馬雪飛，于 燁（上海交通大學醫(yī)學院藥理與化學生物學系，上海 200025）

ATP一直被認為是一種細胞內能源物質。研究發(fā)現(xiàn)，ATP也可作為一個重要的細胞外信號分子［1］。ATP下游信號主要通過激活嘌呤受體傳導，嘌呤受體分為P1和P2兩大類。其中，P1是G蛋白偶聯(lián)受體，P2受體包含P2X離子通道和P2Y G蛋白偶聯(lián)受體［2］。P2X受體是一種非選擇性陽離子通道，有7個亞型（P2X1～P2X7），允許Na+，K+和Ca2+等陽離子通過。其結構由同源或異源的3個亞基組成三聚體［3］。

P2X受體在體內廣泛表達，往往都是較低水平的表達。另外，在腦和脊髓中，未觀測到內源性ATP釋放引起動作電位發(fā)放。目前已建立起多個P2X敲除小鼠，但在相關報道中均未發(fā)現(xiàn)明顯的中樞神經相關的表型。這些現(xiàn)象一方面表明，ATP可能主要是通過激活突觸前P2X受體充當神經調節(jié)物質［4］；另一方面表明，P2X受體可能更多在病理情況下起重要作用。研究表明，大多數(shù)神經元細胞和小膠質細胞中都能發(fā)現(xiàn)P2X4受體［5-6］，在一定條件下，P2X4受體表達上調，介導多種病理過程，如神經性疼痛［7］、乙醇攝入和偏好［8］、癲癇［9］、卒中缺血或神經退行性疾病恢復［10］和神經炎癥［11］。P2X4受體可作為一個潛在的治療靶標，但由于P2X4受體缺少有效的選擇性抑制劑，非常不利于P2X4受體的功能研究。P2X4受體特異性抑制劑的發(fā)現(xiàn)，可促進P2X4受體生理病理功能的研究，也可為治療上述疾病提供新的藥理學方法。

1 P2X4受體在中樞神經系統(tǒng)中的分布及功能

P2X4最早在小鼠大腦中克隆，是第一個在中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中檢測到的P2X4受體［12］。隨后在人類大腦中也克隆到P2X4［13］。在大腦皮質神經元中發(fā)現(xiàn)具有功能的P2X4受體，伊維霉素（ivermectin，IVM，一類P2X4受體功能增強劑）可增強ATP誘導的電流［14］；通過激活P2X受體可誘導大腦皮質快速興奮突觸后電流，影響突觸可塑性［15］。在海馬體中ATP影響突觸可塑性［16］，ATP的釋放與海馬體的長時程增強（long-term potentiation，LTP）有關［17］，在海馬體神經元中，P2X受體激活會刺激或抑制谷氨酸釋放［18］。P2X4受體在海馬體的錐體細胞層、中間神經元以及海馬CA1，CA2和CA3錐體細胞中高水平表達［19］。相比野生型小鼠，P2X4敲除的小鼠中LTP減少，在野生型小鼠中IVM可增加LTP，但P2X4敲除小鼠中無此作用［20］，說明P2X4受體在LTP時可增強突觸活性。在海馬體CA1區(qū)鋅離子可通過調節(jié)P2X4受體而提高LTP［21］。

P2X4受體在小腦皮質大量表達，在浦肯野細胞層和顆粒細胞層，及星狀細胞和籃狀細胞中均檢測到P2X4受體的表達［22］。P2X4受體在舌下神經核中表達，可調節(jié)舌下神經的活性［23］。在室旁核和垂體前葉也檢測到P2X4受體的表達［24］。視上神經元表達了有功能的突觸前和突觸外P2X4受體，可調節(jié)谷氨酸和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyrate，GABA）的釋放［25］。在小丘腦神經元中增加P2X4受體的表達會導致GABA能電流減小，P2X4受體和GABAA受體相互作用共同調節(jié)突觸信號［26］。在下丘腦弓狀核的刺鼠肽基因相關蛋白-神經肽神經元中高表達P2X4受體。電生理實驗表明，P2X4受體介導突觸前GABA釋放到阿片-促黑素細胞皮質素原神經元，這些神經元都稱為集中投射神經元，在食欲的調節(jié)中發(fā)揮重要作用［27］。促黃體生成激素釋放激素的釋放也與P2X4受體有關［28］。

P2X4受體在軀體感覺神經元［14］、三叉神經元［29］、視網膜神經節(jié)和雙極細胞［30］以及脊髓［31］均有表達。在脊髓膠質細胞中發(fā)現(xiàn)大量的P2X4受體，在周圍神經損傷損傷后，P2X4的轉錄、翻譯水平均上調［6］。在脊髓中周圍神經損傷引起的疼痛可被P2X4受體的阻斷劑反轉［7］，敲除P2X4可緩解小鼠炎癥和神經性疼痛［6］。

