宋照風(fēng)

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院化學(xué)與化工系，廣東佛山528000）

楊桃多糖提取工藝及其應(yīng)用研究

宋照風(fēng)

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院化學(xué)與化工系，廣東佛山528000）

利用酸性熱水浸提法提取楊桃多糖，通過研究影響楊桃多糖提取率的4個(gè)因素：料液比、溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行單因素的研究。采用正交試驗(yàn)定了楊桃多糖最佳的提取工藝是：料液比為1∶4（體積比），浸提時(shí)間是3 h，提取溫度是80℃，提取次數(shù)3次，各因素影響楊桃多糖提取率的次序是：溫度＞料液比＞浸提時(shí)間＞提取次數(shù)。楊桃多糖的最佳的純化工藝是：用無水乙醇沉淀多糖（多糖液與乙醇的體積比是1∶5），活性炭脫色，Savage法脫蛋白。最后用透析袋進(jìn)行透析得到灰白色粉末狀的楊桃多糖。楊桃多糖對羥基自由基的清除率隨著楊桃多糖的濃度增大而增大。清除羥基自由基的能力最高可達(dá)51.49%。當(dāng)楊桃多糖的濃度達(dá)到一定時(shí)，多糖對羥基自由基的清除率受楊桃多糖的影響不大。

楊桃多糖；提取；純化；自由基

楊桃，被子植物門，是一種產(chǎn)于熱帶亞熱帶的水果，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[1]。楊桃性喜高溫潮濕，宜在疏松肥沃的壤土栽培[2]。楊桃營養(yǎng)豐富且全面，果實(shí)內(nèi)含有糖類（包括淀粉、葡萄糖、果膠、果糖、戊聚糖、甘露醇、其它膳食纖維等）、維生素、蛋白質(zhì)、多種氨基酸、脂肪等成分。作為楊桃中最主要的活性物質(zhì)多糖和果膠的含量比較高，而活性多糖是不可多得的藥用物質(zhì)，具有降血糖、降血脂、抗衰老和抗癌癥等功能性作用[3]。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)和食品安全所《中國食物成分表》記載，每100 g鮮楊桃中營養(yǎng)成分組成為：水分92.5g，碳水化合物5.3g，蛋白質(zhì)0.6g，果，1.5g，脂，1.2 g，膳食纖維1.1 g，維生素C 4 mg，維生素A 2.53mg，鉀元素126mg，磷元素27mg，鎂元素6mg[4]。

楊桃能減少機(jī)體對脂肪的吸收，有降低血脂、膽固醇的作用，對高血壓、動脈硬化等心血管疾病有預(yù)防作用[5]。近年來，隨著人民的生活水平的提高，他們的保健意識越來越強(qiáng)，開始逐漸改變以前的飲食方式，而越來越重視食物的營養(yǎng)和功能性結(jié)構(gòu)[7]。目前的楊桃開發(fā)應(yīng)用僅僅限于低層次的加工和應(yīng)用，對于楊桃中的活性物質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用還沒有得到很充分的利用和體現(xiàn)。

多糖是由單糖連接而成的天然大分子聚合物，廣泛存在于自然界中[8]。近幾年來對楊桃多糖的研究逐步引起廣大專家的重視。楊桃多糖作為楊桃中主要的活性物質(zhì)，它的功能性在很早以前就已經(jīng)被人們知道，但是由于技術(shù)的缺乏導(dǎo)致人們并不知道發(fā)揮這種功效的主要物質(zhì)是楊桃多糖。不過隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對于楊桃的研究不斷的深入才對楊桃多糖的提取方法、性質(zhì)以及功能性作用有了很深入的了解。

楊桃多糖是楊桃中最主要的活性成分之一。楊桃中的多糖是以糖蛋白的形式存在的，主要由糖（69.82%）、蛋白質(zhì)（17.53%）、氨基酸組成，其中糖的部分是由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖和葡萄糖醛酸等組成。楊桃多糖為灰白色粉末，溶于水，易溶于熱水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、石油醚，但會溶于低濃度的乙醇、乙酸乙酯等一些有機(jī)溶劑。楊桃多糖溶于水后，其溶液為透明粘稠狀[9]。

隨著對楊桃多糖研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到楊桃多糖及其復(fù)合物分子具有十分重要的生物功能[10]，楊桃多糖與免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞的識別、細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸、癌癥的診斷與治療等都有著密切的關(guān)系。

