杜元元,郭小宇,李 鶴,王亞芳,楊 帆,李憲臻

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

一種新型黃原膠裂解酶的異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)表征

杜元元,郭小宇,李 鶴,王亞芳,楊 帆*,李憲臻

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

黃原膠裂解酶是一種黃原膠修飾酶,對(duì)黃原膠的改性及新型黃原膠寡糖的制備具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)從一株性能優(yōu)良的黃原膠降解菌Microbacteriumsp. XT11中首次克隆出黃原膠降解酶編碼基因xly。該基因編碼理論分子量為122027 u的蛋白質(zhì),其N端含有一條35 aa的分泌信號(hào)肽,C端含有一段392 aa的碳水化合物結(jié)合域CBM。隨后,在去除分泌信號(hào)肽及CBM的截短酶的N端融合了谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶親和純化標(biāo)簽(GST),所形成的融合蛋白XLY-GST能夠在大腸桿菌BL21(DE3)中高水平可溶表達(dá)。純化的XLY-GST表現(xiàn)出與天然黃原膠裂解酶一致的酶學(xué)性質(zhì),其最適作用溫度為40 ℃,最適pH為6.0,對(duì)堿性環(huán)境具有一定的耐受力(最高耐受pH10.5)。Ca2+和Mn2+對(duì)該裂解酶有顯著地激活作用,而Cu2+則對(duì)該酶有一定的抑制作用。XLY-GST對(duì)黃原膠側(cè)鏈的乙?；捅峄鶊F(tuán)修飾程度表現(xiàn)出較高的特異性。本實(shí)驗(yàn)所取得的研究結(jié)果對(duì)黃原膠裂解酶的制備及黃原膠側(cè)鏈修飾的研究奠定了基礎(chǔ)。

黃原膠裂解酶,黃原膠修飾,酶學(xué)性質(zhì)

黃原膠(xanthan)是一種重要的陰離子雜多糖,是由野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris)經(jīng)發(fā)酵生成[1-2]。黃原膠的主鏈?zhǔn)铅?(1,4)-糖苷鍵相連接而成的類纖維素結(jié)構(gòu),側(cè)鏈則由β-D-甘露糖-(1,4)-β-D-葡萄糖醛酸-(1,2)-α-D-甘露糖連接組成(圖1)[3-6]。黃原膠在工業(yè)上被廣泛地用作增稠劑、乳化劑、成型劑、穩(wěn)定劑、分散劑等[7]。

有研究表明,黃原膠側(cè)鏈末端甘露糖殘基的移除會(huì)導(dǎo)致其粘度下降,使黃原膠分子獲得新的性狀[8-9];此外,由側(cè)鏈截?cái)嗟狞S原膠降解所產(chǎn)生的寡糖對(duì)黑腐病的防治具有多重功效,是一種有潛在價(jià)值的黑腐病生物農(nóng)藥[10-11]。目前,研究人員主要通過不同的X.campestris突變株發(fā)酵來獲得具有不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的黃原膠,但其產(chǎn)量無法滿足工業(yè)化需求[9,12]。因此,基于黃原膠的特殊分子結(jié)構(gòu),開發(fā)能夠水解其側(cè)鏈的酶制劑以獲取改性黃原膠不失為一種更有效、更有前景的研究手段。

作為一種黃原膠側(cè)鏈修飾酶,黃原膠裂解酶(xanthan lyase,XLY,EC 4.2.2.12)通過β消減反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)黃原膠側(cè)鏈中葡萄糖醛酸與甘露糖之間α-1,2糖苷鍵的切割(圖1)[13-14]。目前為止,已報(bào)道的黃原膠裂解酶主要從其天然生產(chǎn)菌株,如PaenibacillusalginolyticusXL-1及Bacillussp. GL1中直接純化獲得,其純化過程繁瑣、成本較高,且純酶的產(chǎn)量較低,無法滿足黃原膠改性所需的酶量[15-16]。因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)一株性能優(yōu)良的黃原膠降解菌Microbacteriumsp. XT11中黃原膠裂解酶編碼基因進(jìn)行克隆,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)該酶進(jìn)行高水平表達(dá)純化并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征,旨在為工業(yè)上黃原膠側(cè)鏈的酶法改性提供有效、可靠的酶制劑生產(chǎn)方法。

