4.LX-1000HA固定化酶
從圖5可以看出，LX-1000HA固定化酶較LX-1000EPC固定化酶具有更高的穩(wěn)定性。對于LX-1000HA固定化酶，CPC?；傅摩羴喕挺聛喕嘉幢幌疵撓聛?，表明CPC?；傅摩羴喕挺聛喕伎梢耘cLX-1000HA載體進行多點共價交聯(lián)，結(jié)合緊密；對于LX-1000EPC固定化酶，CPC酰化酶的β亞基被洗脫下來，而α亞基沒有，表明CPC?；钢兄挥笑羴喕梢耘cLX-1000EPC載體共價交聯(lián)，β亞基結(jié)合強度較低。這可能是因為，CPC?；阜肿又泻匈嚢彼岬臄?shù)量和分布對于其與LX-1000EPC載體的結(jié)合有著至關重要的作用[16-17]，α亞基(28 kDa)含有6個賴氨酸和1個具有較高反應活性的N端氨基，而β亞基(58 kDa)只含有2個賴氨酸，并且其中一個被包裹于內(nèi)部，因此酶分子的β亞基往往不能與LX-1000EPC載體形成穩(wěn)定的共價鍵而較易被SDS洗脫下來。此結(jié)果也從側(cè)面說明賴氨酸數(shù)量多少、分布是否均勻?qū)绊懝潭ɑ钢忻概c載體的結(jié)合強度[18]。
2.4 固定化酶催化性能評價
2.4.1 固定化酶的催化性能
在25 ℃、pH值8.5的條件下，按8 U·mL-1投加固定化酶，考察固定化酶對底物CPC生成7-ACA的催化性能，結(jié)果見圖6。
圖6 LX-1000HA固定化酶和LX-1000EPC 固定化酶的催化性能
由圖6可以看出，對于LX-1000HA固定化酶，反應初始階段催化速率很快，反應20 min時的CPC轉(zhuǎn)化率已達到86%，7-ACA收率為85%；反應40 min時的CPC轉(zhuǎn)化率達到99%，7-ACA收率為97%。對于LX-1000EPC固定化酶，反應20 min時的CPC轉(zhuǎn)化率為76%，7-ACA收率為74%；而當CPC轉(zhuǎn)化率達到97%，7-ACA收率為96%時，反應需要60 min。表明，在相同的催化條件下，LX-1000HA固定化酶的催化性能優(yōu)于LX-1000EPC固定化酶。這可能是由于，不同載體具有不同的物理和化學性質(zhì)(如孔徑、疏水性、親水性以及表面化學性質(zhì))，對酶的附著會有影響，進而影響酶的固定化和固定化酶的催化性能[14]。
2.4.2 固定化酶的催化穩(wěn)定性
大多數(shù)情況下，固定化酶的穩(wěn)定性隨著溫度的降低而升高，但是溫度太低又會影響其催化反應速度[19]，因此本實驗對25 ℃下LX-1000HA固定化酶的反應批次進行考察，結(jié)果見圖7。
圖7 LX-1000HA固定化酶的13批次催化反應結(jié)果
由圖7可以看出，隨著反應批次的增加，催化反應時間逐漸延長。這是因為，隨著反應批次的增加，固定化酶的酶活逐漸下降，因此需要延長反應時間以保證CPC的轉(zhuǎn)化率。
對13批次催化反應數(shù)據(jù)進行擬合，推算出反應39批次時達到LX-1000HA固定化酶的半衰期，此時LX-1000HA固定化酶催化反應所需時間為第1批次反應時間的2倍。而Zhu等[13]在25 ℃下進行LX-1000EPC固定化酶的催化反應，固定化酶的半衰期為24批次。表明，LX-1000HA固定化酶的反應批次較LX-1000EPC固定化酶提高了62.5%，LX-1000HA固定化酶具有更高的催化穩(wěn)定性，這對于7-ACA的一步酶法生產(chǎn)技術的完善及日后的產(chǎn)業(yè)化應用具有重要意義。
3 結(jié)論
將含頭孢菌素C(CPC)酰化酶的重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy在50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵液OD600可達19.5，酶活達到11 542 U·L-1；CPC?；复置敢航?jīng)1%活性炭純化后，比酶活由6.56 U·mg-1提高到10.77 U·mg-1；然后將純化的CPC?；腹矁r結(jié)合固定在氨基載體LX-1000HA和環(huán)氧基載體LX-1000EPC上，并對固定化酶的熱穩(wěn)定性及pH值穩(wěn)定性進行考察。結(jié)果表明，LX-1000HA固定化酶的初始酶活較LX-1000EPC固定化酶低，但其熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性以及酶與載體的結(jié)合強度均高于LX-1000EPC固定化酶；并且在固定化酶投加量相同時，LX-1000HA固定化酶的催化性能優(yōu)于LX-1000EPC固定化酶。對LX-1000HA固定化酶進行催化批次實驗，在催化39批次時達到半衰期，提高了酶的重復利用率，獲得了性能優(yōu)良的固定化CPC?；?，對于7-ACA的一步酶法生產(chǎn)技術的完善及日后的產(chǎn)業(yè)化應用具有重要意義。