2 P2X4受體參與的中樞神經系統(tǒng)相關疾病

P2X4受體參與CNS許多生理病理過程，包括慢性痛、乙醇攝入、癲癇、阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森病（PD）和卒中，P2X4可作為治療神經性疾病的一個重要潛在靶標。

2.1 慢性痛

近年來，P2X4受體對慢性痛的作用受到了廣泛的關注，而之前的研究主要是針對以神經元為中心的機制：原發(fā)性或者二級感受神經元的改變引起的過度興奮性，越來越多的研究證明了膠質細胞微環(huán)境的變化會引起周圍感覺神經元的超興奮性和疼痛應答。研究發(fā)現(xiàn)，隨著周圍神經的損傷，脊髓小膠質細胞P2X4受體在細胞膜上的表達量上升。而且P2X4受體抑制劑可反轉神經損傷引起的痛覺過敏，所以提出P2X4受體可能是治療這種神經疼痛的潛在靶標。小神經膠質細胞活化可誘發(fā)神經元超興奮性，這個信號通路的關鍵分子是腦源性神經營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）［32］，BDNF的釋放依賴ATP激活小膠質細胞的P2X4受體［33］。BDNF激活脊髓背角Ⅰ層神經元的TrkB受體，誘導K+/Cl-轉運體下調，使神經元內的氯離子升高，脊髓背角Ⅰ層神經元陰離子逆轉電位（EAnion）的去極化發(fā)生改變，并減少GABAA受體和甘氨酸對興奮性的抑制，從而產生疼痛［32］。所以，在小膠質細胞中，P2X4受體異常表達促成了周圍神經損傷誘導的神經疼痛，因此P2X4受體表達上調也成為研究對象。其中干擾素調節(jié)因子5（interferon regulatory factor-5，IRF-5）是參與P2X4受體轉錄調控的轉錄因子，缺少IRF-5的小鼠在周圍神經損傷后，脊髓中P2X4受體表達未上調，也未表現(xiàn)出對疼痛異常敏感［34］。

Src家族激酶Lyn對神經疼痛也具有重要作用。Lyn參與小膠質細胞活化，在神經損傷后，Lyn表達水平顯著上升，而在Lyn敲除小鼠隨著神經損傷并未出現(xiàn)P2X4受體表達上調和異常性疼痛［35］。Lyn可激活PI3K-Akt引起P2X4受體表達增加，所以，Lyn可能是調節(jié)小膠質細胞P2X4受體上調的關鍵激酶［36］。趨化因子CCL21也參與增加P2X4受體的表達，缺少CCL21可防止脊髓背角小膠質細胞P2X4受體的過表達，而使用CCL21可使小膠質細胞P2X4受體表達上調［37］。

神經損傷后誘發(fā)神經疼痛的機制存在性別差異，在雄性小鼠中小神經膠質細胞的P2X4受體表達上調并伴隨著P38絲分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）激活和BDNF的釋放，而在雄性小鼠中未出現(xiàn)P2X4受體表達上調，阻斷通路中的任何一步都不能有效治愈疼痛［38］。因此,上述疼痛機制不適用在雄性小鼠。

最近發(fā)現(xiàn)，P2X4受體與嗎啡耐受［39］和嗎啡誘導的痛覺過敏［40］有關。嗎啡誘導的痛覺過敏也需要阿片受體介導的脊髓小膠質細胞P2X4受體的上調［40］。由此說明，P2X4受體在疼痛通路中的重要作用。

2.2 乙醇攝入相關疾病

乙醇使用障礙已成為比較嚴重的健康問題，針對乙醇使用障礙的藥物開發(fā)是一個相對年輕的領域。目前被美國FDA批準的藥物有雙硫侖、環(huán)丙甲羥二羥嗎啡酮和阿坎酸［41-42］。但這些還遠不夠，因此，關于開發(fā)有效的治療乙醇使用障礙的藥物的研究越來越多。體外研究發(fā)現(xiàn)，乙醇可特異性地抑制P2X4受體電流［43］，而不抑制其他P2X4受體的功能。進一步研究表明，乙醇抑制P2X4受體是由于降低了ATP對P2X4受體的親和力［44］，乙醇會阻止P2X4受體開放狀態(tài)，但不影響受體失活。乙醇作用P2X4受體的關鍵位點Trp46，His241，Asp331和 Met336［45-46］也被發(fā)現(xiàn)。

