李新福　王周平　李聰　方伶俐　趙穎　徐寶才

摘 要：針對(duì)低溫肉制品中較易污染的沙門氏菌（Salmonella spp.）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等有害微生物，利用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（multiplex polymerase chain reaction，m-PCR）的方法，對(duì)3種菌同時(shí)快速檢測(cè)，從而達(dá)到節(jié)省時(shí)間，提高效率的目的。使用沙門氏菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的PrfA基因和單增李斯特菌nuc基因設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，在確定特異性引物的基礎(chǔ)上，將3種菌進(jìn)行培養(yǎng)增菌后接種于低溫肉制品中，過夜富集后收集并進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。結(jié)果表明：多重PCR方法在同時(shí)檢測(cè)這3 種有害微生物時(shí)，m-PCR最佳反應(yīng)條件如下：25 μL反應(yīng)體系、10×PCR緩沖液2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、2.5 U/μL的DNA聚合酶0.5 μL及上、下游引物各0.5 μL、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的模板1.0 μL、沙門氏菌的模板2.0 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL，最佳退火溫度為64 ℃。多重PCR快速檢測(cè)方法適用于低溫肉制品中沙門氏菌等3種食源性致病菌的檢測(cè)，具有快速、靈敏、特異、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：低溫肉制品；多重PCR；快速檢測(cè)；食源性致病菌

食源性致病是食品安全性問題重要的關(guān)注點(diǎn)，也是食品安全研究的一個(gè)重要方向。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界因食品污染而致病的人數(shù)已達(dá)數(shù)億人，其中由生物性污染造成的人數(shù)占首位[1]，問題較為嚴(yán)重。對(duì)2001—2010年中國(guó)食源性疾病暴發(fā)監(jiān)測(cè)與報(bào)告系統(tǒng)中資料顯示，總計(jì)暴發(fā)5 021起，發(fā)病數(shù)為140 101人，致死數(shù)為1 427人，死亡率1.019%。查明致病因素的事件共4 243 起，占總數(shù)的84.51%；微生物性暴發(fā)事件數(shù)和發(fā)病人數(shù)最多，分別占總數(shù)的40.93%和56.39%[2]。我國(guó)是肉制品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，由于肉制品中水分含量高、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，易受各種微生物的污染，滋生多種腐敗菌和致病菌[3]。目前，對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)多采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，因其步驟冗繁，耗時(shí)費(fèi)力[4]，已不適應(yīng)當(dāng)前公共事件對(duì)檢測(cè)方法實(shí)效性、準(zhǔn)確性的發(fā)展需要。

生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)作為食品微生物學(xué)的檢測(cè)方法，近幾年得到了迅速的發(fā)展[5]。在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的多重PCR（multiplex polymerase chain reaction，m-PCR）技術(shù)，是指在同一PCR反應(yīng)體系中加入2 對(duì)或2 對(duì)以上的特異性引物，一次可擴(kuò)增2 個(gè)或2 個(gè)以上的核苷酸片段，快速檢測(cè)或鑒定2 種或2 種以上微生物的技術(shù)[6-7]，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足，提高了檢測(cè)效率及準(zhǔn)確性，快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，是食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)的主要發(fā)展趨勢(shì)[8]。目前，m-PCR方法的建立主要集中于沙門氏菌（Salmonella spp.）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀菌（Shigella spp.）、大腸桿菌（E. coli）、單增李斯特菌（L. monocytogenes）等幾種致病菌[9-13]，但在低溫肉制品中的沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的m-PCR檢測(cè)的相關(guān)研究和報(bào)道還較少。

本研究旨在建立一種低溫肉制品中快速檢測(cè)沙門氏菌等3種食源性致病菌的多重PCR方法，以期推廣應(yīng)用并有效減少致病菌的潛在危害。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)菌株：CICC21482腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；ATCC6538金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所；單增李斯特菌（Listeria monocytogenes） 上海慧耘生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)菌株均用甘油管-80 ℃保藏。