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Immobilization of Recombinant Cephalosporin C Acylase
ZHU Lin-lin1,CHANG Yan-hong1*,YAO Shun1,LUO Hui2,YU Hui-min3,SHEN Zhong-yao3
(1.DepartmentofEnvironmentalEngineering,UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing100083,China;2.DepartmentofBiologicalScienceandEngineering,UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing100083,China; 3.DepartmentofChemicalEngineering,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China)
Inthispaper,therecombinantE.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcywhichcontainscephalosporinC(CPC)acylasewasfermentedina50Lfermentor.WhentheOD600valueofthebrothandtheenzymeactivityreached19.5and11 542U·L-1,respectively.Crudeenzymesolutionwaspurifiedby1%activatedcarbons,andthespecificenzymeactivityincreasedfrom6.56U·mg-1to10.77U·mg-1.ThenthepurifiedCPCacylasewasimmobilizedonLX-1000HA(aminocarrier)andLX-1000EPC(epoxycarrier)bycovalentbinding,andthethermalstabilityandpHvaluestabilityoftheimmobilizedenzymewereinvestigated.TheresultsshowedthattheinitialenzymeactivityofLX-1000HAimmobilizedenzymewaslowerthanthatofLX-1000EPCimmobilizedenzyme,whileitsthermalstability,pHvaluestability,andbindingstrengthofLX-1000HAimmobilizedenzymeandcarrierwerebetterthanthoseofLX-1000EPCimmobilizedenzyme.CatalyticperformanceofLX-1000HAimmobilizedenzymewasbetterthanthatofLX-1000EPCimmobilizedenzymeforthesameenzymedosage.Thehalf-lifeofLX-1000HAimmobilizedenzymewasabout39cyclesundersuchcatalyticreactionconditions.
recombination;cephalosporinCacylase;immobilizedenzyme;stability;biocatalysis
國家自然科學基金資助項目(21276023，21476025)，北京市自然科學基金資助項目(2143041)，中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項目(FRF-SD-12-007A)
2016-09-18
朱琳琳(1990-)，女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物、固定化酶及其應用，E-mail：780284613@qq.com；通訊作者：常雁紅，副教授。
10.3969/j.issn.1672-5425.2017.02.005
TQ 465.1 Q 556
A
1672-5425(2017)02-0019-06
朱琳琳，常雁紅，姚舜，等.重組頭孢菌素C?；傅墓潭ɑ芯縖J].化學與生物工程，2017，34(2)：19-24.
