張 超,吳建國,易 駿,吳錦忠,鄭承劍,吳巖斌,*

(1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建福州 350122;2.福建教育學院理科部,福建福州 350001;3.第二軍醫(yī)大學藥學院生藥教研室,上海 200433)

HPLC-ELSD法測定三種植物基原金線蓮的金線蓮苷含量

張 超1,吳建國1,易 駿2,吳錦忠1,鄭承劍3,吳巖斌1,*

(1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建福州 350122;2.福建教育學院理科部,福建福州 350001;3.第二軍醫(yī)大學藥學院生藥教研室,上海 200433)

建立HPLC-ELSD法,測定三種植物基原金線蓮中金線蓮苷含量。采用phenomenex NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-水(92∶8,V/V)為流動相進行等度洗脫,流速為0.8 mL/min,柱溫室溫,ELSD霧化室溫度為70 ℃,氮氣流速為1.5 L/min。實驗結(jié)果表明,金線蓮苷進樣量在76.02～2432.64 μg/mL范圍內(nèi)線性良好(r=0.9991);精密度、穩(wěn)定性、重復性實驗的RSD均≤3%;平均加樣回收率為97.55%,RSD為1.50%(n=6)。33批次金線蓮的金線蓮苷含量在6.37%～22.66%之間,平均含量為15.00%,存在較大的差異(RSD=26.29%)。該方法快速、簡便,結(jié)果準確、可靠,適用于金線蓮中金線蓮苷的定量分析。

金線蓮,金線蓮苷,HPLC-ELSD

金線蓮來源于蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoectochilus)植物的新鮮或干燥全草。具有清熱涼血、祛風利濕等功效,用于腎炎、膀胱炎、糖尿病、支氣管炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、小兒急驚風等癥[1]。金線蓮還未被《中國藥典》收載,對于金線蓮原植物的來源,一直以來也有較大爭議?！陡＝ㄖ兴幉臉藴省肥蛰d的金線蓮原植物來源為蘭科開唇蘭屬植物花葉開唇蘭(金線蘭)Anoectochilusroxburghii[1],《中國植物志》收載的金線蓮原植物來源為臺灣銀線蘭A.formosanus[2],《中華本草》、《全國中草藥匯編》等收載的金線蓮包括金線蘭和臺灣銀線蘭[3-4]。金線蓮是閩臺地方特色藥材,民間把金線蘭和臺灣銀線蘭都當成金線蓮使用。另外,云南地區(qū)把滇越金線蘭A. chapaensis也當成金線蓮使用[5-6]。以上這些不同植物基原的開唇蘭屬植物都當做金線蓮使用是否合理,仍有待探明。

金線蓮迄今尚未有統(tǒng)一的質(zhì)量標準,目前國內(nèi)外學者多以黃酮的含量作為金線蓮質(zhì)量控制的主要模式,但這些成分缺乏專屬性,沒有體現(xiàn)與藥效的相關(guān)性,難以真正反映藥材內(nèi)在質(zhì)量。如測定金線蓮中槲皮素、山奈酚和異鼠李素等黃酮類成分的含量[7-10],而這些黃酮類成分既不是其主要有效成分,也不是其專屬性成分,檢測它們對其質(zhì)量控制幾乎沒有實際意義。因此,需要建立更加合理的評價指標,用于金線蓮的質(zhì)量控制。

