崔海英,柏 梅,戴錦銘,陶貴澤,林 琳

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

冷等離子體技術對黃瓜表面大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用研究

崔海英,柏 梅,戴錦銘,陶貴澤,林 琳*

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

利用冷源氮氣等離子體殺菌技術清除新鮮黃瓜表面的大腸桿菌O157∶H7生物膜。試管實驗結果表明,等離子體對大腸桿菌O157∶H7生物膜有較好的清除作用,在作用功率為500 W,連續(xù)作用4 min后對生物膜清除率達到99.99%。當?shù)入x子體應用于黃瓜表面時,作用4 min時,殺菌率達到99.21%。激光共聚焦顯微鏡結果顯示:等離子體作用后,菌落數(shù)量和細菌生物膜厚度明顯小于對照組。場發(fā)射掃描電子顯微鏡結果顯示:與對照組比較,等離子組4 min處理后細菌群落附著數(shù)量顯著變少?？傊?等離子體技術在基本維持食品感官的前提下提高了新鮮黃瓜的微生物安全性。

冷等離子體,大腸桿菌O157∶H7,生物膜,黃瓜,殺菌作用

細菌生物膜是指附著于惰性或者活性實體表面被細菌胞外大分子包裹的有組織的細菌群體[1]。極具危害的是,細菌可在食品表面形成生物膜,包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、大腸桿菌等。在食源性致病菌中,大腸桿菌O157∶H7是最危險的一種,它的感染劑量非常低,極易引起胃腸疾病的爆發(fā),而其24 h便可形成成熟的生物膜。大腸桿菌O157∶H7能夠污染各種食品,其中新鮮蔬菜污染的頻率非常高[2]。2011年德國出現(xiàn)了受出血性大腸桿菌污染的“毒黃瓜”事件,致多人死亡。隨后,“毒黃瓜”在歐洲蔓延,并造成多國千人以上的大型食源性感染事故。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157∶H7經(jīng)常會聚集在植物葉子的氣孔、被損傷處形成生物膜[3]。生物膜一旦形成即具有較強的黏附力,很難清除。

目前冷等離子體技術作為一種新興的廣譜滅菌技術,因其高效無害,操作簡單,成本低廉而被廣泛關注[4]。此外,等離子體技術作為一種物理殺菌方法可有效地避免化學消毒劑在食品中的殘留,消除其不利影響,在有效殺滅細菌的同時維持產(chǎn)品的鮮味、風味和營養(yǎng)成分。我國已有研究利用等離子體技術來殺滅食源性致病菌[5-6],而關于等離子體對細菌生物膜的清除作用的相關研究甚少。一般的蔬菜清洗劑很難穿透生物膜的胞外脂多糖基質層,因此探索安全無毒的殺菌技術來清除生物膜是目前食品安全領域研究的前沿和熱點。本文以研究清除黃瓜表面大腸桿菌O157∶H7生物膜為目的,探明等離子體是否能應用在新鮮蔬菜表面,維持微生物安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliEHEC O157∶H7 CICC 21530,E. coli O157∶H7) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供;胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(Trypticase soy broth medium,TSB) 杭州微生物試劑有限公司;普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient Agar,NA) 蛋白胨10 g,牛肉膏5 g,氯化鈉5 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL;3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)試劑盒、4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)熒光染料 碧云天生物技術研究所。