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朱琳琳，常雁紅*，姚 舜，羅 暉，于慧敏，沈忠耀
(1.北京科技大學環(huán)境工程系，北京 100083；2.北京科技大學生物科學與工程系， 北京 100083；3.清華大學化學工程系，北京 100084)
表1
粗酶液純化結(jié)果
Tab.1
重組頭孢菌素C?；傅墓潭ɑ芯?/p>
朱琳琳1，常雁紅1*，姚 舜1，羅 暉2，于慧敏3，沈忠耀3
(1.北京科技大學環(huán)境工程系，北京 100083；2.北京科技大學生物科學與工程系， 北京 100083；3.清華大學化學工程系，北京 100084)
將含頭孢菌素C(CPC)?；傅闹亟M大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy在50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵液OD600可達19.5，酶活達到11 542 U·L-1；CPC酰化酶粗酶液經(jīng)1%活性炭純化后，比酶活由6.56 U·mg-1提高到10.77 U·mg-1；然后將純化的CPC?；腹矁r結(jié)合固定在氨基載體LX-1000HA和環(huán)氧基載體LX-1000EPC上，并對固定化酶的熱穩(wěn)定性及pH值穩(wěn)定性進行考察。結(jié)果表明，LX-1000HA固定化酶的初始酶活較LX-1000EPC固定化酶低，但其熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性以及酶與載體的結(jié)合強度均高于LX-1000EPC固定化酶；并且在固定化酶投加量相同時，LX-1000HA固定化酶的催化性能優(yōu)于LX-1000EPC固定化酶。對LX-1000HA固定化酶進行催化批次實驗，在催化39批次時達到半衰期。
重組；頭孢菌素C?；?；固定化酶；穩(wěn)定性；生物催化
頭孢菌素類抗生素是一類高效、低毒、臨床應用廣泛的重要抗生素，是世界上最暢銷的抗感染藥物之一[1]。7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)是合成頭孢菌素的重要中間體，一般由頭孢菌素C(CPC)通過化學法或酶法催化制得。CPC?；甘且环N能直接水解CPC的側(cè)鏈一步生成7-ACA的生物酶[2]，在7-ACA工業(yè)生產(chǎn)中具有非常重要的應用，近年來得到了快速發(fā)展[3-5]。由于游離酶存在反應條件苛刻、穩(wěn)定性差、易失活、不能重復使用等缺點，限制了其在實際工程中的應用，而固定化酶因穩(wěn)定性好、易分離、可重復利用等優(yōu)點備受人們青睞[6-7]。 因此，作者將含CPC?；傅闹亟M大腸桿菌E．coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy在50L發(fā)酵罐中發(fā)酵，經(jīng)純化后獲得活性較高的CPC?；福M而將其固定在不同載體上得到固定化CPC?；福ζ湫阅苓M行考察，以期得到性能優(yōu)良的固定化CPC?；?，為7-ACA工業(yè)生產(chǎn)提供參考。
1 實驗
1.1 菌種與試劑
CPC?；钢亟M菌種E．coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy，參照文獻[8]構建，自行保存。
CPC鈉鹽、7-ACA，河北石家莊九派集團；環(huán)氧基載體LX-1000EPC、氨基載體LX-1000HA，西安藍曉科技有限公司；高效液相色譜用流動相試劑為色譜純；活性炭(顆粒)及其它試劑為分析純；BCA法測蛋白試劑盒、蛋白質(zhì)marker，上海生工生物工程技術服務有限公司。
1.2 CPC?；傅姆蛛x純化
1.2.1 菌種發(fā)酵
將保存的菌種E.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy接種到含有50 mg·L-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中活化。接種量為1%，37 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h。
將上述菌種培養(yǎng)液以2.5%的接種量接種至50 L發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：玉米漿50，酵母粉10，甘油5，NH4Cl 2.5，KH2PO42.3，K2HPO4·2H2O 21.5，乳糖3，用1 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH值至7.5。發(fā)酵條件：28 ℃，攪拌速度300 r·min-1，通氣量2 m3·h-1，料液體積30 L，發(fā)酵時間24 h。發(fā)酵期間定時取樣，測定生物量(OD600)和酶活。
1.2.2 酶的分離純化