圖1 黃原膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)[13]Fig.1 Chemical structure of xanthan[13]注:黃原膠裂解酶切割位點(diǎn)為箭頭所示;Glc代表D-葡萄糖;Man代表D-甘露糖;GlcA代表D-葡萄糖醛酸。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

微桿菌Microbacteriumsp. XT 11 本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離獲得并保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC AB2016011)[11];質(zhì)粒PMD18-T Simple Vector、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoR I TaKaRa生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒pGEX-2T 本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌EscherichiacoliDH5α和E.coliBL21(DE3) 中科院大連物理化學(xué)研究所趙宗保研究員課題組;質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、基因組抽提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DpnI、還原性谷胱甘肽 上海生工生物工程有限公司;親和層析填料Glutathione Sepharose 4B填料 GE公司;其他化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純;引物合成與DNA測(cè)序分析 上海生工生物工程有限公司。

梯度PCR儀(vapo.protect)、電穿孔儀(Multiporator)、臺(tái)式離心機(jī)(5804R) 德國Eppendorf公司;微量分光光度計(jì)(NanoVue plus)、蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(AKTA Prime plus)、SE260-10A-75型蛋白質(zhì)垂直電泳槽 美國GE Healthcare Life Science公司;UV-5200型紫外/可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;DKB-1906型低溫恒溫槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;JY98-ⅢN型超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

黃原膠發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L):黃原膠 3 g,葡萄糖 0.5 g,酵母浸粉 3 g,溶解于無機(jī)鹽溶液,pH7.0。無機(jī)鹽溶液(1 L):MgSO425 mg,K2HPO450 mg,KNO3700 mg,NaCl 800 mg,固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 g/L,用于XT11的發(fā)酵培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基(1 L):胰蛋白胨(Oxid,Hampshire,England)10 g,酵母提取物(Oxid)5 g,NaCl 10 g,固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 g/L,用于大腸桿菌的培養(yǎng),根據(jù)質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記需要,添加終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃原膠裂解酶編碼基因xly的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 取搖床培養(yǎng)12 h的Microbacteriumsp. XT 11新鮮發(fā)酵菌液,于4 ℃,4000×g離心收集菌體,隨后采用基因組抽提試劑盒提取基因組DNA并以之為模板進(jìn)行黃原膠裂解酶全長(zhǎng)編碼基因的擴(kuò)增。基因擴(kuò)增上游引物為5′-ATGAGGACGAAGATGTT CAGGATC-3′,下游引物為5′-CTACTCGATGGC GGAGACCAGCTG-3′。PCR反應(yīng)體系如下:100 ng XT 11基因組DNA,10 μL 5×Primer STAR Buffer,20 μmol/L引物,2.5 mmol/L dNTPs,1.25 U Prime STAR HS DNA聚合酶,加水至總體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,61 ℃ 45 s,72 ℃ 3.5 min,30個(gè)循環(huán),72 ℃ 10 min,4 ℃結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),采用凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收。將回收的黃原膠裂解酶編碼基因片段通過TA克隆連接至pMD18-T Simple Vector構(gòu)建質(zhì)粒pT-xly并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。采用數(shù)據(jù)庫NCBI BLAST程序及DNAStar MegAlign軟件對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析,利用在線分析軟件SignalP 4.1對(duì)基因的分析信號(hào)肽進(jìn)行分析。

以質(zhì)粒pT-xly為模板,設(shè)計(jì)上游引物(5′-CGGGATCCGACATGCCTCACAGCACGAGCGTCGTCG-3′,下劃線部分為BamHI識(shí)別位點(diǎn))和下游引物(5′-CGGAATTCGATCATCCCGACGTTCTTCTGAG-3′,下劃線部分為EcoRI識(shí)別位點(diǎn))進(jìn)行去除分泌信號(hào)肽及碳水化合物結(jié)合單元(carbohydrate binding module,CBM)的黃原膠裂解酶基因片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件基本同上(72 ℃延伸時(shí)間縮短為2.5 min)。將回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pGEX-2T利用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切,將回收的酶切片段與質(zhì)粒按照濃度比為1∶3的比例進(jìn)行16 ℃連接過夜,轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含終濃度為100 μg/mL 氨芐青霉素的LB平板,挑選陽性克隆并進(jìn)行BamH I 和EcoR I雙酶切驗(yàn)證鑒定,正確重組質(zhì)粒命名為pGEX-xly。重組質(zhì)粒的構(gòu)建路線如圖2所示。