近年來，不少人已經(jīng)開始研究楊桃多糖的提取純化方法、多糖的生物活性機(jī)制及其活性功能等等。目前的研究熱點(diǎn)是優(yōu)化楊桃多糖的提取方法，確定其最佳提取工藝條件、楊桃多糖的生物活性機(jī)制及應(yīng)用、研究楊桃多糖活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系并加以有效的改造，使之增強(qiáng)原有的活性等[11]。隨著對楊桃多糖研究的深入，利用楊桃多糖來開發(fā)的保健食品的市場前景被人們看好。

國內(nèi)在對多糖的提取做了大量的研究[12]，但是楊桃多糖的提取純化工藝的研究很少，針對這一現(xiàn)狀，本文改進(jìn)了提取純化的工藝條件，已獲取制備楊桃多糖的最佳工藝。

1 材料與儀器

1.1 材料

萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、丙酮、蒽酮、聚乙二醇、三氯甲烷、異戊醇、石油醚、活性炭、過氧化氫、正丁醇、氯仿等：以上試劑均購于廣州化學(xué)試劑廠，純度為分析純。

1.2 儀器

FA2004電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KA-1000低速臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；721可見分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵：鞏義市英裕予華儀器廠；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市富華儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

2 方法

2.1 測定楊桃多糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

用分光光度法[13]測定楊桃多糖的濃度，其原理是：多糖類成分在濃硫酸作用下，先水解成單糖，然后迅速脫水成糖醛衍生物，最后與苯酚縮合成有色化合物，該產(chǎn)物在490 nm處有強(qiáng)吸收峰。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取葡萄糖10.0mg，定容至200mL的容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為50μg/mL的葡萄糖溶液。取上述溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL分別于6支試管中，加入蒸餾水至2.0mL，滴入5滴苯酚溶液，搖勻后迅速加入5.0mL濃硫酸，搖勻后靜置10min，然后沸水水浴加熱15min，迅速冷卻至室溫，以蒸餾水作為空白溶液，在490 nm處用721可見分光光度計(jì)測定其吸光度。以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法作線性回歸[14]，得到葡萄糖質(zhì)量濃度（C）與吸光度（A）的曲線。

楊桃多糖提取率的計(jì)算公式：

楊桃多糖的提取率/%=（多糖的質(zhì)量濃度×多糖溶液體積×稀釋倍數(shù)×10-6）/樣品質(zhì)量×100

2.2 提取工藝參數(shù)的確定

根據(jù)前人的研究，楊桃多糖提取的方法有熱水浸提法、堿提取法、酸提取法、水煮乙醇沉淀法、超聲波輔助提取法[15]、復(fù)合酶提取法等。根據(jù)現(xiàn)有的條件以及經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)，選用酸提取法提取楊桃多糖，主要從料液比、提取時(shí)間、浸提溫度、提取次數(shù)這4個(gè)因素來考慮對提取率的影響。

2.2.1 料液比對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5mL楊桃汁4份，分別加入15、20、25、30 mL蒸餾水，置于80℃的水浴中，浸提2 h，提取1次，離心，濾液稀釋后用苯酚-硫酸法[16]測定楊桃多糖的濃度，計(jì)算提取率。

2.2.2 時(shí)間對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5mL楊桃汁4份，加入20mL蒸餾水，控制水溫80℃，分別浸提1、2、3、4 h，提取1次，離心，濾液稀釋后用苯酚-硫酸法測定楊桃多糖的濃度，計(jì)算提取率。

2.2.3 溫度對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5mL楊桃汁4份，加入20mL蒸餾水，置于溫度不同的恒溫槽中，控制水溫分別是60、70、80、90℃，浸提2 h，提取1次，離心，濾液稀釋后用苯酚-硫酸法測定楊桃多糖的濃度，計(jì)算提取率。

2.2.4 提取次數(shù)對提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5mL楊桃汁4份，加入20mL蒸餾水，提取次數(shù)分別為1、2、3、4，置于80℃的水浴中，浸提2 h，離心，濾液稀釋后用苯酚-硫酸法測定楊桃多糖的濃度，計(jì)算提取率。