活性炭具有高度發(fā)達的孔隙結(jié)構和很大的比表面積，化學穩(wěn)定性好，耐酸堿，不溶于水和有機溶劑，能經(jīng)受水浸及高溫高壓的作用，失效后可以再生，所以常作為吸附劑被廣泛應用。除了作為常規(guī)的吸附劑吸附有色物質(zhì)外，活性炭還可吸附小分子蛋白[9]。因此，本實驗采用活性炭對CPC酰化酶粗酶液進行純化。由于活性炭可能對分子量為86 kDa的CPC?；赣蟹翘禺愋晕?，因此應選擇合適的活性炭添加量。本實驗選擇活性炭添加量分別為粗酶液的0.5%、1%和3%。
將收集的菌體用pH值8.5的0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(PB)洗滌2次，再用該緩沖液重懸。用高壓勻漿機(BIOTECH-50BSG型)在800 bar壓強下勻漿3次得到破碎菌液，離心，取上清(即粗酶液)，分別加入0.5%、1%和3%的經(jīng)水洗的活性炭，在搖床中于25 ℃、160 r·min-1振蕩1 h，離心，取上清，即得CPC?；讣兓敢?，測定其酶活和蛋白濃度。
1.3 CPC?；傅墓潭ɑ?/p>
1.3.1 氨基載體LX-1000HA的活化
將10 g LX-1000HA載體加到40 mL 0.1 mol·L-1pH值8.0的PB溶液中，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)pH值至7.8～8.2，于25 ℃搖床振蕩15 min后測pH值，再調(diào)pH值為7.8～8.2，重復上述步驟，直至振蕩后溶液pH值穩(wěn)定在7.8～8.2。然后加入40 mL 2%(體積分數(shù))的戊二醛(用0.1 mol·L-1pH值8.0的PB溶液配制)，25 ℃攪拌1 h，過濾，再用去離子水洗滌3次。由于醛基穩(wěn)定性較差，載體活化后需立即使用。
1.3.2 固定化酶的制備
LX-1000EPC固定化酶的制備：稱取一定量用0.1 mol·L-1pH值8.0的PB溶液洗滌過的LX-1000EPC載體置于錐形瓶中，按300 U·g-1的投加量加入CPC?；讣兓敢?；根據(jù)所加入的酶液的體積，加入2倍酶液體積的1.25 mol·L-1pH值8.0的PB溶液，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)體系pH值至8.0；在25 ℃、160 r·min-1搖床固定化24 h；抽濾，用大量去離子水、0.1 mol·L-1pH值8.5的PB溶液依次洗滌；抽濾，即得LX-1000EPC固定化酶，4 ℃保存。
LX-1000HA固定化酶的制備：取活化的LX-1000HA載體按上述方法固定化20 h，即得。
1.4 CPC?；该富顪y定
采用比色法測定游離CPC?；该富頪10-11]：用0.1 mol·L-1pH值8.5的PB溶液配制20 mg·mL-1的CPC溶液，并用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5。取20 μL CPC?；讣兓敢杭拥?0 μL經(jīng)37 ℃預熱的20 mg·mL-1CPC溶液中，吹打均勻，于37 ℃水浴放置5 min后加入200 μL終止液(50 mmol·L-1的NaOH溶液與20%的醋酸溶液按1∶2的體積比混合)，吹打均勻。將上述混合液于12 000 r·min-1離心3 min，取上清200 μL加入40 μL質(zhì)量濃度為0.5%的顯色液[對二甲氨基苯甲醛(PDAB)的甲醇溶液]，室溫顯色10 min后測定OD415。
游離酶的酶活定義：在37 ℃、pH值8.5、底物濃度一定的條件下，每分鐘催化CPC生成1 μmol 7-ACA所需的酶量定義為1個酶活力單位。
固定化CPC?；?以下簡稱固定化酶)酶活測定方法及酶活定義與游離酶相同。
1.5 固定化酶性質(zhì)的測定
1.5.1 固定化酶的熱穩(wěn)定性
將固定化酶加到20 mmol·L-1pH值8.0的PB溶液中，在50 ℃溫育不同時間，定時測定固定化酶酶活，計算殘余酶活(以零時刻初始酶活值為100%的相對酶活，下同)。
1.5.2 固定化酶的pH值穩(wěn)定性
將固定化酶置于pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的20 mmol·L-1PB溶液中，25 ℃下溫育不同時間，定時測定固定化酶酶活，計算殘余酶活。
1.5.3 酶與載體的結(jié)合強度
十二烷基磺酸鈉(SDS)與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合會破壞其折疊結(jié)構，形成穩(wěn)定的SDS-蛋白質(zhì)復合物。用2%的SDS溶液處理固定化酶，取上清進行蛋白質(zhì)電泳[12]，考察CPC酰化酶與LX-1000HA載體和LX-1000EPC載體的結(jié)合強度。
1.6 固定化酶催化性能評價與反應批次