培養(yǎng)基與試劑：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB培養(yǎng)基）、腦心浸液培養(yǎng)基（BHI培養(yǎng)基）、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基（TSA-YE培養(yǎng)基） 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；實(shí)驗(yàn)所用引物序列的合成和測(cè)序均由金斯瑞生物科技有限公司完成；離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP320）、TaqDNA聚合酶、DNA Marker 北京

天根生化科技有限公司；dNTP混合物、10×PCR緩沖液、6×上樣緩沖液、50×TAE（Tris base- acetic acid- EDTA）緩沖液、瓊脂糖 上海碧云天生物技術(shù)有限

公司；GelRed染色劑 美國(guó)Biotium公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti 96-well型PCR儀 美國(guó)ABI公司；GelDoc-IT 310型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；3K15型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；BSC-1500IIA2-X型生物安全柜 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；Milli-QDirect8型超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；Revoc 379L型超低溫冰箱 美國(guó)Thermo公司；Microone PMC-880型小型離心機(jī) 日本Tomy公司；LAB Dancer S25型漩渦振蕩儀 德國(guó)Ika公司；IS-RSDS型臺(tái)式全溫恒溫振蕩器 美國(guó)Crystal公司；CTHI-100B型恒溫恒

濕箱 美國(guó)Stik公司；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JY-SPFT型電泳槽、JY600型電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；

VS-1300L-U型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)[12-20]中提到的3種菌的特異性靶基因，即沙門氏菌的invA基因、單增李斯特菌的PrfA基因和金黃色葡萄球菌的nuc基因，應(yīng)用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物，并對(duì)產(chǎn)物長(zhǎng)度、Tm值、G-C含量及退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化，最終得到3對(duì)特異性引物（表1）。3 對(duì)引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，擴(kuò)增片段大小依次為284、388、484 bp。

1.3.2 細(xì)菌的培養(yǎng)和DNA模板的制備

將3種標(biāo)準(zhǔn)菌株在TSA-YE培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)復(fù)壯18 h，再轉(zhuǎn)種于BHI培養(yǎng)基中，隨后取100 μL添加至食品樣中，接種于NB培養(yǎng)基中，37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。取菌液1 mL置于1.5 mL離心管中，12000 r/min離心3 min后，棄上清，收集菌體，然后依據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的步驟提取DNA。

1.3.3 單重PCR反應(yīng)體系的建立

單重PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、2.5 U/μL的DNA聚合酶0.5 μL、上、下游引物各0.5 μL、模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃/5 min；94 ℃/45 s；64 ℃/30 s；72 ℃/30 s；共計(jì)35 個(gè)循環(huán)；72 ℃/10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2.5 g/100 g瓊脂糖、100 V電壓進(jìn)行電泳檢測(cè)，割膠回收后的產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序鑒定。

1.3.4 多重PCR的反應(yīng)條件的優(yōu)化

以沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌提取的DNA為模板，與各種反應(yīng)試劑混合在一起進(jìn)行多重PCR反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化，以建立最佳的m-PCR方法。優(yōu)化的條件主要包括引物濃度配比、退火溫度、退火時(shí)間、DNA聚合酶量等。

1.3.5 靈敏度檢測(cè)

沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)增菌后接種于煙熏火腿，過夜培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，將3種已測(cè)濃度的菌液等體積混合并稀釋成9 個(gè)梯度（108～100），稀釋液2 mL提取DNA，單重PCR以各自提取DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)，多重PCR以同梯度等體積的DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

自江蘇雨潤(rùn)肉食品有限公司采集生產(chǎn)50 d左右于4 ℃貯藏的低溫肉制品2 種8 份（表2）。在生物安全柜內(nèi)剪取20 g樣品稀釋于80 mL含0.1 g/100 g的蛋白胨-0.85 g/100 g的生理鹽水中，搖床振蕩30 min，4℃條件下4000 r/min離心10 min，取上清液20 mL于4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，取沉淀置于1.5 mL的離心管，然后依據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的步驟提取DNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR特異性實(shí)驗(yàn)

