李小雯 鄭松柏 張曉莉 劉 菲

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化科(200040)

比格犬胃底黏膜相關(guān)生物活性因子的增齡變化*

李小雯 鄭松柏#張曉莉 劉 菲

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化科(200040)

背景：近年研究證實(shí)胃黏膜隨增齡更易受侵襲因素的損害，既往胃黏膜老化研究多以胃竇黏膜為主，鮮有提及胃底黏膜。目的：研究比格犬胃底黏膜相關(guān)生物活性因子的增齡變化。方法：將19只健康比格犬分為中青年組(1～5歲)、低齡老年組(6～8歲)和高齡老年組(≥9歲)，以TBA法測(cè)定胃底黏膜組織中MDA、LPO、MPO含量，ELISA法測(cè)定胃底黏膜組織中PTEN、TE、survivin、caspase-3、caspase-9、ZO-1、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量。結(jié)果：與中青年組和低齡老年組相比，高齡老年組胃底黏膜MDA、LPO、MPO、PTEN、TE、ZO-1、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量顯著升高(P<0.05)，caspase-3和caspase-9含量無(wú)明顯差異(P>0.05)。低齡老年組和高齡老年組胃底黏膜中survivin含量顯著低于中青年組(P=0.000)。結(jié)論：老年比格犬胃底黏膜相關(guān)生物活性因子含量存在不同程度的不利變化，但高齡老年組與調(diào)節(jié)黏膜下血流、黏膜再生和上皮間緊密連接等相關(guān)的生物活性因子反而升高，可能是一種“退化-代償”現(xiàn)象。

胃底； 衰老； 降鈣素基因相關(guān)肽； 環(huán)氧合酶1； 環(huán)氧合酶2

臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，胃黏膜結(jié)構(gòu)和功能隨增齡出現(xiàn)異常，黏膜下血流(GMBF)減少、缺氧以及調(diào)節(jié)黏膜上皮凋亡的生物活性因子發(fā)生不利改變，導(dǎo)致胃黏膜更易受侵襲性因素的損害[1]。既往胃黏膜老化研究多以胃竇黏膜為研究對(duì)象，鮮有涉及胃底黏膜。此外，人在衰老過(guò)程中不可避免地受乙醇、藥物，尤其是幽門(mén)螺桿菌(Hp)感染等環(huán)境因素的影響。本研究以無(wú)Hp感染的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比格犬為研究對(duì)象，通過(guò)研究胃底黏膜相關(guān)生物活性因子的增齡改變，旨在探討胃底黏膜防御-修復(fù)機(jī)制隨增齡的變化。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

19只國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用比格犬于2003年起陸續(xù)飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，犬齡1.33～10.58歲，每個(gè)月血常規(guī)、血生化、心電圖、腦電圖等檢查均在正常范圍內(nèi)。根據(jù)網(wǎng)站http://www.maxiebeagle.com/dogage.htm，將比格犬年齡換算成人類年齡，并分為中青年組(1～5歲，n=8)、低齡老年組(6～8歲，n=5)和高齡老年組(≥9歲，n=6)。

二、研究方法

1. 獲取標(biāo)本：取標(biāo)本前1天晚上8：00后禁食、禁水，次日上午9：00開(kāi)始靜脈麻醉，剖腹，游離胃，沿胃大彎切開(kāi)胃腔，距賁門(mén)6～8 cm處取胃底組織2塊(深達(dá)黏膜下層)，大小約1.0 cm×0.2 cm×0.2 cm，置于液氮-80 ℃保存。

2. TBA法：準(zhǔn)確稱取組織重量，制備勻漿，離心，取上清液200 μL，根據(jù)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)，測(cè)定丙二醛(MDA)、脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)含量。

3. ELISA法：準(zhǔn)確稱取組織重量，制備勻漿，離心，取上清液40 μL，參照ELISA測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)，測(cè)定比格犬胃底黏膜組織中磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、端粒酶(TE)、生存素(survivin)、caspase-3、caspase-9、緊密連接蛋白ZO-1、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、環(huán)氧合酶(COX)-1和COX-2含量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、胃底黏膜MDA、LPO、MPO含量