固定化酶的催化反應器為攪拌釜反應器[13]。具體操作如下：按8 U·mL-1投加量加入固定化酶，通循環(huán)冷卻水預熱到25 ℃，加入已預熱的25 mg·mL-1CPC溶液，同時開始攪拌，催化產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分析，考察固定化酶對底物CPC生成7-ACA的催化性能。通過自動電位滴定儀滴加2 mol·L-1的氨水保證反應體系pH值為8.5，采用夾套中的循環(huán)水調(diào)節(jié)反應體系的溫度。當?shù)孜顲PC轉(zhuǎn)化率達到95%時，即認為一批反應結(jié)束。用去離子水清洗固定化酶并投入下一批催化反應中。
色譜條件：色譜柱為Phenomenex Luna C18(4.6 mm×150 mm)，流動相為15%甲醇-7.5%乙腈-1%乙酸，流速為0.8 mL·min-1，檢測波長為254 nm。
2 結(jié)果與討論
2.1 重組菌的發(fā)酵
50 L發(fā)酵罐中CPC?；钢亟M菌的生長曲線和CPC酰化酶酶活變化曲線如圖1所示。
圖1 50 L發(fā)酵罐中重組菌的生長曲線和酶活變化曲線
由圖1可知，在整個發(fā)酵過程中，菌體濃度一直呈上升趨勢，發(fā)酵26 h時的OD600達到19.5；酶活隨著發(fā)酵時間的延長而升高，發(fā)酵24 h時的酶活達到11 542 U·L-1，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，酶活僅略有升高。表明，CPC?；钢亟M菌具有較好的發(fā)酵特性。此外，由于本發(fā)酵過程采用了乳糖自動誘導的發(fā)酵培養(yǎng)基，CPC?；傅拿富钆c菌體濃度保持了較好的一致性，有利于進一步通過提高菌體濃度來提高酶活。
2.2 酶的純化
CPC?；复置敢旱募兓Y(jié)果如表1所示。
表1
粗酶液純化結(jié)果
Tab.1
Purification results of crude enzyme solution
由表1可知，CPC?；复置敢褐屑尤牖钚蕴亢?，蛋白濃度下降，表明活性炭可能吸附了CPC?；复置敢褐械哪承┬》肿与s蛋白，導致其蛋白濃度下降。對于蛋白濃度為1.07 mg·mL-1的粗酶液，采用1%活性炭對其進行純化，效果較好，純化后的蛋白濃度為0.60 mg·mL-1，比酶活可達到10.77 U·mg-1，酶活收率達到92.0%。表明，用少量的活性炭純化CPC?；复置敢簳r，可以很好地吸附小分子雜蛋白，且對CPC?；该富畹挠绊戄^小。
CPC?；复置敢杭兓腟DS-PAGE圖譜如圖2所示。
1.粗酶液 2.蛋白質(zhì)marker 3.0.5%活性炭純化 4.1%活性炭純化 5.3%活性炭純化
由圖2可以看出，粗酶液目的蛋白由α亞基(28 kDa)與β亞基(58 kDa)組成(泳道1)；加入活性炭后，蛋白條帶明顯減少(泳道3、4、5)，表明不同用量活性炭對CPC?；妇幸欢ǖ募兓饔?，活性炭純化是一種較簡單可行的方法。
2.3 固定化酶性質(zhì)考察
采用1.3.2方法制得的LX-1000EPC固定化酶和LX-1000HA固定化酶的酶活分別為86 U·g-1和55 U·g-1，酶活收率分別為29%和18%。本實驗以游離酶為參照，研究了這2種固定化酶的熱穩(wěn)定性與pH值穩(wěn)定性，同時對酶與載體的結(jié)合強度進行了考察。
2.3.1 熱穩(wěn)定性
LX-1000HA固定化酶、LX-1000EPC固定化酶及游離酶的熱穩(wěn)定性如圖3所示。
由圖3可知，固定化酶的熱穩(wěn)定性遠遠高于游離
圖3 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性(50 ℃)
酶的熱穩(wěn)定性。50 ℃下放置1 h，LX-1000HA固定化酶殘余酶活為72%，LX-1000EPC固定化酶殘余酶活為40%，而游離酶殘余酶活僅5%。固定化酶的酶活與固定化方向、結(jié)合位點及結(jié)合力有關[14]。雖然LX-1000HA固定化酶的初始酶活(55 U·g-1)低于LX-1000EPC固定化酶(86 U·g-1)，但LX-1000EPC固定化酶中酶與載體的結(jié)合力主要為共價結(jié)合力，而LX-1000HA固定化酶除了酶與載體之間的共價結(jié)合力外，還存在載體(帶正電)與酶分子(帶負電)間的靜電引力，因此LX-1000HA固定化酶中酶與載體的綜合結(jié)合力可能大于LX-1000EPC固定化酶，這也許是LX-1000HA固定化酶熱穩(wěn)定性高于LX-1000EPC固定化酶的主要原因。
2.3.2 pH值穩(wěn)定性
LX-1000HA固定化酶、LX-1000EPC固定化酶及游離酶的pH值穩(wěn)定性如圖4所示。
圖4 固定化酶和游離酶的pH值穩(wěn)定性
由圖4可以看出，游離酶的最佳pH值為8.0，放置1 d后的殘余酶活為65%，放置1.5 d后的殘余酶活為50%；LX-1000HA固定化酶在pH值9.0溶液中顯示出較高的穩(wěn)定性，放置3 d后的殘余酶活為95%，放置7 d后的殘余酶活為90%；LX-1000EPC固定化酶在pH值8.0溶液中顯示出較高的穩(wěn)定性，放置3 d后的殘余酶活為55%，放置7 d后的殘余酶活為52%。表明，固定化酶的pH值穩(wěn)定性高于游離酶，其中LX-1000HA固定化酶具有更高的pH值穩(wěn)定性。
