管月清，章鵬飛

(1.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與制藥工程學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000；2.杭州師范大學(xué) 材料與化學(xué)化工學(xué)院，浙江 杭州 310036)

Arvanil的綠色合成及其抗腫瘤活性

管月清1*，章鵬飛2

(1.臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與制藥工程學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000；2.杭州師范大學(xué) 材料與化學(xué)化工學(xué)院，浙江 杭州 310036)

采用微波輻射、硅膠負(fù)載和催化合成辣椒素類似物Aranvil，在高產(chǎn)率地得到Aranvil的同時(shí)，建立了一種微波輔助、硅膠負(fù)載和催化合成辣椒素及其類似物的綠色合成新方法.該方法具有無需使用腐蝕性或毒性大的羧酸活化試劑、無溶劑、操作簡單、反應(yīng)時(shí)間短、收率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn).并采用MTT法考察了Aranvil對(duì)腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和人肝癌Huh7細(xì)胞的體外增殖抑制作用，結(jié)果顯示Aranvil具有較好的抗腫瘤活性.

Arvanil；微波輻射；綠色合成；抗腫瘤活性

天然辣椒素是一種酰胺類化合物，主要存在于辣椒中.最早由 Thres(1876)從辣椒果實(shí)中分離出來，其化學(xué)名稱為N-香草基-8-甲基-6-壬烯酰胺，分子式為 C18H27NO3，此后又有一些辣椒素的同系物從辣椒果實(shí)中被發(fā)現(xiàn)，迄今為止已發(fā)現(xiàn)辣椒素同系物有14 種以上，它們都具有共同的母核(圖1)，不同之處在于分子中的R基.

圖1 辣椒素的母核結(jié)構(gòu)Fig.1 Mother nucleus of capsaicinoids

辣椒素是辣椒中主要的辛辣成分，也是離子通道蛋白TRPV1(即辣椒素受體)的高選擇性激動(dòng)劑.辣椒素可通過激活TRPV1，引起細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，從而促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、合成與貯藏，發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、止癢的作用[1-3].因此辣椒素既不會(huì)產(chǎn)生非甾體抗炎藥常出現(xiàn)的副作用，也不會(huì)引起阿片類鎮(zhèn)痛藥的成癮性，已成為臨床醫(yī)生治療糖尿病性神經(jīng)痛等疼痛的首選用藥.近年來研究表明，辣椒素還具有防治心血管疾病、促進(jìn)脂肪代謝、介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等功能，降低得慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[4-6].2012年，STOCK等[7]在《Nature Medicine》雜志上發(fā)表了他們的最新研究成果.神經(jīng)前體細(xì)胞(NPC)可以釋放辣椒素來激活腫瘤細(xì)胞的TRPV1離子通道，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡.此外，NPC介導(dǎo)的腫瘤抑制效應(yīng)可通過人工合成的辣椒素類似物Arvanil(圖2)全身給藥在成年鼠腦中被模擬出來.該研究在表明辣椒素受體TRPV1為腫瘤等慢性疾病新靶點(diǎn)的同時(shí)，也為辣椒素類化合物可用于防治慢性疾病提供了有力的科學(xué)依據(jù).因此，辣椒素及其類似物的合成和抗腫瘤活性的研究備受化學(xué)工作者的青睞.

圖2 Arvanil的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of arvanil

辣椒素及其類似物是屬于酰胺類化合物，關(guān)于酰胺類化合物物的合成，目前人們大多數(shù)是采用羧酸活性中間體與胺進(jìn)行親核取代反應(yīng)的化學(xué)合成方法[8-11].但現(xiàn)有方法部分存在反應(yīng)條件苛刻、活化試劑腐蝕性和毒性大、副產(chǎn)物多、原子經(jīng)濟(jì)性差、環(huán)境污染大等不足.因此，開發(fā)一種快速、高效、環(huán)境友好地合成辣椒素及其類似物的新方法成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)課題之一.我們?cè)谇叭说难芯炕A(chǔ)上[12]，采用微波輔射、硅膠負(fù)載和催化花生四烯酸與香蘭素胺直接進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了辣椒素Arvanil的綠色合成(圖3)，該方法具有無需使用腐蝕性或毒性大的羧酸活化試劑、無溶劑、操作簡單、反應(yīng)時(shí)間短、收率較高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn).本文還將合成所得目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行了C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和Huh7腫瘤細(xì)胞的抑制活性研究.

圖3 辣椒素Arvanil的合成路線Fig.3 Synthesis of arvanil

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Bruker-500型核磁共振儀，Thermo Scientific LCQ質(zhì)譜儀.所用試劑均為市售AR或CP.細(xì)胞培養(yǎng)箱和多功能酶標(biāo)儀為美國Thermo公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)購自上海智誠分析儀器制造有限公司；低速常溫大容量離心機(jī)購自德國Sigma公司.MTT及其他試劑均購自上海生物工程有限公司.