三組MDA、LPO、MPO含量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.090，P=0.006；F=3.689，P=0.048；F=6.114，P=0.011)；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，高齡老年組MDA、LPO、MPO含量顯著高于中青年組和低齡老年組(P<0.05)(表1)。

二、胃底黏膜PTEN、TE、survivin、caspase-3、caspase-9、ZO-1含量

三組PTEN、TE、survivin、ZO-1含量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.777，P=0.024；F=5.147，P=0.019；F=15.437，P=0.000；F=5.365，P=0.016)；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，高齡老年組PTEN、TE、ZO-1含量顯著高于低齡老年組(P<0.05)，但與中青年組相比無(wú)明顯差異，低齡老年組和高齡老年組survivin含量顯著低于中青年組(P<0.05)。而三組caspase-3、caspase-9含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.065，P=0.750；F=1.123，P=0.349)(表2)。

三、胃底黏膜CGRP、VEGF、COX-1、COX-2含量

三組CGRP、VEGF、COX-1、COX-2含量相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.418，P=0.016；F=5.364，P=0.016；F=7.336，P=0.005；F=5.158，P=0.019)；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，高齡老年組CGRP和COX-1含量顯著高于中青年組和低齡老年組(P<0.05)，高齡老年組VEGF和COX-2顯著高于低齡老年組(P<0.05)，與中青年組無(wú)明顯差異(表1)。

討 論

胃底黏膜的第一層屏障是黏液-碳酸氫鹽-磷脂屏障，磷脂雙分子層的脂肪酸鏈面向胃腔，形成一道疏水性屏障，保護(hù)胃黏膜上皮細(xì)胞免受胃酸和胃蛋白酶等的損傷。MDA、LPO、MPO是與胃黏膜氧化應(yīng)激損傷和磷脂雙分子層脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)的生物化學(xué)因子。本研究發(fā)現(xiàn)高齡老年組胃底黏膜MDA、LPO、MPO含量明顯高于低齡老年組和中青年組(P<0.05)，提示增齡可能增加胃黏膜脂質(zhì)過(guò)氧化，這可能與胃黏膜磷脂的疏水性隨增齡降低有關(guān)[2]。

胃底黏膜的第二層屏障是胃黏膜上皮與上皮細(xì)胞間的緊密連接。PTEN具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、遷移、分化等多種效應(yīng)[3-5]；TE可延長(zhǎng)染色體上的端粒，從而增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，與衰老關(guān)系密切[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，高齡老年組PTEN和TE顯著高于中青年組和低齡老年組(P<0.05)；低齡老年組和高齡老年組抗凋亡蛋白survivin含量顯著低于中青年組(P<0.05)。凋亡相關(guān)因子caspase-3和caspase-9分別參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行和起始，可間接反映細(xì)胞凋亡狀況。本研究發(fā)現(xiàn)兩者含量在三組中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。緊密連接是維持黏膜上皮機(jī)械屏障和通透性的重要結(jié)構(gòu)，ZO-1是重要的組成蛋白之一。有研究表明老年大鼠上皮組織中ZO-1含量明顯低于幼年大鼠，從而導(dǎo)致上皮屏障功能下降[7-8]。本研究顯示高齡老年組胃底黏膜ZO-1含量顯著高于中青年組和低齡老年組(P<0.05)。