2.3.3 酶與載體的結(jié)合強度
CPC?；赣梢粋€α亞基和一個β亞基構成，并且α亞基和β亞基之間沒有二硫鍵。因此，CPC?；冈诓煌d體上的結(jié)合強度可以通過SDS解吸實驗進行評價[15]，結(jié)果如圖5所示。
1.粗酶液 2.LX-1000EPC固定化酶 3.蛋白質(zhì)marker 4.LX-1000HA固定化酶
從圖5可以看出，LX-1000HA固定化酶較LX-1000EPC固定化酶具有更高的穩(wěn)定性。對于LX-1000HA固定化酶，CPC?；傅摩羴喕挺聛喕嘉幢幌疵撓聛?，表明CPC?；傅摩羴喕挺聛喕伎梢耘cLX-1000HA載體進行多點共價交聯(lián)，結(jié)合緊密；對于LX-1000EPC固定化酶，CPC酰化酶的β亞基被洗脫下來，而α亞基沒有，表明CPC?；钢兄挥笑羴喕梢耘cLX-1000EPC載體共價交聯(lián)，β亞基結(jié)合強度較低。這可能是因為，CPC?；阜肿又泻匈嚢彼岬臄?shù)量和分布對于其與LX-1000EPC載體的結(jié)合有著至關重要的作用[16-17]，α亞基(28 kDa)含有6個賴氨酸和1個具有較高反應活性的N端氨基，而β亞基(58 kDa)只含有2個賴氨酸，并且其中一個被包裹于內(nèi)部，因此酶分子的β亞基往往不能與LX-1000EPC載體形成穩(wěn)定的共價鍵而較易被SDS洗脫下來。此結(jié)果也從側(cè)面說明賴氨酸數(shù)量多少、分布是否均勻?qū)绊懝潭ɑ钢忻概c載體的結(jié)合強度[18]。
2.4 固定化酶催化性能評價
2.4.1 固定化酶的催化性能
在25 ℃、pH值8.5的條件下，按8 U·mL-1投加固定化酶，考察固定化酶對底物CPC生成7-ACA的催化性能，結(jié)果見圖6。
圖6 LX-1000HA固定化酶和LX-1000EPC 固定化酶的催化性能
由圖6可以看出，對于LX-1000HA固定化酶，反應初始階段催化速率很快，反應20 min時的CPC轉(zhuǎn)化率已達到86%，7-ACA收率為85%；反應40 min時的CPC轉(zhuǎn)化率達到99%，7-ACA收率為97%。對于LX-1000EPC固定化酶，反應20 min時的CPC轉(zhuǎn)化率為76%，7-ACA收率為74%；而當CPC轉(zhuǎn)化率達到97%，7-ACA收率為96%時，反應需要60 min。表明，在相同的催化條件下，LX-1000HA固定化酶的催化性能優(yōu)于LX-1000EPC固定化酶。這可能是由于，不同載體具有不同的物理和化學性質(zhì)(如孔徑、疏水性、親水性以及表面化學性質(zhì))，對酶的附著會有影響，進而影響酶的固定化和固定化酶的催化性能[14]。
2.4.2 固定化酶的催化穩(wěn)定性
大多數(shù)情況下，固定化酶的穩(wěn)定性隨著溫度的降低而升高，但是溫度太低又會影響其催化反應速度[19]，因此本實驗對25 ℃下LX-1000HA固定化酶的反應批次進行考察，結(jié)果見圖7。
圖7 LX-1000HA固定化酶的13批次催化反應結(jié)果
由圖7可以看出，隨著反應批次的增加，催化反應時間逐漸延長。這是因為，隨著反應批次的增加，固定化酶的酶活逐漸下降，因此需要延長反應時間以保證CPC的轉(zhuǎn)化率。
對13批次催化反應數(shù)據(jù)進行擬合，推算出反應39批次時達到LX-1000HA固定化酶的半衰期，此時LX-1000HA固定化酶催化反應所需時間為第1批次反應時間的2倍。而Zhu等[13]在25 ℃下進行LX-1000EPC固定化酶的催化反應，固定化酶的半衰期為24批次。表明，LX-1000HA固定化酶的反應批次較LX-1000EPC固定化酶提高了62.5%，LX-1000HA固定化酶具有更高的催化穩(wěn)定性，這對于7-ACA的一步酶法生產(chǎn)技術的完善及日后的產(chǎn)業(yè)化應用具有重要意義。
3 結(jié)論
將含頭孢菌素C(CPC)酰化酶的重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcy在50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵液OD600可達19.5，酶活達到11 542 U·L-1；CPC?；复置敢航?jīng)1%活性炭純化后，比酶活由6.56 U·mg-1提高到10.77 U·mg-1；然后將純化的CPC?；腹矁r結(jié)合固定在氨基載體LX-1000HA和環(huán)氧基載體LX-1000EPC上，并對固定化酶的熱穩(wěn)定性及pH值穩(wěn)定性進行考察。結(jié)果表明，LX-1000HA固定化酶的初始酶活較LX-1000EPC固定化酶低，但其熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性以及酶與載體的結(jié)合強度均高于LX-1000EPC固定化酶；并且在固定化酶投加量相同時，LX-1000HA固定化酶的催化性能優(yōu)于LX-1000EPC固定化酶。對LX-1000HA固定化酶進行催化批次實驗，在催化39批次時達到半衰期，提高了酶的重復利用率，獲得了性能優(yōu)良的固定化CPC?；?，對于7-ACA的一步酶法生產(chǎn)技術的完善及日后的產(chǎn)業(yè)化應用具有重要意義。