金線蓮苷是金線蓮的特征性成分,是其主要的活性成分之一,在金線蘭、臺灣銀線蘭和滇越金線蘭中均有分布,具有降血糖、抗炎、保肝、抗骨質(zhì)疏松、降血脂等生物活性[11-15]。目前有少量文獻報道金線蘭及金線蘭提取物中的金線蓮苷的含量[16-17],但是關(guān)于不同基原金線蓮的金線蓮苷含量比較研究卻未見報道。本研究采用HPLC-ELSD法建立金線蘭、臺灣銀線蘭和滇越金線蘭三種基原金線蓮的金線蓮苷含量,為金線蓮藥材的質(zhì)量標準制定提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金線蓮 16批組培金線蘭鮮品、8批組培臺灣銀線蘭鮮品均購自福建省漳州市南靖縣,野生金線蘭和野生滇越金線蘭采自不同產(chǎn)地,金線蘭、臺灣銀線蘭和滇越金線蘭均經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定教研室黃澤豪副教授鑒定,樣本存放于福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院;金線蓮苷對照品 購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,批號:14052015;色譜乙腈 美國Fisher公司;甲醇 分析純;水 超純水。

1260高效液相色譜儀 安捷倫公司;Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器 美國GRACE 公司;MS105DU電子天平 Mettler Toledo;DFT-200手提式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為phenomenex NH2(250 mm×4. 6 mm,5 μm);流動相為乙腈-水(92∶8,V/V),等度洗脫;流速為0.8 mL/min;柱溫為室溫;蒸發(fā)光散射檢測器霧化室溫度為70 ℃,載氣為高純氮氣,載氣流速1.5 L/min;進樣量10 μL,比較DAD檢測器和ELSD檢測器對金線蓮苷測定結(jié)果的影響。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密量取金線蓮苷對照品12.67 mg(含金線蓮苷12.16 mg)到5 mL容量瓶,加甲醇到刻度,超聲溶解,配制成每1 mL含2.432 mg的金線蓮苷對照品溶液,即得。

1.2.3 樣品溶液的制備 取新鮮金線蓮,60 ℃干燥,粉碎,過60目篩得金線蓮藥材粉末。取金線蓮0.5 g,精密稱定,置具塞三角瓶中,精密加入甲醇100 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率50 kHz)40 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失重,搖勻,0.22 μm濾膜濾過,即得。

1.2.4 標準曲線及線性范圍 將對照品溶液稀釋至2432.64、1216.32、304.08、152.04、76.02 μg/mL,進樣10 μL,測定峰面積,以峰面積積分值(A)的對數(shù)值為縱坐標(y),對照品濃度B的對數(shù)值為橫坐標(X)進行線性回歸,得到金線蓮苷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 精密度實驗 精密吸取“1.2.2”項下制備的金線蓮苷對照品溶液,按“1.2.1”項下的色譜條件連續(xù)重復進樣6次,記錄峰面積。

1.2.5.2 重復性實驗 取同一批樣品(NO.24)0.5 g,平行稱取6份,按“1.2.3”項下處理,按“1.2.1”項色譜條件測定,記錄峰面積。

1.2.5.3 穩(wěn)定性實驗 取同一批樣品(NO.24)0.5 g,按“1.2.3”項下處理,按“1.2.1”項色譜條件,分別于0、2、4、6、12、24、48 h測定,記錄峰面積。

1.2.5.4 回收率實驗 取已知含有量的樣品(NO.24)0.25 g,平行稱定6份,精密稱定,置50 mL容量瓶中,精密加入對照品15 mg(含金線蓮苷14.40 mg),加甲醇至刻度,浸泡20 min,250 W超聲40 min,按“1.2.1”項色譜條件測定,記錄峰面積,計算回收率。

1.2.6 樣品含量的測定 取不同植物基原的金線蓮藥材各0.5 g,以“1.2.3”項下方法制備供試品溶液,進樣10 μL,按“1.2.1”項下測定峰面積,根據(jù)標準曲線計算其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

以乙腈-水(92∶8,V/V)為流動相進行等度洗脫,流速為0.8 mL/min,蒸發(fā)光散射檢測器霧化室溫度為70 ℃,載氣流速1.5 L/min,可有效分離出金線蓮苷,結(jié)果見圖1。圖1(A、B、C、D)分別為金線蓮苷對照品HPLC色譜圖和三種不同基原金線蓮(金線蘭、臺灣銀線蘭、滇越金線)樣品溶液的HPLC色譜圖。結(jié)果證明,在該色譜條件下,目標成分和其他雜質(zhì)峰分離良好。