2.3 楊桃多糖的純化工藝與試驗(yàn)方法

楊桃粗多糖液→沉淀多糖→脫色→除蛋白→透析→二次沉淀→洗滌→烘干→楊桃多糖

2.3.1 多糖沉淀

提取得到的楊桃多糖液要進(jìn)行沉淀，一般都是用乙醇作為沉淀劑，不過也有文獻(xiàn)表明丙酮也可以作為楊桃多糖的沉淀劑，本試驗(yàn)主要是研究無水乙醇和丙酮這兩種沉淀劑對楊桃多糖的沉淀量得影響[17]。

2.3.2 脫色

多糖提取物脫色采用活性炭法和雙氧水法[18]?；钚蕴糠ㄊ菍⒋汲恋淼亩嗵怯靡欢康恼麴s水溶解，加入一定量的活性炭，水浴加熱攪拌一定時(shí)間，趁熱抽濾。濾液用無水乙醇沉析，抽濾，真空干燥得楊桃精多糖。

雙氧水的脫色法是將醇沉淀的多糖用一定量的蒸餾水溶解，按楊桃多糖濃縮液與過氧化氫的體積比為4∶1加入30%的過氧化氫溶液，磁力攪拌2 h脫色，去除色素。最后用無水乙醇沉析，抽濾，真空干燥得楊桃精多糖。

2.3.3 脫蛋白

楊桃粗多糖中含有游離蛋白，會影響多糖的分離提純。因此，在提純前需將游離蛋白除去。目前去除游離蛋白的有效方法是Savage法[19]。在楊桃粗多糖中加入氯仿-正丁醇混合溶液進(jìn)行充分振蕩，將游離蛋白變性成為不溶性物質(zhì)，經(jīng)離心分離去除，反復(fù)進(jìn)行5次～8次才能很好地去除蛋白質(zhì)。

在已脫色的楊桃多糖液中加入多糖液體積1/4的氯仿—正丁醇（一定比例的混合液），攪拌振動30min，置于分液漏斗中，靜置，分液，去上層清夜。在波長為595 nm處用可見分光光度計(jì)測溶液的吸光度，用去離子水做空白溶液。重復(fù)上述試驗(yàn)過程，直到吸光度值基本不變。本試驗(yàn)主要研究氯仿與正丁醇的比例對脫蛋白效果的影響，研究體積比比例為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1。

2.3.4 透析

透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，達(dá)到分離的方法。用透析法可以除去多糖中的無機(jī)鹽、單糖、多糖等雜質(zhì)，從而達(dá)到分離的效果。

將已經(jīng)脫蛋白后的多糖液裝入透析袋內(nèi)，將透析袋放入裝有蒸餾水的大燒杯中，透析2 d，乙醇沉淀，抽濾，真空干燥。

2.4 楊桃多糖的含量測定

準(zhǔn)確稱取5mL楊桃汁，按照所確定的最佳工藝條件提取楊桃多糖，稀釋至100mL的容量瓶中，用移液管量取2.0mL的多糖液，按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]的制作方法進(jìn)行測定，按照下面公式計(jì)算多糖含量：

楊桃多糖含量/%=（C×W×f）/M×100

式中：C為葡萄糖的濃度，g/mL；W為多糖液的稀釋因素；f為換算因子；M為楊桃多糖的質(zhì)量，mg。

換算因子f的測定方法：

準(zhǔn)確稱取0.020 g楊桃多糖，加水溶解，定溶于100mL的容量瓶中，用移液管量取2.0mL多糖液，按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測其吸光度值。按照下式計(jì)算換算因子[14]：

式中：m為多糖質(zhì)量，g；C為葡萄糖的濃度，g/mL；W為多糖的稀釋因素。

2.5 楊桃多糖清除自由基

H2O2與Fe2+混合后發(fā)生Fenton反應(yīng)而生成活性較強(qiáng)的羥基自由基，再與水楊酸生成有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510 nm處有強(qiáng)吸收峰，若體系中加入清除羥基自由基的物質(zhì)，則會減少有色物質(zhì)生成，吸收度降低，吸收度越低，清除羥基自由基的能力越強(qiáng)[20]。

取6支試管，依次編號，每支試管中各加入9mmoL/L硫酸亞鐵1mL，9mmoL/L水楊酸—乙醇溶液2 mL，按照試管的編號加入不同濃度的楊桃多糖2 mL，最后加入8.8mmoL/L過氧化氫2mL，在室溫下反應(yīng)1 h。以蒸餾水代替楊桃多糖液作為空白溶液調(diào)零，在510 nm處測定樣品的吸光度。