圖2 黃原膠裂解酶表達(dá)載體pGEX-xly構(gòu)建路線圖Fig.2 Schematic description on the construction of pGEX-xly

1.3.2 黃原膠裂解酶的異源表達(dá)及純化 將重組質(zhì)粒pGEX-xly熱激轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,挑取鑒定正確的克隆進(jìn)行黃原膠裂解酶的誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)菌液于37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600 nm為0.6時(shí)加入IPTG至終濃度為0.5 μmol/L,再于16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。利用超聲破碎儀對(duì)誘導(dǎo)菌體進(jìn)行破碎,破碎上清液為粗酶液。

由于重組質(zhì)粒pGEX-xly誘導(dǎo)表達(dá)黃原膠裂解酶的N端融合有GST標(biāo)簽,本實(shí)驗(yàn)利用Glutathione Sepharose 4B填料對(duì)該融合酶進(jìn)行親和純化。具體步驟如下:取5 mL填料置于50 mL離心管中,500×g,5 min,小心移出上清液;將25 mL Binding Buffer(NaCl 140 mmol/L,KCl 2.7 mmol/L,KH2PO41.8 mmol/L,Na2HPO410 mmol/L,pH7.3)加入上述離心管中,輕輕混勻,500×g,5 min,小心移出上清液;將含有約25 mg總蛋白質(zhì)的酶液加入填料中,輕輕混勻,室溫結(jié)合2 h,500×g離心5 min,小心移出上清液;隨后,再加入25 mL Binding Buffer,輕輕混勻,500×g離心5 min,小心移出上清液,并重復(fù)該步驟直到填料上的非結(jié)合蛋白基本被清洗了下來;最后加入2.5 mL Elution Buffer(Tris 50 mmol/L,還原性谷胱甘肽10 mmol/L,pH8.0)洗脫目的蛋白,室溫放置5～10 min,500×g,5 min,小心移出含有目的蛋白的酶液。

所有蛋白質(zhì)樣品均采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析,蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用Bradford法[17]。

1.3.3 黃原膠裂解酶酶活測(cè)定 反應(yīng)體系中含有0.1 mg/mL的黃原膠溶液(溶于100 mmol/L PBS,pH6.0)和適當(dāng)稀釋的酶液(對(duì)照組為沸水滅活酶液)。酶反應(yīng)于40 ℃進(jìn)行30 min,沸水浴10 min終止反應(yīng),測(cè)定A235 nm的吸光值。一個(gè)黃原膠裂解酶酶活力單位定義為在上述反應(yīng)條件下,每分鐘235 nm處吸光值增加1.0所需要的酶量[16]。

1.3.4 酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定 純化后的裂解酶液的最適溫度測(cè)定實(shí)驗(yàn)是分別在30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃溫度下進(jìn)行酶反應(yīng),測(cè)定A235 nm的吸光值。以測(cè)定最高的酶活力為100%,計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力;將純化后的裂解酶液分別在25、30、35、40、45、50、60、70 ℃溫度下溫育1 h后測(cè)定殘余酶活力,測(cè)定最高的酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力,繪制酶溫度穩(wěn)定性曲線。

1.3.5 酶的最適pH及pH穩(wěn)定性測(cè)定 酶的最適pH是將純化后的裂解酶液分別用緩沖液調(diào)節(jié)pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0,再于40 ℃與黃原膠底物反應(yīng)30 min,沸水浴10 min終止反應(yīng),測(cè)定A235 nm的吸光值。以測(cè)定最高的酶活力為100%,計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力;酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定實(shí)驗(yàn)是將純化后的裂解酶液分別在不同的pH緩沖液中溫育2 h,而后在pH6.0、40 ℃條件下反應(yīng)30 min,以測(cè)定最高的酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力。其中,pH4.5～6.0采用0.1 mmol/L的乙酸鈉緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié);pH6.0～8.0采用0.1 mmol/L的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié);pH8.0～12.0采用0.05 mmol/L的甘氨酸-NaOH緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié)。