圖1 金線蓮苷對照品和三種植物基原金線蓮樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of kinsenoside and Jin-Xian-Lian sample from three Anoectochilus species注:1.金線蓮苷;A.金線蓮苷對照品;B.金線蘭;C.臺灣銀線蘭;D.滇越金線蘭。

表1 加樣回收實驗結(jié)果(n=6)Table 1 Result of recovery tests(n=6)

本實驗比較了DAD檢測器和ELSD檢測器對金線蓮苷測定結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)金線蓮苷在較大濃度時,其紫外吸收度不強,而其他成分的吸收峰較強,用DAD檢測器無法準確測定金線蓮苷的含量,而采用ELSD檢測器測定金線蓮苷,金線蓮苷的吸收峰較強,其他類成分的吸收較弱,因此選擇HPLC-ELSD測定金線蓮苷的含量。這與金線蓮苷的結(jié)構(gòu)有關(guān),金線蓮苷是葡萄糖與五元內(nèi)酯環(huán)的手性碳以氧苷鍵形式連接形成的苷,結(jié)構(gòu)中沒有共軛雙鍵,以DAD檢測器檢測時只有末端吸收。另外,本實驗比較了不同色譜柱對金線蓮苷的分離效果,考察了YMC-Pack-ODS-A(250 mm×4.6 mm,5 μm)、YMC-Triart C18(250 mm×4. 6 mm,5 μm)、phenomenex NH2(250 mm×4.6 mm,5 μm),發(fā)現(xiàn)采用YMC-Pack-ODS-A和YMC-Triart C18色譜柱分離金線蓮苷,以5%乙腈-水進行等度洗脫,金線蓮苷的出峰時間在3 min左右,而且溶劑峰和其他成分的干擾較大,無法準確定量,當采用phenomenex NH2氨基柱,以92%乙腈-水等度洗脫時,金線蓮苷的出峰時間在10 min以后,其分離度比較好,避免了溶劑峰以及其他成分的干擾,故選擇phenomenex NH2氨基柱進行分離。這可能是因為金線蓮苷的極性偏大,以反相柱分離時,過早出峰,而以正相柱分離可以得到較好的分離效果。

2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

計算得到金線蓮苷含量測定的回歸方程:y=1.2891x+0.4179(r=0.9991),結(jié)果表明金線蓮苷在76.02～2432.64 μg/mL內(nèi)線性良好。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度實驗 計算結(jié)果顯示金線蓮苷峰面積的RSD值為2.06%,表明該方法測定金線蓮苷的含量精密度良好。

2.3.2 重復性實驗 計算結(jié)果顯示金線蓮苷峰面積的RSD值為2.25%,表明該方法測定金線蓮苷的含量重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實驗 計算結(jié)果顯示金線蓮苷峰面積的RSD值為2.79%,表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 回收率實驗 回收率結(jié)果見表1,結(jié)果顯示,金線蓮苷的平均回收率為97.55%,RSD為1.50%,表明金線蓮苷的加樣回收率良好。

2.4 樣品測定結(jié)果

33批次金線蓮的金線蓮苷含量有較大的差異,在6.37%～22.66%之間,其中批次16的組培臺灣銀線蘭的金線蓮苷含量最高,批次24的野生金線蓮的金線蓮苷含量最低,結(jié)果見表2。15批次組培金線蘭的金線蓮苷含量在12.54%～19.99%之間,其中批次1～5的組培金線蘭來自同一廠家,金線蓮苷的含量差異較小,在16.21%～17.83%之間,而批次6～15的組培金線蘭來自不同廠家,金線蓮苷的含量差異較大,在12.54%～19.99%之間;另外,8批次不同廠家的組培臺灣銀線蘭的金線蓮苷含量也具有一定的差異,這說明不同公司生產(chǎn)的組培金線蘭和組培臺灣銀線蘭的外植體種源可能不一樣,此外組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基、光源、光照時間等可能對金線蓮苷的積累也會有一定的關(guān)系。不同產(chǎn)地的野生金線蘭的金線蓮苷含量也差異懸殊,8批次野生金線蘭的金線蓮苷含量在6.37%～13.43%之間,2批次野生滇越金線蘭的金線蓮苷含量分別為12.44%和13.45%,這可能與不同的生長年限、不同生態(tài)環(huán)境等有關(guān)。