清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A0=0.437，為空白對照液的吸光度；As為樣品的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)Table1 Data of the standard curve

用分光光度法在490 nm下測定其吸光度，繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

經(jīng)統(tǒng)計(jì)直線回歸處理，得回歸方程為：A=0.023 5C-0.010 6，線性相關(guān)系數(shù)R=0.997 55，式中：A為吸光度；C為葡萄糖濃度（μg/mL）。

3.2 楊桃多糖提取率影響因素分析

3.2.1 料液比對提取率的影響

料液比對提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對楊桃多糖提取率的影響Fig.2 Solid-liquid ratio impact on the rate of carambola polysaccharide

本試驗(yàn)所謂的料液比是1mL楊桃汁與蒸餾水的體積之比。由圖2可知，隨著料液比的增大，楊桃粗多糖的提取率液減少。到了1∶4到1∶5之間，提取率增大，其最高點(diǎn)在1∶5。所以，可得出楊桃多糖最佳的料液比是1∶5。

3.2.2 時(shí)間對提取率的影響

時(shí)間對提取率的影響見圖3。

圖3 時(shí)間對楊桃汁多糖提取率的影響Fig.3 Time on carambola juice extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，提取時(shí)間越長，楊桃多糖的提取率越隨之增大，而且在1 h～3 h間，隨著時(shí)間的增加，3 h后，提取率下降。綜上所述，楊桃的提取時(shí)間最佳為3 h。

3.2.3 溫度對提取率的影響

溫度對提取率的影響見圖4。

圖4 溫度對楊桃多糖提取率的影響Fig.4 Carambola influence of temperature on the extraction rate of polysaccharides

由圖4可知，隨著溫度的升高，楊桃多糖的提取率也大致隨之增大，但隨之又下降，無法確定其最佳溫度。但從提取率來說，其最適宜的溫度是80℃。

3.2.4 提取次數(shù)對提取率的影響

提取次數(shù)對提取率的影響見圖5。

圖5 提取次數(shù)對楊桃多糖提取率的影響Fig.5 Extraction times influence on the rate of carambola polysaccharide

由圖5可知，在相同條件下，提取次數(shù)越大，提取率隨之減小。但3次之后，提取率減小，可能原因是提取過程中，楊桃多糖的流失。所以，最佳的提取次數(shù)是3次。

3.3 正交試驗(yàn)的結(jié)果分析

3.3.1 正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)結(jié)果，正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)如表2。

表2 楊桃多糖提取的水平因素表Table2 Level factor of pumpkin polysaccharide extracttables

3.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析表Table3 Results analysis table orthogonal experiment

由表3可知，根據(jù)k值可得最佳因素水平組合為A1B3C2D3，即提取楊桃多糖的最佳工藝條件是料液體積比1∶4，浸提時(shí)間4 h，提取溫度80℃，提取次數(shù)為4次。但是考慮到提取的成本和效率，實(shí)際最佳提取工藝調(diào)整為料液體積比為1∶4，浸提時(shí)間3 h，提取溫度80℃，提取次數(shù)為3次。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際最佳工藝條件下所得提取率為49.7%，可驗(yàn)證實(shí)際最佳工藝合理。

3.4 沉淀劑和脫色劑對楊桃多糖純化的影響

3.4.1 沉淀劑的影響

用無水乙醇作為沉淀劑，得到的楊桃多糖是黃褐色固體，其沉淀量為2.342 g（5mL楊桃汁）；采用95%乙醇作為沉淀劑，得到的楊桃多糖也是呈黃褐色，但沉淀量卻大大減少，其沉淀量只有2.126 g（5mL楊桃汁）；采用丙酮作為沉淀劑，得到的楊桃多糖也是呈黃褐色，但沉淀量卻大大減少，其沉淀量只有1.828 g（5mL楊桃汁）。所以，相對來說，無水乙醇更適合作為楊桃多糖的沉淀劑。

3.4.2 脫色劑的影響

經(jīng)活性炭脫色的楊桃多糖呈灰白色、粉末狀；用過氧化氫脫色的楊桃多糖呈乳白色，是顆粒較小的粉末。就產(chǎn)品外觀來說，過氧化氫的脫色效果比較好。但是過氧化氫脫色損耗較大，使最終得到的楊桃多糖大大減少，可能原因是過氧化氫具有強(qiáng)氧化性，容易導(dǎo)致楊桃多糖結(jié)構(gòu)的破壞，使楊桃多糖得率減少。而活性炭法條件溫和，不會影響到楊桃多糖的得率，故采用活性炭法脫色較好。經(jīng)過半透膜透析后，沉淀干燥后得到灰白色楊桃多糖粉末。

