許 敏， 李異玲

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001

專題·非酒精性脂肪性肝病

不同研究方法在PNPLA3I148MSNP誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病發(fā)生、發(fā)展中的作用

許 敏， 李異玲

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是引起慢性肝病最常見的原因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除外肥胖、胰島素抵抗(IR)、高脂血癥等危險(xiǎn)因素，遺傳因素在其發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。PNPLA3，又稱脂肪營養(yǎng)素，與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。rs738409處基因SNP導(dǎo)致148位異亮氨酸被蛋氨酸取代，自2008年全基因組分析證實(shí)了PNPLA3 I148M與NAFLD發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，此后學(xué)者采用了多種研究方法以解釋兩者之間可能的機(jī)制。本文從人群研究、動物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等幾個(gè)方面來闡述PNPLA3 I148M SNP與NAFLD的相關(guān)性。

非酒精性脂肪性肝?。缓琾atatin樣磷脂酶3；人群研究；動物實(shí)驗(yàn)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是包括單純性脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化、肝癌在內(nèi)的一個(gè)疾病譜[1]。NAFLD目前已成為發(fā)達(dá)國家中引起慢性肝病最常見的原因[2]，有可能成為未來十年中肝移植的主要原因[3]。西方國家NAFLD發(fā)病率為20%～30%[4]，而在亞洲,其發(fā)病率為5%～18%[5]。除了飲食結(jié)構(gòu)及生活方式，遺傳因素在NAFLD的發(fā)病中也發(fā)揮著重要的作用。自2008年Romeo提出含patatin樣磷脂酶域3(PNPLA3)I148M與NAFLD發(fā)病的相關(guān)性到2014年Julia Kozlitina等提出TM6SF2 E167K與NAFLD發(fā)病的相關(guān)性，遺傳因素已成為近年研究的熱點(diǎn)。因此，目前的“多次打擊”學(xué)說[6]已代替了既往的“二次打擊”學(xué)說，其中包括腸道菌群、遺傳因素和表觀遺傳學(xué)因素等幾個(gè)新發(fā)現(xiàn)的影響因素。

PNPLA3基因位于22號染色體上，又稱為脂肪營養(yǎng)素(adiponutrin)，屬于patatin樣磷脂酶家族[7]，目前被認(rèn)為是與NAFLD發(fā)病最相關(guān)的遺傳因素[8]。本文擬就不同實(shí)驗(yàn)方法在PNPLA3 I148M與NAFLD之間關(guān)系作用中的研究作一概述。

1 人群研究

通過在西班牙裔、非裔及歐裔美國人群中展開全基因組分析，Romeo等[9]發(fā)現(xiàn)，PNPAL3 I148M能在不影響血糖及血脂代謝的情況下改變肝臟脂肪含量及血清轉(zhuǎn)氨酶水平，說明其與NAFLD的發(fā)生及肝損傷有關(guān)。此后，多項(xiàng)研究[10-11]證實(shí)了PNPLA3 I148M與NAFLD發(fā)生的相關(guān)性，既往研究[12]也首次證實(shí)，中國大陸人群中PNPLA3 I148M變異與肝臟脂肪變性及轉(zhuǎn)氨酶水平之間的相關(guān)性。除去與NAFLD的發(fā)生相關(guān)，人群研究還發(fā)現(xiàn)，其與NAFLD的進(jìn)展包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[13]、肝纖維化[11，13]、肝硬化及肝癌的發(fā)生均有關(guān)。通過對肝活檢樣本分析，Speliotes等[13]發(fā)現(xiàn)，G等位基因能增加脂肪變性、小葉炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變及纖維化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，從解剖學(xué)角度確切證實(shí)了其與NAFLD發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。Rotman等[11]得到了相似的結(jié)論，但該研究未發(fā)現(xiàn)其與NASH及肝細(xì)胞氣球樣變之間的關(guān)系，可能是因?yàn)檫x擇性差異的存在。值得一提的是，該研究在兒童中雖未發(fā)現(xiàn)兩者之間的關(guān)系，但發(fā)現(xiàn)攜帶PNPLA3 I148M個(gè)體肝活檢年齡較小，差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義但有變化趨勢。