1.3.6 金屬離子對(duì)酶活力影響的測(cè)定 在純化后的黃原膠裂解酶反應(yīng)體系中分別加入的不同金屬離子,包括K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Li+,至終濃度為10 mmol/L,隨后在pH6.0、40 ℃條件下進(jìn)行酶反應(yīng),以未加入金屬離子的酶液活力為對(duì)照(記為100%)計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.7 黃原膠的純化及不同化學(xué)修飾 首先,將黃原膠粉末溶解于超純水中至終濃度為1 g/L,隨后加入等體積的冰冷無水乙醇以及終濃度100 g/L的NaCl,于4 ℃攪拌2 h,過濾收集黃原膠沉淀并用95%乙醇清洗,最后干燥至恒重;5 g/L的純化黃原膠溶液加入三氟乙酸至終濃度為5 mmol/L,隨后溶液于100 ℃加熱1.5 h以去除黃原膠側(cè)鏈的丙酮酸基團(tuán);將黃原膠溶解于0.1 mol/L的NH4OH至終濃度為2.5 g/L,于60 ℃加熱1.0 h以去除黃原膠側(cè)鏈的乙?；鶊F(tuán)[3,18-19]。不同黃原膠樣品中乙?；捅峄鶊F(tuán)的含量按照文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行測(cè)定[20-21]。以純化黃原膠為底物測(cè)定的純酶活力為對(duì)照(記為100%),計(jì)算以不同化學(xué)修飾黃原膠為底物的相對(duì)酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)中所有實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)平行樣,3個(gè)平行數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及圖表采用OriginLab OriginV 7.5(Northampton,MA,USA)軟件進(jìn)行計(jì)算繪制,數(shù)據(jù)的顯著性差異則利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃原膠裂解酶編碼基因xly的擴(kuò)增及序列分析

以黃原膠降解菌Microbacteriumsp. XT 11的基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增黃原膠裂解酶編碼基因,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。在3.5 kbp附近擴(kuò)增出一條特異性條帶,大小與黃原膠裂解酶目的基因片段一致。將回收的PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序,測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)證明為黃原膠裂解酶的編碼基因,大小為3546 bp,該基因編碼的黃原膠裂解酶含有1182個(gè)氨基酸殘基,理論分子量為122027 u。其N端含有一條35 aa的分泌信號(hào)肽,其C端含有一段大小為392 aa的碳水化合物結(jié)合域CBM(圖4)。

圖3 PCR擴(kuò)增黃原膠裂解酶編碼基因的1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證Fig.3 Agarose gel(1%)electrophoresis results of the xanthan lyase coding gene fragment注:泳道1為裂解酶目的條帶;泳道M為DNA Marker。

圖4 來源于不同物種的黃原膠裂解酶氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence alignment of xanthan lyases from different organisms注:白色區(qū)域代表高同源性序列區(qū);灰色箭頭注釋區(qū)域?yàn)榉置谛盘?hào)肽;波浪線注釋區(qū)域?yàn)镃BM。

黃原膠裂解酶氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明,XT11的裂解酶與來源于Bacillusgobiensis、Microbacteriumtestaceum、Paenibacillusalginolyticus、Paenibacillussp. 1ZS3-15的黃原膠裂解酶的同源性分別為:47.3%、63.7%、45.5%(P.alginolyticusXalA)、49.3%(P.alginolyticusXalB)和41.7%。其中,來自同一屬的M.testaceum與本實(shí)驗(yàn)所研究的XT 11具有較高的裂解酶序列相似性。