本研究所收集的組培金線蘭和組培臺灣銀線蘭的金線蓮苷含量普遍高于野生金線蘭和野生滇越金線蘭,因此如果要從金線蓮中提取分離金線蓮苷,可考慮采用組培金線蘭或組培臺灣銀線蘭為原料進行提取,這樣可以節(jié)約提取分離成本,也可避免該瀕危珍稀植物的過度采摘。此外,組培金線蓮的金線蓮苷含量雖然普遍高于野生金線蓮,但是組培金線蓮是否能替代野生金線蘭使用,這些都還有待進一步的研究。

表2 三種植物基原金線蓮中金線蓮苷的含量Table 2 Determination of kinsenoside in Jin-Xian-Lian from three Anoectochilus species

注:福建南靖組培金線蘭1～5來自同一廠家,6～15來自不同廠家;福建南靖組培銀線蘭1～8來自不同廠家。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示,33批次金線蓮的金線蓮苷含量在6.37%～22.66%之間,平均含量為15.00%,存在較大的差異(RSD=26.29%),提示不同植物基原、不同廠家、不同產(chǎn)地的金線蓮質(zhì)量可能存在較大差異。

本實驗建立了不同植物基原金線蓮中金線蓮苷含量的HPLC-ELSD測定方法,該定量分析方法簡便、快捷、準確,為綜合評價金線蓮的質(zhì)量提供參考。

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Content determination of kinsenoside in Jin-Xian-Lian
from threeAnoectochilusspecies by HPLC-ELSD

ZHANG Chao1,WU Jian-guo1,YI Jun2,WU Jin-zhong1,ZHENG Cheng-jian3,WU Yan-bin1,*

(1.Academy of Integrative Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China;2.Department of Chemistry and Life Science,Fujian institute of education,Fuzhou 350001,China;3.Department of Pharmacognosy,School of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

To establish a HPLC-ELSD method for determination of kinsenoside in Jin-Xian-Lian from threeAnoectochilusspecies,the HPLC system consisting of phenomenex NH2column(250 mm×4.6 mm,5 μm)and an isocratic elution system of acetonitrile-water(92∶8,V/V)as the mobile phase was adopted. The flow rate was set at 0.8 mL/min,the column temperature was room temperature,ELSD spray chamber temperature was 70 ℃,and the nitrogen flow rate was 1.5 L/min. The results indicated that the liner range of kinsenoside was 76.02～2432.64 μg/mL(r=0.9991);RSD of precision,stability and reproducibility tests were no more than 3%;average recovery rate was 97.55%(RSD=1.50%,n=6). The contents of kinsenoside in Jin-Xian-Lian from threeAnoectochilusspecies were in the range of 6.37%～22.66%,and the average content was 15.00%(RSD=26.29%). This method was quick,simple,accurate and reliable,and could be used to determine the content of kinsenoside in Jin-Xian-Lian.

Jin-Xian-Lian;kinsenoside;HPLC-ELSD

2016-07-05

張超(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：中藥活性成分及品質(zhì)評價研究，E-mail:zzcc4911@163.com。

*通訊作者:吳巖斌(1982-)，男，碩士，助理研究員，研究方向:中藥資源品質(zhì)評價，E-mail:wxsq1@163.com。

國家自然科學基金資助項目(81603230)；福州市科學技術(shù)局市校合作項目(2014-G-61)；福建中醫(yī)藥大學校管-重點學科專項(X2014138學科)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)02-0075-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.006