研究表明，P2X4受體在特定的腦區(qū)表達水平較高，這些腦區(qū)都參與增強乙醇和其他藥物的性能［47］。一些研究發(fā)現(xiàn)，P2X4受體在乙醇誘導的行為中起作用，P2X4受體在維持多巴胺體內穩(wěn)態(tài)中起重要作用，因此參與飲酒行為［48］。P2X4受體表達水平與乙醇攝入相關，偏好乙醇的小鼠P2X4表達水平低于不喜乙醇的小鼠［49］。因此，乙醇攝入存在遺傳傾向，突出了在治療乙醇使用障礙的藥物開發(fā)中遺傳異質性的重要意義。P2X4受體敲除小鼠的乙醇攝入量明顯高于野生型小鼠［50］。相比野生型小鼠，敲除P2x4受體小鼠表現(xiàn)出不同的乙醇攝入、乙醇的鎮(zhèn)定催眠作用，小腦GABAA受體表達升高［51］。P2X4受體參與調節(jié)GABA的神經傳遞，意味著P2X4受體參與調節(jié)GABA介導的乙醇攝入調節(jié)。IVM可抑制乙醇對P2X4受體的作用，是因為干擾了乙醇在P2X4受體的結合位點［52］。IVM可能通過P2X4受體影響一些神經信號系統(tǒng)，例如GABA、谷氨酸和多巴胺，都參與乙醇攝入。因此，IVM可充當研究P2X4在乙醇攝入中功能的藥理學工具。

前期臨床證明，IVM可減少乙醇消耗，但作用有限［53］。IVM在大腦中無法達到較高的濃度，所以需要開發(fā)新的化合物，既可增強IVM在CNS中的滯留能力，還要保持減少乙醇攝入的能力和安全性。隨后發(fā)現(xiàn)的兩種IVM相關的大環(huán)內脂阿維菌素（abamectin）和司拉克?。╯elamectin），它們可穿過血腦屏障，減少乙醇攝入，改變GABAA受體的調節(jié)以及P2X4受體表達，相比IVM在大腦中濃度較高［54］。莫西菌素（moxidectin）具有作為乙醇使用障礙的新型藥物治療的潛力［55］。在中腦邊緣系統(tǒng)中，P2X4受體調節(jié)多巴胺能神經傳遞，在中腦邊緣系統(tǒng)的多巴胺能神經元中，P2X4受體在飲酒行為中具有重要作用，P2X4受體活性與其他多巴胺能神經傳遞相關的行為也有關［48］。

2.3 神經炎癥相關疾病

在大腦和脊髓中發(fā)生的炎癥響應一般稱為神經性炎癥，小神經膠質細胞是CNS的先天性免疫細胞，在介導神經炎癥響應中起關鍵作用［56］。神經炎癥反應需要一些關鍵因子，包括促炎癥細胞因子（IL-1β，IL-6和TNF-α）、趨化因子（CCL2，CCL5和CXCL1）和第二信使（一氧化氮和前列腺素），這些都由激活CNS中小膠質細胞和星形膠質細胞而產生［56］。

在脊髓損傷、外傷性腦損傷和腦缺血后受傷組織的P2X4受體表達增加。炎性體是多蛋白復合體，可促進炎癥細胞因子成熟，如IL-1β，可能參與調控神經炎癥過程。使用P2X4敲除小鼠檢測脊髓損傷后P2X4受體對炎性體激活和神經炎癥的作用，發(fā)現(xiàn)P2X4敲除小鼠在脊髓損傷后炎性體激活，促炎癥細胞因子和炎癥細胞浸潤均顯著減少。因此，P2X4受體在神經元介導的先天性神經炎癥中起重要作用［57］。在P2X4敲除小鼠中，癲癇發(fā)作后神經損傷和炎癥發(fā)生改變，P2X受體家族成員可能在癲癇的病理生理學中發(fā)揮重要作用，為癲癇發(fā)作控制和神經保護提供新的靶點［58］。將P2X4敲除小鼠誘導成持續(xù)癲癇狀態(tài)，48 h后小膠質細胞活化的部分功能被損害，如細胞招募、電壓依賴鉀通道上調［9］。