2.2 黃原膠裂解酶表達(dá)載體及菌株構(gòu)建

日本學(xué)者相繼從芽孢桿菌Bacillussp. Strain GL1和類芽孢桿菌PaenibacillusalginolyticusXL-1中純化出兩種黃原膠裂解酶,其分子量分別為75 ku和85 ku,酶反應(yīng)最適溫度分別為50 ℃和55 ℃,最適pH分別為5.5和6.0[15-16]。由于直接從黃原膠降解菌中純化黃原膠裂解酶的過程過于繁瑣且純化效率較低,使得目前該酶的酶學(xué)性質(zhì)相關(guān)表征工作進(jìn)展緩慢。Ruijssenaars等[23]對(duì)P.alginolyticusXL-1的黃原膠裂解酶基因進(jìn)行了克隆,并利用大腸桿菌pET系統(tǒng)進(jìn)行了異源表達(dá),但由于大部分目的蛋白質(zhì)以包涵體形式存在,表達(dá)結(jié)果并不十分理想。因此,本實(shí)驗(yàn)致力于利用大腸桿菌表達(dá)體系來高水平異源表達(dá)黃原膠裂解酶,并通過親和純化技術(shù)實(shí)現(xiàn)純酶的高效回收。已有工作指出,去除黃原膠裂解酶C端的CBM區(qū)域?qū)τ谠撁傅拿富盍Σo顯著影響[14]。因此,本實(shí)驗(yàn)將黃原膠裂解酶全長(zhǎng)基因中編碼CBM的序列去掉,同時(shí)去除N端的分泌信號(hào)肽,剩下的截短基因片段(2133 bp)用于大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建。

將BamHI和EcoRI雙酶切的黃原膠裂解酶截短DNA片段及表達(dá)載體pGEX-2T于16 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑取氨芐青霉素抗性平板上的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取。對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切驗(yàn)證。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明(圖5),重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后顯示有大小為2.2 kbp和4.8 kbp的兩條特異性條帶,與預(yù)測(cè)正確重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果基本一致。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工測(cè)序,結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了黃原膠裂解酶表達(dá)載體pGEX-xly。

圖5 重組質(zhì)粒pGEX-xly的BamHI和EcoRI雙酶切驗(yàn)證電泳圖Fig.5 The electrophoresis results of the recombinant plasmidpGEX-xly digested by BamHI and EcoRI注:泳道1為酶切條帶;泳道M為DNA Marker。

將表達(dá)載體pGEX-xly轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,復(fù)蘇1 h后,將菌液涂布在氨芐青霉素抗性平板,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,挑取陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖6所示,直接以陽性菌落為模板擴(kuò)增獲得大小在2.2 kbp附近的特異性條帶,這與黃原膠裂解酶截短基因片段理論大小基本一致,證明黃原膠裂解酶表達(dá)菌BL21-pGEX-xly構(gòu)建成功。

圖6 黃原膠裂解酶表達(dá)菌BL21-pGEX-xly的PCR鑒定Fig.6 PCR identification of xanthan lyaseexpressing strain BL21-pGEX-xly注:泳道1為陰性對(duì)照菌株;泳道2為BL21-pGEX-xly;泳道M為DNA Marker。

2.3 黃原膠裂解酶的異源表達(dá)及純化

在前期工作中,嘗試?yán)么竽c桿菌pET表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行黃原膠裂解酶的表達(dá),其N端融合有His純化標(biāo)簽。遺憾的是,利用該系統(tǒng)表達(dá)出的裂解酶絕大部分以包涵體的形式存在,說明該酶在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)蛋白質(zhì)正確折疊的效率較低。有文獻(xiàn)報(bào)道,谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶親和純化標(biāo)簽(GST)能夠有效地幫助融合的蛋白質(zhì)正確折疊[22]。因此,為了提高蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)水平,本實(shí)驗(yàn)利用載體pGEX-xly的構(gòu)建在黃原膠裂解酶的N端融合了GST純化標(biāo)簽,表達(dá)的融合蛋白命名為XLY-GST。