另外還需要考慮用氯仿和正丁醇對脫蛋白的影響。脫蛋白反復(fù)次數(shù)就越多，消耗的氯仿、正丁醇也就越多，而且也會損耗一定的楊桃多糖溶液。氯仿—正丁醇的比例為4∶1和5∶1時(shí)脫蛋白的次數(shù)一樣，但5∶1消耗的氯仿較多，而且氯仿是有毒試劑。綜上所述，氯仿、正丁醇的比例為4∶1為最佳比例詳見表4。

表4 氯仿-正丁醇比例影響脫蛋白次數(shù)表Table4 Chloroform-butanol ratio on the number of tables deproteinized

最后，通過測定計(jì)算得出楊桃多糖的含量是41.23%，比純化之前的多糖含量偏低。主要原因是純化過程中有一定的楊桃多糖損失，造成多糖含量偏低，未純化之前粗多糖中的雜質(zhì)也是影響楊桃多糖含量的測定。

3.5 楊桃多糖抗氧化性的初步研究分析

多糖對羥基自由基的清除率計(jì)算結(jié)果見表5。

由圖6可知，隨著楊桃多糖的濃度增大，多糖對羥基自由基的清除率也越來越大，而且當(dāng)楊桃多糖的濃度達(dá)到一定時(shí)，多糖對羥基自由基的清除率受楊桃多糖的影響不大。本試驗(yàn)測定楊桃多糖對羥基自由基的清除率最高可達(dá)51.49%。

表5 多糖對羥基自由基的清除率Table5 Polysaccharide hydroxyl radical scavenging rate

圖6 清除率隨濃度變化曲線圖Fig.6 Clearance rate of change with concentration curves

4 結(jié)論和討論

1）經(jīng)過單因素和試驗(yàn)確定了楊桃多糖最佳的提取工藝是：料液比為1∶4（體積比），加熱時(shí)間是3 h，提取次數(shù)3次，其最適宜的溫度是80℃。

2）隨著楊桃多糖的濃度增大，多糖對羥基自由基的清除率也越來越大，也即是抗氧化性也越來越強(qiáng)，而且當(dāng)楊桃多糖的濃度達(dá)到一定時(shí)，多糖對羥基自由基的清除率受楊桃多糖的影響不大。清除羥基自由基的能力最高可達(dá)51.49%。

3）因試驗(yàn)設(shè)備的限制，對于楊桃多糖的干燥，只能進(jìn)行簡單的真空干燥，可能干燥得不夠徹底，對提取率有一定的影響。

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Extracted Technology and Applied Research of Carambola Polysaccharide

SONG Zhao-feng
（Department of Chemistry and Chemical Engineering，F(xiàn)oshan University，F(xiàn)oshan 528000 Guangdong，China）

This study was the use of hot water extraction of acidic polysaccharides carambola，starfruit four factors polysaccharide extraction rate by studying effects：liquid ratio，temperature，extraction time，extraction times to study single factor. By orthogonal set of carambola best extraction of polysaccharides were：Solid-liquid ratio of 1 ∶ 4，extraction time was 3 hours，extraction temperature was 80 ℃，extracting 3 times，the factors affecting the rate of the order of carambola polysaccharide are：temperature＞ liquid ratio＞ extraction time＞ extraction times. Best carambola polysaccharide purification process were：anhydrous ethanol precipitated polysaccharide（multiple sugar and ethanol volume ratio was 1 ∶ 5），active carbon，Savage Law deproteinized. Finally，dialysis bag and dialyzed to obtain a white powder carambola polysaccharide. Carambola polysaccharide hydroxyl radical scavenging rate increased as the concentration increases carambola polysaccharides. Ability to scavenge hydroxyl radicals was up to 51.49 %. When the concentration reached a certain carambola polysaccharide，the polysaccharide hydroxyl radical scavenging rate was not affected carambola polysaccharides.

carambola polysaccharides；extraction；purification；radicals

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.013

2016-03-09

宋照風(fēng)（1984—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物提取。