神經退行性疾病，如AD和PD也與神經炎癥相關［59］，其中小神經膠質起到重要作用［60-61］。P2X4受體參與調節(jié)小神經膠質細胞的信號通路，因此證明P2X4受體在各類與小膠質炎癥相關的疾病中具有重要作用。在多發(fā)性硬化動物模型中小神經膠質細胞P2X4受體表達上調［62］，在脂多糖誘導的神經炎癥中，用P2X4抑制劑可減少小神經膠質細胞的活性。急性缺血損傷導致嚴重神經元損傷的關鍵機制是炎癥。急性缺血導致死亡神經元和非神經元釋放過量的ATP，激活P2X4受體，P2X4受體在CNS高表達，尤其是在脊髓中，小膠質細胞是CNS中的免疫細胞，響應腦功能破壞，如缺血性卒中，卒中后小神經膠質細胞形態(tài)發(fā)生變化，產生炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α［63-64］，這些變化都伴隨著小神經膠質細胞活化和P2X4受體表達上調，P2X4敲除小鼠在脊髓損傷［57］和過敏原誘導的呼吸道炎癥［65］后，炎性體信號減少，在這些損傷模型中，P2X4陽性受體白細胞是釋放促炎癥細胞因子主要來源。這些結果表明，P2X4受體陽性小神經膠質細胞也是促炎癥細胞因子的重要來源。因此，P2X4受體參與神經性炎癥主要是通過P2X4受體調節(jié)小神經膠質細胞的信號通路。

3 P2X4受體特異性抑制劑

由于缺少特異性P2X4受體抑制劑，P2X4受體研究受到阻礙，之前的研究都用非選擇性P2X4受體抑制劑（TNP-ATP和BBG）研究P2X4受體，但它們對P2X4親和力小，效果不明顯。隨著研究發(fā)現(xiàn)，P2X4受體越來越重要，針對P2X4受體特異性抑制劑的研究也越來越受到關注，其發(fā)現(xiàn)可為針對P2X4受體治療提供新途徑。遺憾的是這些化合物與P2X4受體的作用機制并不清楚。根據(jù)已經解析的斑馬魚P2X4受體（zfP2X4）晶體結構，結合其他手段發(fā)現(xiàn)P2X4受體特異性抑制劑的作用位點，可為這些化合物的改造提供分子水平基礎。

3.1 5-BDBD

5-BDBD是第一個被發(fā)現(xiàn)的有效的P2X4受體特異性抑制劑，在HEK-293細胞表達人源P2X4（hP2X4）受體IC50值為1.2 μmol·L-1，2種不同濃度的5-BDBD導致ATP濃度依賴曲線右移，說明5-BDBD是競爭抑制劑［66］。但后來也有研究表明，5-BDBD并非競爭性抑制劑，而是變構調節(jié)劑［67］，在應用方面，敲除P2X4或使用5-BDBD可以緩解小鼠呼吸道炎癥，表明5-BDBD在臨床上有潛在應用價值。

3.2 BX430

最近發(fā)現(xiàn)的一個P2X4受體抑制劑BX430，IC50值為0.54 μmol·L-1，相比其他P2X受體具有高選擇性，是非競爭性變構調節(jié)劑。BX430對P2X4受體的抑制作用具有種屬特異性，目前發(fā)現(xiàn)它可抑制hP2X4和zfP2X4，但只能較弱抑制小鼠源和大鼠源P2X4受體的功能［68］。

3.3 PSB

PSB-12054是一個強效的hP2X4受體抑制劑，IC50值為0.189 μmol·L-1，在小鼠和大鼠的效果稍低一些，相比其他P2X受體，也同樣具有高的選擇性。其類似物PSB-12062效率相比之前的低，但在人、小鼠和大鼠3個種屬抑制效率相似［69］。

3.4 NP-1815-PX

NP-1815-PX是一個新的P2X4抑制劑，在人源P2X4 上，IC50值為 0.26 μmol·L-1，對小鼠源和大鼠源也同樣具有抑制作用。相比其他P2X受體，它對P2X4具有高選擇性。在慢性痛模型中，NP-1815-PX可緩解神經損傷相關的疼痛［70］。

4 結語

大量研究表明，P2X4受體在CNS中的重要作用（圖1）。當周圍神經損傷、脊髓損傷、外傷性腦損傷以及腦缺血時，引起P2X4受體表達上調，通過相關的信號轉導最終導致慢性痛、神經炎癥、乙醇使用障礙和多發(fā)性硬化等疾患。因此，P2X4受體可作為潛在的藥物靶點在這些疾病中發(fā)揮作用。隨著P2X4受體晶體結構的相繼解析，對P2X4受體結構有了更深入的研究，為研究P2X4受體與抑制劑和增強劑的結合機制提供了結構基礎。多個內源性或外源性的物質或者藥物分子都可以調節(jié)P2X4受體的功能。新型P2X4受體特異性抑制劑或者增強劑的發(fā)現(xiàn)，有助于研究P2X4受體在疾病中的作用，為治療相關疾病提供新的潛在藥物。

圖1 P2X4受體在中樞神經系統(tǒng)中的重要作用及目前已知的靶向P2X4受體的抑制劑.

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