Speliotes等[13]發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者中PNPLA3 CC基因型的個(gè)體代謝綜合征反而較重，說明PNPLA3誘導(dǎo)的NAFLD不同于既往我們理解的肥胖誘導(dǎo)的NAFLD。通過對人體肝組織脂質(zhì)成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，PNPLA3 I148M降低肝臟TG中硬脂酸含量、增加α-亞麻酸含量[14]，且與胰島素抵抗(IR)誘導(dǎo)的NAFLD相比，PNPLA3 I148M誘導(dǎo)的NAFLD肝臟神經(jīng)酰胺水平較低[15]，這從一定程度上解釋了PNPLA3為什么能在未出現(xiàn)IR時(shí)誘導(dǎo)NAFLD的發(fā)生。此外，PNPLA3 I148M誘導(dǎo)的NAFLD中患者肝臟脂肪含量增加但肝臟脂質(zhì)從頭合成減少[16]，而脂質(zhì)從頭合成在代謝綜合征相關(guān)的NAFLD中發(fā)揮著重要的作用[17]，這也能對以上現(xiàn)象加以解釋。在對中國上海人群的研究[18]發(fā)現(xiàn)，BMI和PNPLA3 rs738409對NAFLD的發(fā)生具有聯(lián)合效應(yīng)，且PNPLA3相關(guān)性NAFLD肥胖患者在生活方式干預(yù)中受益更多[19]，因此，積極進(jìn)行教育宣傳以避免體質(zhì)量增加極其重要。

Aragonès等[20]發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者中，PNPLA3表達(dá)水平與脂肪變性嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而qRT-PCR還發(fā)現(xiàn),PNPLA3與轉(zhuǎn)錄因子肝X受體(LXRa)、過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-α)及固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2(SREBP2)的表達(dá)呈正相關(guān)，說明PNPLA3與肝臟脂質(zhì)聚集有關(guān)。Valenti等[21]發(fā)現(xiàn)，通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)PNPLA3 I148M能升高Fas配體(FASL)，且與脂肪變性相關(guān)肝損傷分子胰島素受體(INSR)、PPAR-α的水平有關(guān)，從分子水平上提出了其誘導(dǎo)NAFLD發(fā)生、發(fā)展可能的機(jī)制。但這些結(jié)果僅體現(xiàn)在mRNA水平上，未經(jīng)蛋白水平證實(shí)，因此，仍有待更多的研究以證實(shí)。近年來，脂肪因子與脂肪肝的發(fā)生成為研究的熱點(diǎn)，Mai等[22]發(fā)現(xiàn)，攜帶G等位基因的個(gè)體中，血清脂聯(lián)素水平較低，但這一結(jié)果也值得考慮，因?yàn)橹行男苑逝忠矔档脱逯?lián)素水平[23]，且該實(shí)驗(yàn)不能證實(shí)兩者之間是否有因果關(guān)系。除此之外，研究[24]還發(fā)現(xiàn)，PNPLA3 I148M能通過影響極低密度脂蛋白(VLDL)分泌進(jìn)而促進(jìn)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集。

2 動物實(shí)驗(yàn)

肝臟PNPLA3的表達(dá)與脂肪變性本身關(guān)系不大，而與飲食結(jié)構(gòu)及運(yùn)動關(guān)系密切。大鼠禁食[25]后，PNPLA3表達(dá)降低，而進(jìn)食則促進(jìn)其表達(dá)上調(diào)，說明PNPLA3可能具有脂肪合成作用。此外，飲食結(jié)構(gòu)也能影響肝臟PNPLA3表達(dá)，與高脂飲食相比，高糖飲食能顯著促進(jìn)小鼠肝臟PNPLA3表達(dá)[26]，因此，PNPLA3可能與碳水化合物誘導(dǎo)的脂肪從頭生成作用有關(guān)。而Dubuquoy等[27]通過向小鼠體內(nèi)注射腺病毒發(fā)現(xiàn)，PNPLA3的表達(dá)受碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)及固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP1c)的調(diào)節(jié)，且高糖飲食[26]時(shí)，小鼠肝臟PNPLA3 mRNA表達(dá)與脂肪生成作用有關(guān)的基因如SREBP-1c、乙酰輔酶A羧化酶-1(ACC-1)的表達(dá)相似，說明高糖飲食可能通過調(diào)節(jié)SREBP1c的表達(dá)調(diào)節(jié)PNPLA3的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)脂肪合成作用。值得一提的是，研究[26]發(fā)現(xiàn)，自發(fā)運(yùn)動能顯著降低PNPLA3的表達(dá)，因此，對人群適時(shí)進(jìn)行相關(guān)的健康宣傳極其必要。

人群研究發(fā)現(xiàn)，PNPLA3 I148M突變能誘導(dǎo)脂肪肝的發(fā)生，因此，有學(xué)者猜測PNPLA3具有脂解酶活性，而I148M突變則抑制了這一作用。但這一假說迅速被推翻，因?yàn)樾∈篌w內(nèi)PNPLA3的缺失[28]不會誘導(dǎo)小鼠脂肪肝的出現(xiàn)，也不會影響血脂及血糖水平。隨后，Basantani等[29]也得出了相似的結(jié)論，說明PNPLA3并非為單純的脂解酶活性。盡管如此，衣霉素處理構(gòu)造內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型[30]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀況下野生型小鼠體內(nèi)的PNPLA3能通過BXP1通路促使肝臟TG聚集，誘導(dǎo)脂肪肝的發(fā)生，且能通過影響固醇輔酶A去飽和酶1(SCD1)的表達(dá)改變肝臟游離脂肪酸(FFA)構(gòu)成，因此，PNPLA3的具體生理功能仍有待探討。