表1 各組胃底黏膜MDA、LPO、MPO、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量

表2 各組胃底黏膜PTEN、TE、survivin、caspase-3、caspase-9、ZO-1含量

胃黏膜的第三層屏障是GMBF，其減少是胃黏膜損傷發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，臨床研究發(fā)現(xiàn)單純GMBF降低即可引起胃潰瘍的發(fā)生，而增加GMBF可促進(jìn)潰瘍愈合[9]。李雅君等[10]報(bào)道老年人賁門(mén)、胃體、胃角血流均顯著低于中青年人。機(jī)體內(nèi)多種生物活性因子參與調(diào)控GMBF。VEGF與黏膜細(xì)胞增殖、再生和GMBF密切相關(guān)[11-12]；CGRP是重要的血管擴(kuò)張神經(jīng)肽，多項(xiàng)研究顯示老年大鼠胃黏膜防御功能降低與黏膜下血管周圍神經(jīng)纖維分泌的CGRP減少有關(guān)[13-14]；環(huán)氧合酶是花生四烯酸合成前列腺素(PGs)的限速酶，PGs可增加GMBF并通過(guò)增加VEGF表達(dá)起黏膜保護(hù)的作用[15]。本研究顯示，低齡老年組胃底黏膜CGRP、VEGF、COX-1和COX-2含量顯著低于中青年組，而高齡老年組顯著高于中青年組和低齡老年組。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞增殖、上皮間緊密連接、黏膜修復(fù)和GMBF相關(guān)的PTEN、TE、ZO-1、CGRP、VEGF、COX-1和COX-2在低齡老年組明顯降低，而高齡老年組明顯升高。這種現(xiàn)象未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們暫且稱之為老化過(guò)程中的“退化-代償(degeneration-compensation)”現(xiàn)象，這種現(xiàn)象有利于老化過(guò)程中胃底黏膜內(nèi)重要功能腺體-胃底腺形態(tài)和功能的保護(hù)，再次驗(yàn)證了本課題組的相關(guān)研究[16-18]結(jié)果；這種現(xiàn)象有利于維持老年人胃底黏膜的完整性，可能是胃底糜爛、潰瘍等病變較胃竇少見(jiàn)的原因之一。但發(fā)生這種“退化-代償”現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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(2016-07-11收稿；2016-09-05修回)

Effect of Aging on Related Biological Activity Factors in Gastric Fundic Mucosa in Beagle Dogs

LIXiaowen,ZHENGSongbai,ZHANGXiaoli,LIUFei.

DepartmentofGastroenterology,HuadongHospital,FudanUniversity,Shanghai(200040)

ZHENG Songbai, Email: songbai1009@163.com

Gastric Fundus; Aging; Calcitonin Gene-Related Peptide; Cyclooxygenase 1; Cyclooxygenase 2

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.02.010

上海市科委科研計(jì)劃項(xiàng)目(12ZR1409600)

#本文通信作者，Email: songbai1009@163.com

Background: Recent studies showed that gastric mucosa was more susceptible to injury by invasion factors with aging, however, the studies were mainly on gastric antral mucosa,fundic mucosa was rarely studied. Aims: To investigate the effect of aging on related biological activity factors in gastric fundic mucosa in beagle dogs. Methods: Nineteen beagle dogs were assigned into younger group (aged 1-5 years), junior elderly group (aged 6-8 years) and senior elderly group (aged≥9 years). The contents of MDA, LPO, MPO in gastric fundic mucosa were determined by TBA method. The contents of PTEN, TE, survivin, caspase-3, caspase-9, ZO-1, CGRP, VEGF, COX-1 and COX-2 were assessed by ELISA. Results: Compared with younger group and junior elderly group, contents of MDA, LPO, MPO, PTEN, TE, ZO-1, CGRP, VEGF, COX-1 and COX-2 were significantly increased in senior elderly group (P<0.05), no significant differences in contents of caspase-3 and caspase-9 were found among the three groups (P>0.05). The content of survivin in junior elderly group and senior elderly group was significantly decreased when compared with younger group (P=0.000). Conclusions: Disadvantaging changes of biological activity factors are found in gastric fundic mucosa in elderly beagles dogs, however, gastric mucosal blood flow, mucosa regeneration and epithelial tight junction related biological activity factors are significantly increased in senior elderly beagle dogs, which may be a phenomenon of degeneration-compensation.