3種目標(biāo)菌進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物與模板之間的特異性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，泳道1的擴(kuò)增條帶位于200～300 bp之間，與沙門氏菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度的實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符；泳道2的擴(kuò)增條帶位于300～400 bp之間，與單增李斯特菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度的實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符；泳道3的擴(kuò)增條帶位于400～500 bp之間，與金黃色葡萄球菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度的實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符；引物之間無交叉反應(yīng)。將PCR擴(kuò)增后的3個(gè)目的片段測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果顯示，測(cè)序結(jié)果與NCBI中沙門氏菌相應(yīng)基因序列的同源性為99%，與單增李斯特菌相應(yīng)基因序列的同源性為99%，與金黃色葡萄球菌相應(yīng)基因序列的同源性為99%。

2.2 多重PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

不同菌種由于引物、堿基對(duì)等的不同造成了退火溫度的差異，為確定多重PCR反應(yīng)最適退火溫度，自56 ℃起至66 ℃設(shè)置6 個(gè)梯度：56、58、60、62、64、66 ℃，電泳結(jié)果見圖2。在多重PCR擴(kuò)增中，不同的溫度下，單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的條帶，但沙門氏菌的目的條帶亮度較弱且模糊不清，不同的退火溫度下，都沒有呈現(xiàn)出較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，接下來對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.2 引物濃度的優(yōu)化

圖2中沙門氏菌的條帶較為模糊，故對(duì)沙門氏菌的PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，調(diào)整引物用量，將沙門氏菌的上、下游引物增加為1.0 μL或者減少為0.25 μL，單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的引物量及其他均不變，ddH2O補(bǔ)足至25 μL，退火溫度選擇沙門氏菌單獨(dú)PCR擴(kuò)增較好的64 ℃，電泳結(jié)果見圖3。

由圖3可知，增加或減少沙門氏菌的引物量時(shí)，結(jié)果并未得到明顯改善，電泳條帶亮度依然較弱，接下來對(duì)DNA模板做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.3 模板濃度的優(yōu)化

圖3中沙門氏菌的條帶模糊不清，推測(cè)為DNA模板量不足引起，故增加沙門氏菌DNA模板為2.0 μL和3.0 μL，其余試劑和條件的量均不變，ddH2O補(bǔ)足至25 μL，退火溫度選擇為64 ℃。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖4。

由圖4可知，3種菌的目的條帶清晰可見，在DNA模板為2.0 μL時(shí)，多重PCR檢測(cè)肉制品中沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌具有較好的效果，此時(shí)，沙門氏菌的靈敏度稍低于單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌。

2.2.4 多重PCR體系靈敏度

由表3可知，多重PCR靈敏度結(jié)果顯示，單重PCR中3種目的菌的最低檢出限為金黃色葡萄球菌8.20×102 CFU/mL，多重PCR的最低檢測(cè)限為104 CFU/mL顯著低于單重PCR，在多重PCR反應(yīng)體系中，隨著引物、模板種類的增多和量的增加，結(jié)合率反而呈下降趨勢(shì)[14]。

對(duì)比單重和多重PCR的檢出限可知后者靈敏度顯著下降，對(duì)多重PCR反應(yīng)體系的引物濃度、退火溫度、退火時(shí)間、DNA聚合酶量等進(jìn)行優(yōu)化，最適結(jié)果如下：25 μL反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2.5 μL及2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、2.5 U/μLDNA聚合酶0.5 μL、上、下游引物各0.5 μL、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的模板1.0 μL、沙門氏菌的模板2.0 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃/5 min，94 ℃/45 s，64 ℃/30 s，72 ℃/30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃/10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2.5 g/100 g瓊脂糖、100 V電壓進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果出現(xiàn)3 條清晰的條帶，大小分別約為284、388、484 bp。

2.2.5 樣品檢測(cè)

采用優(yōu)化后多重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對(duì)貯藏50 d左右的8份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，8份樣品均未有沙門氏菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的檢出。