為探究PNPLA3 I148M在NAFLD中發(fā)揮的作用，Li等[31]構(gòu)建了肝臟及脂肪組織過表達(dá)野生型或突變型PNPLA3的轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有肝臟過表達(dá)PNPLA3 I148M才會誘導(dǎo)脂滴變大、數(shù)目變多及脂肪肝的出現(xiàn)。其中，脂滴變大可能與細(xì)胞死亡誘導(dǎo)DFFA類似效應(yīng)C(CIDEC)表達(dá)含量升高有關(guān)，但這一關(guān)系仍需更多研究以證實(shí)。同位素標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，PNPLA3 I148M能通過單甘油酯的途徑及抑制脂滴甘油三脂(TAG)水解作用導(dǎo)致肝臟脂肪含量增加，但研究未發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)活性、VLDL分泌速率、脂肪酸氧化速率間的差異。該研究還發(fā)現(xiàn)，PNPLA3 I148M突變能誘導(dǎo)肝臟脂肪酸重構(gòu)。為了使動物模型更接近于人體PNPLA3 I148M表現(xiàn)型，Smagris等[32]構(gòu)建了表達(dá)生理劑量的突變基因的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)普通飲食對肝臟脂質(zhì)含量影響不大，而高糖飲食則能在未出現(xiàn)IR時(shí)誘導(dǎo)肝臟脂滴數(shù)目變大及脂肪肝的發(fā)生，但高糖飲食的小鼠中，與肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)的基因SREBP-1c及其靶基因mRNA水平、TG脂解作用(激素敏感性脂肪酶HSL、脂肪甘油三酯脂肪酶ATGL)、脂肪酸氧化、肝臟炎癥及纖維化相關(guān)的基因表達(dá)未見顯著差異。此外，該研究也未發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪酸組成在各組間的差異，這與之前鼠過表達(dá)人PNPLA3 I148M時(shí)得出的結(jié)果不甚一致，仍需后續(xù)研究加以證實(shí)。但他們發(fā)現(xiàn),攜帶突變基因的小鼠體內(nèi)CGI-58表達(dá)含量增加，說明失活的PNPLA3蛋白可能通過隔絕CGI-58，限制了肝臟甘油三酯酯酶(ATGL)對TAG的水解，進(jìn)而誘導(dǎo)脂肪肝的發(fā)生，也有可能是PNPLA3 I148M與ATGL競爭結(jié)合CGI-58，進(jìn)而降低脂解活性，導(dǎo)致脂肪變性及脂滴增大[33]。但這些假說仍有待考證。

3 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

人肝細(xì)胞中[27，34]，腺病毒誘導(dǎo)SREBP1c過表達(dá)能促進(jìn)PNPLA3的表達(dá)，但過表達(dá)ChREBP對PNPLA3則影響不大，計(jì)算機(jī)模擬分析在人PNPLA3啟動子處發(fā)現(xiàn)了SRE結(jié)合位點(diǎn)，而未發(fā)現(xiàn)ChpRE結(jié)合位點(diǎn)也證實(shí)了這一結(jié)果。盡管過表達(dá)ChREBP對PNPLA3影響不大，但ChREBP沉默能抑制高糖誘導(dǎo)促PNPLA3表達(dá)作用[34]，可能與ChREBP的過表達(dá)需其他輔因子的共同參與或物質(zhì)差異性有關(guān)，但他們的研究發(fā)現(xiàn)，ChREBP能以葡萄糖依賴的方式結(jié)合到PNPLA3啟動子上，這與之前計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果不甚一致，因此仍有待探討。除此之外，研究[35]還發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞中胰島素能通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路調(diào)控SREBP-1c，進(jìn)而通過SRE和NFY的表達(dá)調(diào)節(jié)PNPLA3的表達(dá)。

Sf9細(xì)胞中提純的人PNPLA3蛋白[36]具有甘油糖脂水解酶活性及硫酯酶活性，而I148M突變則降低這一作用，但研究發(fā)現(xiàn)，CGI-58并非其發(fā)揮水解作用的輔因子，這與Pingitore等[37]從酵母中提純得出的結(jié)果一致。Huang等[36]還發(fā)現(xiàn)，PNPLA3蛋白對其他脂質(zhì)如磷脂、膽固醇酯及視黃酯基本無水解作用。而腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞[34]也證實(shí)了PNPLA3 I148M能降低TAG水解作用。