APLM-SP-YB-D1KW-3232328-2-5冷源氮氣等離子體裝置 南京愛特維電子科技有限公司;Infinite 200 PRO全波長酶標儀 奧地利Tecan Austria GmbH Untersbergstr公司;TCS SPS Ⅱ激光共聚焦顯微鏡 德國 Leica 公司;JSM-7001F場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司;Color Quest XE分光測色儀 美國HunterLab公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT染色法確定等離子體對大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用 將400 μL無菌TSB加到48孔板中,接入大腸桿菌O157∶H7(105～106CFU/mL)。將其置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),培養(yǎng)1 d后輕輕吸除孔中上部的培養(yǎng)基及懸浮細菌,用無菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS,0.03 mol/L,pH7.2)輕輕清洗三次,更換新的TSB。此步驟每天重復一次,培養(yǎng)5 d,使得孔板底部和周圍形成較多的生物膜。成熟的生物膜獲得后,用PBS沖洗掉未完全附著的細菌。將48孔板置于冷等離子體載物臺上,打開電源調節(jié)氮氣流量為100 sccm,產(chǎn)生輝光處理樣品。首先控制時間為最大限度的4 min,通過改變頻率或電流來調節(jié)等離子體的強度,不同功率(0、300、400、500、600 W)處理樣品確定合適的作用功率。確定合適功率后,不同時間(0、0.5、1、2、4 min)處理樣品,確定合適作用時間。處理后在孔板中加入400 μL MTT(0.5 mg/mL),37 ℃靜置培養(yǎng)4 h后,加入100 μL細胞裂解液,繼續(xù)靜置培養(yǎng)至紫色結晶溶解。用酶標儀測定樣品在570 nm處的吸光值。本實驗重復三次[7]。

1.2.2 菌落計數(shù)法測定等離子體對大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用 不銹鋼片(2 cm×2 cm)浸泡在無水乙醇中超聲清洗4 h,用蒸餾水清洗干凈后,121 ℃滅菌15 min。將無菌不銹鋼片加入接有大腸桿菌O157∶H7(105～106CFU/mL)的TSB培養(yǎng)基中,25 ℃靜置培養(yǎng)5 d,期間每天更換一次新鮮TSB。5 d后將不銹鋼片取出,用無菌0.03 mol/L PBS清洗三次,放入無菌培養(yǎng)皿中。隨后用等離子體按照上述步驟處理樣品以確定合適作用功率和時間，未經(jīng)等離子體處理樣品作為空白。處理后將不銹鋼片放入含有10 mL PBS的離心管中,低功率下超聲10 min,使生物膜分離形成單個浮游細菌的形式。將以上得到的菌懸液十倍梯度稀釋,涂布于NA瓊脂培養(yǎng)基測定殘存活菌數(shù)。每個測定重復三次取平均值[8]。

殺菌率或清除率(%)=(空白組菌數(shù)-實驗組殘存菌數(shù))/空白組菌數(shù)×100

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜 將蓋玻片用無水乙醇浸泡,超聲清洗4 h,用蒸餾水清洗干凈后,121 ℃滅菌15 min。將無菌蓋玻片加入無菌TSB中并接入大腸桿菌O157∶H7(105～106CFU/mL),25 ℃靜置培養(yǎng)5 d,去除游離細菌后,用等離子體處理。將蓋玻片放入DAPI溶劑中避光染色15 min,隨后用激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜。不加處理的蓋玻片作為空白對照[8]。

1.2.4 場發(fā)射掃描電鏡觀察生物膜 參照上述步驟,將大腸桿菌O157∶H7生物膜培養(yǎng)在無菌尼龍片(1 cm×1 cm)上。將尼龍片用無菌PBS清洗三次后在超凈工作臺內稍晾干,隨后用冷等離子體處理,借助場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察生物膜變化情況[3]。

1.2.5 等離子體對黃瓜表面大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用 將黃瓜皮切片,約為1 cm×1 cm,浸泡在100 ppm次氯酸鈉溶液中,超聲清洗1 h,隨后置于紫外燈下輻射處理以除去黃瓜表面原始微生物。將黃瓜片置于含有105～106CFU/mL大腸桿菌O157∶H7的TSB中,25 ℃靜置培養(yǎng)3 d。取出黃瓜片經(jīng)無菌PBS多次充分漂洗去掉浮游菌,隨后控制等離子體功率為500 W,以不同時間(0、1、2、3、4 min)處理黃瓜樣品。隨后取相同處理的黃瓜片10片,置于100 mL PBS中用均質器均質,混勻菌液后,按照平板菌落計數(shù)法進行活菌計數(shù)[9]。