3 討 論

分子生物學(xué)方法因其簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在食源性致病菌檢測(cè)中已得到廣泛的應(yīng)用，最常見的即是PCR技術(shù)，常規(guī)PCR一次檢測(cè)一種病原菌，但樣品中往往存在多種致病菌，多重PCR（m-PCR）一次可檢測(cè)2 種或2 種以上致病菌[15]，在實(shí)際推廣應(yīng)用中更加方便有效。

多重PCR并非把普通PCR反應(yīng)體系進(jìn)行簡(jiǎn)單的混合，反應(yīng)體系會(huì)受到諸多因素的影響。影響第一因素就是靶基因的選擇，沙門氏菌選擇侵襲因子invA為靶基因，前人研究[16-17]表明該基因在屬內(nèi)均存在、屬間特異性表達(dá)；單增李斯特菌選擇其重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子PrfA為靶基因，該基因?qū)Χ玖τ兄匾挠绊慬18-19]；金黃色葡萄球菌選取特異性基因耐熱核酸酶nuc基因[20]，此3 種靶基因序列均高度保守，增加擴(kuò)增結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。影響的第二因素是引物設(shè)計(jì)，前人研究[21]表明稍長(zhǎng)的引物和稍高的解鏈溫度，均可增加m-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，本研究退火溫度優(yōu)化為較高的64℃與此實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。除此外多重PCR反應(yīng)體系還受到其他多種因素的影響，例如dNTP、Mg2+、Taq酶以及引物間和模板間的相互影響等[22]。鑒于此，優(yōu)化最適反應(yīng)體系，具體如下：總體積為25 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL、2.5 mmol/L d NTPs 2.0 μL、2.5 U/μLDNA聚合酶0.5 μL、上、下游引物各0.5 μL、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的模板1.0 μL、沙門氏菌的模板2.0 μL。退火溫度、模板濃度等條件優(yōu)化有利于m-PCR檢測(cè)目標(biāo)菌株，以便得到更加明確、清晰的條帶和更為精確的檢測(cè)限。m-PCR方法具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，舒暢等[23]利用m-PCR檢測(cè)3 種致病菌的靈敏度為104 CFU/mL，王虎虎等[13]研究三重PCR同時(shí)檢出的雞肉中3 種致病菌最低檢測(cè)限為103 CFU/mL。本研究m-PCR檢測(cè)的最低限為104 CFU/mL相對(duì)偏低，推測(cè)為兩方面原因，一與基因組DNA純度和濃度有關(guān)，Stefanova等[24]比較十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）法和3 種試劑盒法提取DNA，發(fā)現(xiàn)試劑盒方法提取的DNA濃度和純度均偏低，從而導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度略低；二與煙熏火腿中成分介質(zhì)過多有關(guān)，某些成分可抑制PCR反應(yīng)，Wilson[25]研究表明肉制品中的脂肪可導(dǎo)致PCR靈敏度降低。本實(shí)驗(yàn)下一步將采取CTAB等方法提取基因組DNA并對(duì)比優(yōu)化以提高檢測(cè)靈敏度；檢測(cè)脂肪、鹽、蛋白和配料等肉制品中介質(zhì)對(duì)PCR靈敏度的影響。但由于多數(shù)致病菌的感染劑量均大于103 CFU/mL[26]，故本結(jié)果對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)具有重要的參考意義。多重PCR中目的片段在擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)相互拮抗導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度低于單重PCR，利用優(yōu)化后的m-PCR體系對(duì)貯藏50 d左右的8 份樣品進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，均未檢測(cè)出陽性結(jié)果，與實(shí)際情況相符。

本研究通過優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件，建立了低溫肉制品中3種食源性致病菌多重PCR快速檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果有較強(qiáng)的特異性、較高的靈敏度、操作省時(shí)省力、成本低，符合當(dāng)前食品快速檢測(cè)的需要，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值，在當(dāng)前的食品安全檢測(cè)工作中具有較強(qiáng)的推廣和應(yīng)用前景。

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