將黃原膠裂解酶表達(dá)菌BL21-pGEX-xly加入終濃度為0.5 μmol/L的IPTG于16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。離心收集誘導(dǎo)菌體之后進(jìn)行細(xì)胞破碎,獲得含有黃原膠裂解酶的粗酶液。利用Glutathione Sepharose 4B親和填料對(duì)XLY-GST進(jìn)行純化。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明(圖7),XLY-GST在大腸桿菌中能夠高水平的可溶性表達(dá)。經(jīng)過結(jié)合、洗滌、洗脫等一系列純化步驟所獲得的XLY-GST條帶較為單一,雜蛋白被有效的去除。其中,目的蛋白XLY-GST分子質(zhì)量約為104 ku(其中,GST大小為26 ku)。經(jīng)Bradford法檢測(cè)純化的XLY-GST質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL,比酶活為 2.5 U/mg,目的蛋白質(zhì)的回收率為11.8%,純度大于90%。此外,未添加IPTG誘導(dǎo)劑的陰性對(duì)照細(xì)胞破碎上清液未見目的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶,且未檢測(cè)到黃原膠裂解酶酶活力(圖中未顯示),進(jìn)一步證明圖7中誘導(dǎo)表達(dá)的大小約為104 ku的蛋白質(zhì)為黃原膠裂解酶。

圖7 黃原膠裂解酶親和純化過程的SDS-PAGE電泳Fig.7 SDS-PAGE analysis of affinity purification steps of xanthan lyase注:泳道1為粗酶液;2為穿出液;3為清洗液;4為洗脫液;M為蛋白質(zhì)Marker。

2.4 黃原膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

如圖8(A)所示,黃原膠裂解酶在反應(yīng)溫度為40～70 ℃時(shí)具有較高的相對(duì)酶活力,當(dāng)酶反應(yīng)溫度降到35 ℃時(shí),酶活力急劇下降,該酶的最適酶反應(yīng)溫度為40～45 ℃。對(duì)酶熱穩(wěn)定性考察結(jié)果圖8(B)可以看出,該裂解酶在溫育溫度低于35 ℃時(shí),能夠保持穩(wěn)定的酶活力,隨著溫度的升高,酶的穩(wěn)定性下降。

圖8 黃原膠裂解酶最適溫度(A)及熱穩(wěn)定性(B)Fig.8 The temperature optimum(A) and thermostability(B)of xanthan lyase注:*代表該實(shí)驗(yàn)組酶活力與酶活力最高組相比有顯著性差異(p≤0.05)。

隨后,對(duì)黃原膠裂解酶的最適pH進(jìn)行了考察。結(jié)果如圖9(A)所示,黃原膠裂解酶在pH為6.0時(shí)表現(xiàn)出最大酶活力,但是隨著酶反應(yīng)pH的增大或減少,該酶的酶活力急劇下降。如圖9(B)所示,當(dāng)酶液在pH為5.5～10.5的緩沖液中溫育2 h后,均能夠保持穩(wěn)定的酶活力,該結(jié)果說明黃原膠裂解酶對(duì)堿性環(huán)境具有一定的耐受能力。

圖9 黃原膠裂解酶最適pH(A)及pH穩(wěn)定性(B)Fig.9 The pH optimum(A)and pH stability(B)of xanthan lyase

隨后,考察了不同金屬離子的存在對(duì)黃原膠裂解酶活力的影響。如圖10所示,當(dāng)溶液中含有Ca2+和Mn2+時(shí),黃原膠裂解酶的酶活力有較大幅度提高,分別增加了8.8倍和9.7倍,溶液中Cu2+則對(duì)黃原膠裂解酶有一定的抑制作用。而其他金屬離子的加入,均對(duì)酶活力沒有較大的影響。

圖10 不同金屬離子對(duì)黃原膠裂解酶活力的影響Fig.10 Influence of metal ions on xanthan lyase activity注:*代表實(shí)驗(yàn)組酶活力與對(duì)照組酶活力相比有顯著性差異(p≤0.05)。

為了考察黃原膠側(cè)鏈中的乙酰基及丙酮酸基修飾對(duì)裂解酶活力的影響,對(duì)黃原膠底物進(jìn)行了去乙?；腿ケ峄鶊F(tuán)的處理。從表1中可知,未處理的黃原膠乙?；捅峄暮糠謩e為29%和52.9%,去乙?；磻?yīng)可以有效地完全去除黃原膠側(cè)鏈的乙?；鶊F(tuán),而去丙酮酸基實(shí)驗(yàn)只能部分去除黃原膠側(cè)鏈的丙酮酸基團(tuán)。不同側(cè)鏈化學(xué)修飾的黃原膠與黃原膠裂解酶反應(yīng)結(jié)果表明,黃原膠側(cè)鏈的乙?；鶊F(tuán)和丙酮酸基團(tuán)分別被去除時(shí)均能導(dǎo)致黃原膠裂解酶活力下降,分別為對(duì)照酶活力的68%和60%。當(dāng)兩種化學(xué)基團(tuán)同時(shí)被去除時(shí),黃原膠裂解酶活力有較大程度下降,為對(duì)照酶活力的44%。該結(jié)果說明黃原膠側(cè)鏈的化學(xué)修飾程度對(duì)黃原膠裂解酶的活性有明顯的影響。