從原核生物(E.coli)提純的PNPLA3[38]發(fā)現(xiàn)其具有LPAAT活性，I148M能通過增強(qiáng)其作用進(jìn)而誘導(dǎo)NAFLD的發(fā)生。但Sf9細(xì)胞中提純的PNPLA3[36]則未發(fā)現(xiàn)其具有甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(GPAT)、LPAAT、二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)活性。而從酵母提純的PNPLA3[37]則發(fā)現(xiàn)I148M能降低LPAAT活性，盡管與脂解酶活性相比，這一活性顯得極其微弱。造成以上差異的原因可能與應(yīng)用系統(tǒng)的不同有關(guān)。肝細(xì)胞內(nèi)的研究[34]發(fā)現(xiàn),PNPLA3 I148M與脂質(zhì)合成有關(guān)，但這一作用依賴于FFA的存在，可能與FFA具有穩(wěn)定PNPLA3蛋白的作用有關(guān)[39]。因此，PNPLA3及其突變蛋白在誘導(dǎo)脂質(zhì)合成方面仍需更多的研究加以證實(shí)。

PNPLA3與脂滴關(guān)系密切。PNPLA3定位于脂滴[34，40]，但這一定位作用依賴于完整的Brummer box結(jié)構(gòu)域的存在。PNPLA3 I148M過表達(dá)[40]能誘導(dǎo)脂滴增大，而當(dāng)誘導(dǎo)PNPLA3和ABDH5/CGI-58共轉(zhuǎn)染時(shí)，脂滴變小，因此PNPLA3可能聯(lián)合ABHD5或PNPLA2調(diào)節(jié)脂滴代謝，進(jìn)而影響胞內(nèi)脂質(zhì)含量。此外，PNPLA3能以FA選擇性的方式介導(dǎo)肝臟TAG重構(gòu)[41]，而PNPLA3 I148M缺乏這一作用。它會導(dǎo)致肝臟富含疏水TAG脂滴的大量聚集，進(jìn)而導(dǎo)致TAG動員速率下降[42]，因此，長期過表達(dá)PNPLA3 I148M會導(dǎo)致具有抵抗水解作用的TAG大量聚集進(jìn)而出現(xiàn)脂肪肝。

4 其他研究

計(jì)算機(jī)模擬分析能幫助我們了解基因突變導(dǎo)致酶功能受損的結(jié)構(gòu)因素。計(jì)算機(jī)分子力學(xué)方法模擬PNPLA3[43]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)I148M突變能改變酶的構(gòu)象，一方面影響底物進(jìn)入催化位點(diǎn)，另一方面還能降低底物與酶的親和力，進(jìn)而誘導(dǎo)NAFLD的發(fā)生。

人群研究多為病例對照研究，它能提示PNPLA3與NAFLD發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，但它在解釋具體機(jī)制上仍有所欠缺。動物實(shí)驗(yàn)及體外研究能在一定程度上彌補(bǔ)人群研究的缺陷，此外，考慮到倫理因素，一些研究只能通過動物實(shí)驗(yàn)或體外實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。但由于大鼠與人體的物種差異性、部分動物模型構(gòu)建的困難性、肝癌細(xì)胞系與人體肝細(xì)胞功能差異性、細(xì)胞環(huán)境過于單一難以模擬人體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境等多種因素，它們在真正應(yīng)用到人體內(nèi)時(shí)仍需充分考慮。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)通過多種研究方法以相互補(bǔ)充其缺陷，進(jìn)而得到較為準(zhǔn)確的研究成果。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

DifferentresearchmethodsonexplainingmechanismofPNPLA3I148MSNPassociatednon-alcoholicfattyliverdisease

XU Min, LI Yiling

Department of Gastroenterology, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the main cause of chronic hepatic disease, which is associated with obesity, insulin resistance (IR) and hyperlipidaemia. Recently, ongoing researches discovered that genetic factors contributed to pathogenesis of NAFLD. PNPLA3, also called adiponutrin, and rs738409 SNP encoding for the Isoleucine to Methionine substitution at position 148 (I148M), which is involved in lipid metabolism. PNPLA3 I148M is associated with NAFLD, several kinds of methods are used to explain the mechanism between PNPLA3 I148M and NAFLD, the main purpose is to provide an overview of different methods on explaining association between PNPLA3 I148M SNP and NAFLD.

Non-alcoholic fatty liver disease; Patatin-like phospholipase domain containing 3; Population-based study; Animal experiments

R575.5

A

1006-5709(2017)10-1081-04

2016-11-22

國家自然科學(xué)基金(81570519)

李異玲，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，教授，研究方向：非酒精性脂肪性肝病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail： lyl-72@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.10.001