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Immobilization of Recombinant Cephalosporin C Acylase
ZHU Lin-lin1,CHANG Yan-hong1*,YAO Shun1,LUO Hui2,YU Hui-min3,SHEN Zhong-yao3
(1.DepartmentofEnvironmentalEngineering,UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing100083,China;2.DepartmentofBiologicalScienceandEngineering,UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing100083,China; 3.DepartmentofChemicalEngineering,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China)
Inthispaper,therecombinantE.coliBL21(DE3)/pET28-CPCAcywhichcontainscephalosporinC(CPC)acylasewasfermentedina50Lfermentor.WhentheOD600valueofthebrothandtheenzymeactivityreached19.5and11 542U·L-1,respectively.Crudeenzymesolutionwaspurifiedby1%activatedcarbons,andthespecificenzymeactivityincreasedfrom6.56U·mg-1to10.77U·mg-1.ThenthepurifiedCPCacylasewasimmobilizedonLX-1000HA(aminocarrier)andLX-1000EPC(epoxycarrier)bycovalentbinding,andthethermalstabilityandpHvaluestabilityoftheimmobilizedenzymewereinvestigated.TheresultsshowedthattheinitialenzymeactivityofLX-1000HAimmobilizedenzymewaslowerthanthatofLX-1000EPCimmobilizedenzyme,whileitsthermalstability,pHvaluestability,andbindingstrengthofLX-1000HAimmobilizedenzymeandcarrierwerebetterthanthoseofLX-1000EPCimmobilizedenzyme.CatalyticperformanceofLX-1000HAimmobilizedenzymewasbetterthanthatofLX-1000EPCimmobilizedenzymeforthesameenzymedosage.Thehalf-lifeofLX-1000HAimmobilizedenzymewasabout39cyclesundersuchcatalyticreactionconditions.
recombination;cephalosporinCacylase;immobilizedenzyme;stability;biocatalysis
國家自然科學基金資助項目(21276023，21476025)，北京市自然科學基金資助項目(2143041)，中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項目(FRF-SD-12-007A)
2016-09-18
朱琳琳(1990-)，女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物、固定化酶及其應用，E-mail：780284613@qq.com；通訊作者：常雁紅，副教授。
10.3969/j.issn.1672-5425.2017.02.005
TQ 465.1 Q 556
A
1672-5425(2017)02-0019-06
朱琳琳，常雁紅，姚舜，等.重組頭孢菌素C?；傅墓潭ɑ芯縖J].化學與生物工程，2017，34(2)：19-24.
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