表1 不同黃原膠底物對(duì)黃原膠裂解酶活力的影響Table 1 Influence of the various xanthan on activities of xanthan lyase

3 結(jié)論

以一株性能優(yōu)良的黃原膠降解菌Microbacteriumsp. XT11為出發(fā)菌株[11],從中克隆出3546 bp黃原膠裂解酶編碼基因。將去掉分泌信號(hào)肽及CBM的截短裂解酶的N端融合GST親和純化標(biāo)簽,在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá),發(fā)現(xiàn)其可溶性表達(dá)水平較之前文獻(xiàn)報(bào)道有顯著提高,純化回收率達(dá)11.8%。純化的黃原膠裂解酶-GST融合蛋白表現(xiàn)出與天然黃原膠裂解酶一致的酶學(xué)性質(zhì)[13],其最適作用溫度為40～45 ℃,最適pH為6.0,對(duì)高溫的耐受力較低,對(duì)堿性環(huán)境具有一定的耐受力。Ca2+和Mn2+對(duì)該裂解酶有顯著地激活作用,而Cu2+則對(duì)該酶有一定的抑制作用。黃原膠側(cè)鏈的化學(xué)修飾對(duì)裂解酶的活力也有較大影響,當(dāng)側(cè)鏈乙酰基及丙酮酸基團(tuán)被去除,裂解酶酶活有顯著降低。

本實(shí)驗(yàn)所取得的研究結(jié)果為今后黃原膠裂解酶進(jìn)一步性質(zhì)表征、酶液大量制備及黃原膠側(cè)鏈修飾研究奠定了基礎(chǔ)。

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Heterologous expression and characterization of a novel xanthan lyase

DU Yuan-yuan,GUO Xiao-yu,LI He,WANG Ya-fang,YANG Fan*,LI Xian-zhen

(School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic Unversity,Dalian 116034,China)

Xanthan lyase is a kind of xanthan-modifying enzymes which are powerful tools for xanthan modification and xantho-oligosaccharide preparation. In this paper,a novel xanthan lyase-encoding genexlywas cloned and sequenced for the first time,from an excellent xanthan-degrading strainMicrobacteriumsp. XT11. Thexlygene encoded a 122027 u protein,including a 35-amino acid signal peptide at N terminus and a 392-amino acid carbohydrate binding module(CBM)at C terminus. A mature enzyme without signal peptide and CBM was fused with a GST tag and the resulted XLY-GST could be expressed inEscherichiacoliBL21(DE3)in a high level. The purified XLY-GST showed similar features with that of the wild type xanthan lyase. It was optimally active at pH6.0 and 40 ℃ and alkali-tolerant at a high pH value of 10.5. The metal ions including Ca2+and Mn2+strongly stimulated xanthan lyase activity but ion Cu2+was its inhibitor. XLY-GST was specific on the pyruvated and mannosyl residue in the intact xanthan molecule. Our work should be valuable for preparing the xanthan lyase and studying the modification of xanthan side chain.

xanthan lyase;xanthan modification;enzyme characterization

2016-07-18

杜元元(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：分子微生物學(xué)，E-mail:13795153774@163.com。

*通訊作者:楊帆(1982-)，女，博士，副教授，研究方向：多糖生物降解分子機(jī)理，E-mail：yang_fan@dlpu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371742,31601458)；遼寧省高等學(xué)校杰出青年學(xué)者成長(zhǎng)計(jì)劃(LJQ2015009)；大連市科技計(jì)劃(2013B11NC078)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)02-0175-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.025