1.2.6 質量與感官評價分析 將新鮮黃瓜切塊,取相同部位由等離子體500 W處理4 min后用分光測色儀分析表面顏色變化,獲得L*(lightness,亮度指數(shù),與顏色濃淡相關,L*值越大顏色越淡),a*(redness,正值越大紅光越強,負值越大綠光越強)和b*(yellowness正值越大黃光越強,負值越大藍光越強)值。最后在江蘇大學食品學院選擇20名同學對黃瓜的感官性能以打分的形式做出評價,由1～9分代表著“非常不喜歡”至“非常喜歡”[10]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 所有實驗一式三份,取其平均值。使用SPSS軟件(Windows 22.0版本)進行統(tǒng)計分析。利用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析空白組與各實驗組之間的顯著性差異,p<0.05表明有顯著性差異。誤差線對應于三組重復實驗的標準偏差。

2 結果與分析

2.1 不同功率等離子體對大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用分析

實驗通過測定生物膜的代謝活性以及殘存活菌的數(shù)量來評價等離子體的清除生物膜性能。如圖1所示,隨著處理功率的增加,實驗組的吸光值明顯降低,當處理功率為500 W和600 W時,吸光度值差別不大,所以選擇以500 W的處理功率做不同時間的實驗。而殘存菌數(shù)法與MTT法的實驗結果具有很好的相關性。未被等離子體作用的不銹鋼片上生物膜活菌數(shù)為107～108CFU/cm2,經(jīng)過等離子體作用后細菌數(shù)量不斷減少。

圖1 等離子體不同處理功率對大腸桿菌O157∶H7生物膜活性的影響Fig.1 Effect of different treatment power of plasma on the viability of E. coli O157∶H7 biofilms注:*表示與空白組有顯著性差異;圖2同。

2.2 不同時間等離子體對大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用分析

如圖2所示,經(jīng)過等離子體作用后,吸光度值顯著降低,隨著處理時間的延長,其對大腸桿菌O157∶H7代謝活力的抑制作用逐漸增強。這可能是由于等離子體的活性成分作用于細菌,使其細胞膜通透性增加,大量離子、核酸及蛋白等物質發(fā)生泄漏,細胞代謝紊亂,從而使其代謝活力受到了抑制。根據(jù)殘存菌數(shù)圖可以得出，等離子體在作用功率為500 W時,連續(xù)作用4 min時對不銹鋼片上的生物膜清除率達到99.99%。實驗結果表明等離子體能有效清除48孔板及不銹鋼片上的大腸桿菌O157∶H7生物膜。

圖2 等離子體不同處理時間對大腸桿菌O157∶H7生物膜活性的影響Fig.2 Effect of different treatment time of plasma on the viability of E. coli O157∶H7 biofilms

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜

采用激光共聚焦顯微鏡,直觀地觀察了大腸桿菌O157∶H7生物膜在等離子體處理前后的形態(tài)變化。如圖3所示,由未經(jīng)等離子體處理(空白組)至處理時間的延長,熒光強度明顯地逐漸減弱。空白對照組中大量的大腸桿菌O157∶H7相互聚集粘連,層層堆集,形成一層致密的膜結構。經(jīng)過等離子體作用后,可清晰地看到大部分生物膜結構被破壞;作用時間越長,細菌生物膜的結構遭到的破壞越大;作用1 min時,生物膜厚薄不均,結構稀疏,但仍有大量的細菌連成片呈云霧狀;作用長達4 min時,僅剩余少量細菌粘附于蓋玻片表面。實驗結果表明,等離子體對大腸桿菌O157∶H7生物膜有良好的清除效果。

圖3 激光共聚焦顯微鏡下各實驗組的生物膜形態(tài)(2000×)Fig.3 Confocal laser scanning microscope images of E. coli O157∶H7 biofilm after different treatment(2000×)注:a. 空白組;b. 等離子體處理1 min;c. 等離子體處理2 min;d. 等離子體處理4 min。

2.4 場發(fā)射掃描電鏡觀察生物膜

圖4 場發(fā)射掃描電鏡下生物膜形態(tài)Fig.4 SEM images of E. coli O157∶H7biofilm after different treatment注:a. 空白組;b. 等離子體處理4 min。