1.2 Arvanil的合成

香蘭素胺0.231 g(1.5 mmol)和花生四烯酸0.456 g(1.5 mmol)先溶解在乙酸乙酯(15 mL)中，隨后與1.0 g硅膠60(230～400目)混合均勻，混合好后減壓旋蒸去除溶劑，剩余物轉(zhuǎn)移到微波試管中，并放入CEM型微波反應(yīng)器中，功率設(shè)定200 W，溫度設(shè)定130 ℃，恒溫反應(yīng)時(shí)間20 min.反應(yīng)結(jié)束后，降到室溫，并加入30 mL乙酸乙酯，超聲20 min，隨后過濾，濾餅硅膠用 30 mL乙酸乙酯淋洗.所得有機(jī)相經(jīng)飽和的碳酸氫鈉溶液和10%稀鹽酸洗滌，硫酸鎂干燥，過濾，濃縮和純化得到無色液體0.57 g，收率88%.1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ：6.86 (d,1H),6.81 (s,1H),6.77 (d,1H),5.86 (m,2H),5.37(m,5H),4.35 (d,2H),3.88(s,3H),2.82 (m,3H),2.22 (d,3H),2.06 (m,3H),1.93 (m,2H),1.84～1.70 (m,2H),1.65 (m,2H),1.27 (m,6H),0.90 (t,3H);13C NMR (126MHz,CDCl3)δ：172.65,148.76,145.19,130.35,128.80,127,52,120.80,114.45,110.77,55.92,49.69,43.57,36.85,31.92,29.62,27.22,26.69,25.57,22.69,14,12; MS (ESI),m/z：440.31 [M+H]+.

1.3 Arvanil的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

采用四氮唑鹽酶還原法(Microculture Tetrozolium,MTT)測(cè)定Arvanil對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和Huh7腫瘤細(xì)胞的抑制作用.具體操作：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，每孔3 000～10 000個(gè)細(xì)胞；于37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)6～24 h；加入6個(gè)梯度濃度的待篩樣品20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)44 h；小心吸去上清液，加入80 μL新鮮RPMI-1 640培養(yǎng)液，再加入20 μL MTT溶液(5 g/L，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后吸掉上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解.在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)和對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定3復(fù)孔.

采用Logit法計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Aranvil對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和Huh7腫瘤細(xì)胞這兩種腫瘤細(xì)胞均具有較好的活性抑制作用，IC50分別為3.69×10-5mol/L和2.98×10-5mol/L.

實(shí)驗(yàn)過程中，具體觀察了Aranvil濃度在1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L給藥量條件下對(duì)人肝癌Huh7細(xì)胞活性抑制效果，如圖4所示，Aranvil濃度高于1×10-6mol/L時(shí)，Huh7細(xì)胞活性被有效抑制.

正常 1×10-6 mol/L 1×10-8 mol/L圖4 Arvanil對(duì)人肝癌Huh7細(xì)胞的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of arvanil on hepatocellular carcinoma (HCC) Huh7 cells

2 結(jié)果與討論

在合成辣椒素Aranvil的實(shí)驗(yàn)中，主要考察了酸與胺的用量、硅膠的用量；微波反應(yīng)溫度；微波反應(yīng)時(shí)間對(duì)酸與胺的酰胺化反應(yīng)的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明反應(yīng)在香草胺和花生十四烯酸投料物質(zhì)的量比為1∶1、硅膠的用量為酸與胺的總投料量1～1.5倍，微波反應(yīng)溫度為130 ℃，反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí)，酰胺化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最好，Arvanil的收率最高(88%).反應(yīng)過程中，無需使用任何溶劑及羧酸活化劑、反應(yīng)時(shí)間短、反應(yīng)副產(chǎn)物為水；反應(yīng)結(jié)束后，只需經(jīng)過超聲萃取等簡單的后處理操作便可得到目標(biāo)產(chǎn)物，且硅膠可有效地回收再利用.整個(gè)試驗(yàn)過程高效便捷、環(huán)境友好.

其次，我們分別研究了Arvanil對(duì)腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞及人肝癌Huh7細(xì)胞的增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)Arvanil對(duì)上述兩種腫瘤細(xì)胞均具有較好的活性抑制作用.

3 結(jié)論

通過對(duì)在微波輔射、硅膠負(fù)載和催化的條件下合成Arvanil的研究，建立了一種微波輔助、硅膠負(fù)載和催化合成辣椒素及其類似物的綠色合成新方法.該方法具有無需使用腐蝕性或毒性大的羧酸活化試劑、無溶劑、操作簡單、反應(yīng)時(shí)間短、收率較高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn).合成的目標(biāo)產(chǎn)物具有較好的抗腫瘤活性，為后期作用機(jī)制研究和辣椒素抗腫瘤方面應(yīng)用開發(fā)奠定了良好基礎(chǔ).

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[責(zé)任編輯：張普玉]

Green synthesis and antitumor activity of arvanil

GUAN Yueqing1*,ZHANG Pengfei2

(1.DepartmentofMedicalandPharmaceuticalEngineering,TaizhouVocational&TechnicalCollege,Taizhou318000,Zhejiang,China; 2.CollegeofMaterial,ChemistryandChemicalEngineering,HangzhouNormalUniversity,Hangzhou310036,Zhejiang,China)

An improved and green methodology,which has the advantages of free solvent,reducing the reaction time,mild reaction condition,simple operation,high yield and environmental friendship,has been developed for the catalytic synthesis of capsaicin and its analogues under microwave irradiation using silica gel as a solid support.To estimate the inhibitory effects of the arvanil,MTT assay in the cell lines,including C6 and Huh7,was adopted.The result showed that the target exhibited good inhibitory activity against the estimated cell lines.

Aranvil; microwave irradiation; green synthesis; antitumor activity

2016-11-29.

國家自然科學(xué)基金(21376058)，臺(tái)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(131KY07)，臺(tái)州市博士后科研基金項(xiàng)目(2013BSH01).

管月清(1976-)，女，高級(jí)工程師，主要從事藥物合成及分析.*

，E-mail：gbzhou_zju@126.com.

TQ031.2

A

1008-1011(2017)01-0027-04