場發(fā)射掃描電鏡更加細微地觀察了等離子體對大腸桿菌O157∶H7生物膜的失活作用。如圖4所示,空白組中大腸桿菌O157∶H7聚集粘附在尼龍片表面,形成一層厚厚的緊密的生物膜結構,且能觀察到細菌分泌的絲狀多糖存在。經(jīng)等離子體處理后,完整的生物膜結構被破壞,細菌分散,剩余的少量浮游細菌聚集成較小的團狀,且細菌表面形態(tài)坍塌、不光滑,內容物滲出后菌體干癟、失活。

2.5 等離子體對黃瓜表面大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用

結果顯示,等離子體可有效地清除黃瓜表面的大腸桿菌 O157∶H7生物膜。與對照組相比,500 W處理4 min后,等離子體殺菌率達到了99.21%。當?shù)入x子體殺菌技術應用于黃瓜表面時,仍可以達到較好的殺菌效果,但與試管實驗相比較差,這是由于處理對象表面粗糙度的差異使得殺菌效果不同[11],黃瓜表面粗糙的特點降低了等離子體的殺菌作用。

圖5 等離子體(500 W)不同處理時間對黃瓜表面大腸桿菌O157∶H7生物膜活性的影響Fig.5 Effect of different treatment time(power:500 W)of plasma on the viability of E. coli O157∶H7biofilms formed on cucumber surface注:*表示與空白組有顯著性差異。

2.6 質量與感官評價分析

等離子體(500 W)處理黃瓜4 min后,表面色差實驗各項指標以及感官指標的變化情況見表1,在等離子體處理后,亮度L*值降低,a*值變大,b*值變大,表明等離子體處理使得黃瓜表面色澤不如新鮮黃瓜。感官得分可知,外觀、顏色、味道及總體接受性分數(shù)相比對照組都略有下降。綜合上述結果,等離子體對黃瓜的品質略有影響,但總體上可被大家接受。

表1 冷等離子體對黃瓜感官質量的影響Table 1 Effect of cold plasma on sensory quality of cucumber immediately after treatment

3 結論

等離子體對大腸桿菌O157∶H7生物膜有較好的清除作用,在作用功率為500 W,連續(xù)作用4 min后對生物膜清除率達到99.99%。當其應用于黃瓜表面時,作用4 min 后,殺菌率達到99.21%。結果表明等離子體對生物膜有較好的殺滅效果。本實驗還借助于激光共聚焦顯微鏡、環(huán)境掃描電子顯微鏡直接觀察了等離子體對生物膜的清除情況。以上實驗更直觀地表示了等離子體具有較好的抗生物膜性能。隨后的感官評價表明等離子體在殺滅細菌生物膜時對新鮮黃瓜的顏色、質地、及口感影響甚小。

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Antimicrobial activity of cold nitrogen plasma againstEscherichiacoliO157∶H7 biofilms on cucumber

CUI Hai-ying,BAI Mei,DAI Jin-ming,TAO Gui-ze,LIN Lin*

(School of Food & Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

This study focuses on the bactericidal effect of cold nitrogen plasma onEscherichiacoliO157∶H7(E.coliO157∶H7)biofilms formed on fresh cucumber. The results of the vitro experiment demonstrated that plasma has a satisfactory eradicating effect onE.coliO157∶H7. After exposure to plasma at 500 W for 4 min,almost 99.99% and 99.21% reductions inE.coliO157∶H7 populations were achievedinvitroand on cucumber,respectively. Confocal laser scanning microscopy(CLSM)was adopted to detect the bacterium community quantity unit area and thickness of bacterium biofilms. Scanning electron microscope(SEM)was used to observe surface structure of biofilms. In conclusion,plasma was an effective method on eradicating biofilms and simultaneously had mild effect on sensory quality of fresh cucumber.

cold nitrogen plasma;EscherichiacoliO157∶H7;biofilms;cucumber;antibacterial effect

2016-07-18

崔海英(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail:cuihaiying@ujs.edu.cn。

*通訊作者:林琳(1978-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物，E-mail:linl@ujs.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31301573)；江蘇省自然科學基金項目(BK20130493);江蘇大學第十五批大學生科研立項(15A168);江蘇省第十三批“六大人才高峰”高層次人才項目(NY-013)。

TS255

A

1002-0306(2017)02-0162-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.022