付 偉,任 嬌,魏 霜,袁俊杰,周廣彪,吳希陽,朱水芳,劉中勇,*

(1.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100176;2.汕頭出入境檢驗檢疫局,廣東汕頭 515041;3.湛江出入境檢驗檢疫局,廣東湛江 835000;4.暨南大學理工學院食品科學與工程系,廣東廣州 510632)

付 偉1,任 嬌2,魏 霜2,袁俊杰3,周廣彪2,吳希陽4,朱水芳1,劉中勇2,*

(1.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100176;2.汕頭出入境檢驗檢疫局,廣東汕頭 515041;3.湛江出入境檢驗檢疫局,廣東湛江 835000;4.暨南大學理工學院食品科學與工程系,廣東廣州 510632)

本文針對大豆內(nèi)源基因Lectin和轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6品系的5′端插入位點序列,設計特異性引物及探針,建立同時檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6品系和大豆內(nèi)源基因Lectin的多重熒光定量PCR方法,并運用15種轉(zhuǎn)基因大豆、3種轉(zhuǎn)基因玉米、1種轉(zhuǎn)基因油菜、1種轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因大豆對該方法進行特異性評價,并分析該方法的靈敏度和穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,該方法能準確從20種轉(zhuǎn)基因樣品和1種非轉(zhuǎn)基因樣品中檢出靶目標,檢測結(jié)果與待檢樣品信息一致,表明本方法具有良好的特異性;靈敏度高達0.01%;重復性實驗表明DAS81419品系4種含量、9次重復反應Ct值的標準偏差介于0.050～0.222,相對標準偏差介于0.169%～0.677%,均在可接受范圍內(nèi)。該方法特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性強,適用于各口岸實驗室進行轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6的快速、準確的檢測。

多重熒光定量PCR,轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6，檢測

圖1 轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6外源插入片段示意圖及特異性引物探針位點Fig.1 Insertion scheme of GM soybean DAS44406-6 and the corresponding location of specific primer and probe

表1 引物探針序列Table 1 Sequence of primers and probes

自1996年轉(zhuǎn)基因作物開始商業(yè)化種植以來,每年都以驚人的速度發(fā)展。2015年全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積為1.797億公頃,與1996年的170萬公頃相比增加了100倍,而轉(zhuǎn)基因大豆是種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物[1]。中國是大豆和大豆產(chǎn)品進口國,國內(nèi)需求量不斷增加引起轉(zhuǎn)基因大豆進口量屢創(chuàng)新高[2]。2002年,我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》及衛(wèi)生部出臺《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》,規(guī)定轉(zhuǎn)基因食品必須強制性的進行轉(zhuǎn)基因標識[3]。正因如此,對轉(zhuǎn)基因大豆檢測技術的要求也越來越高。

目前為止,被批準進入中國的轉(zhuǎn)基因大豆品系只有10種(A2704-12、A5547-127、CV127、DP305423、DP305423×GTS40-3-2、DP356043、GTS40-3-2、MON87701、MON87701×MON89788、MON89788),轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6沒有獲得我國批準。轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6是美國陶氏益農(nóng)公司研發(fā)的抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆,主要含有3個抗除草劑基因2mepsps、pat、aad-12,能同時耐受草銨膦、草甘膦和2,4-D除草劑。然而,目前我國沒有轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6的檢測標準方法,不利于口岸實驗室開展非法轉(zhuǎn)基因品系的把關檢測。因此,建立轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6的檢測方法具有相當?shù)囊饬x。

轉(zhuǎn)基因大豆的檢測方法主要是基于核酸的檢測技術,主要有PCR法[4-5]、多重PCR[6-7]、熒光定量PCR法[8]、數(shù)字PCR[9]、芯片法[10]、等溫擴增法[11-13]等。其中熒光定量PCR技術具有快速、靈敏、準確、污染少、無需凝膠電泳等優(yōu)點,被廣泛應用于轉(zhuǎn)基因大豆成分的定量檢測,并且歐盟轉(zhuǎn)基因標準及我國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準和國家標準也均采用該方法進行檢測[14-15]。此外,轉(zhuǎn)基因大豆成分DAS44406-6實際檢測中,通常需要同時檢測大豆內(nèi)源基因,而多重PCR能在同一反應體系中復合擴增,可高效同時檢測出多個基因,方便快捷。因此,本研究旨在建立一套同時檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6和大豆內(nèi)源基因Lectin的單管多重熒光定量PCR,為出入境檢驗檢疫口岸實驗室轉(zhuǎn)基因大豆檢測提供新思路,為加強轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管力度提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、A2704-12、MON89788、A5547-127、DP-356043-5、CV127、MON87708、FG72、DAS44406-6、DAS68416、MON87701、MON87705、DP-305423-1、MON87769、DAS81419,轉(zhuǎn)基因玉米BT176、MON810、T25,轉(zhuǎn)基因油菜GT73,轉(zhuǎn)基因水稻TT51-5,非轉(zhuǎn)基因大豆 上述樣品均保存于中國檢驗檢疫科學研究院;TaqMan? Universal PCR Master Mix 美國ABI公司。

Roche Lightcycler 480熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司;NanoDrop核酸蛋白分析儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用CTAB法[16]提取1.1中轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因樣品的基因組DNA,提取后取1 μL用核酸蛋白分析儀測定提取的基因組DNA的濃度和純度,用TE將所有樣品標定至100 ng/μL,保存于-20 ℃待用。

1.2.2 引物及探針 根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6的5′端插入序列設計引物和探針,引物和探針位點如圖1所示,將設計的引物和探針在NCBI中進行比對,確定引物和探針的理論特異性,大豆內(nèi)源基因引物和探針參考文獻。上述所有引物及探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(見表1)。

1.2.3 多重熒光定量PCR反應體系 多重熒光定量PCR反應體系包括2×TaqMan? Universal Master Mix 10 μL,各引物終濃度均為0.4 μmol/L,各探針終濃度均為0.2 μmol/L,DNA模板100 ng,ddH2O補足至20 μL。反應程序為:50 ℃ UNG酶處理2 min;95 ℃預變性10 min;95 ℃15 s,60 ℃ 1 min,40個循環(huán),每個循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號。

1.2.4 多重熒光定量PCR特異性實驗 以1.2.1提取的15種轉(zhuǎn)基因大豆、3種轉(zhuǎn)基因玉米、1種轉(zhuǎn)基因油菜、1種轉(zhuǎn)基因水稻的基因組DNA為模板,并以非轉(zhuǎn)基因大豆的基因組DNA為模板作為陰性對照,按照1.2.3的反應體系及程序進行熒光定量PCR擴增。同時以轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6歐盟標準方法[14]中的引物和探針作為特異性驗證的陽性對照。

1.2.5 多重熒光定量PCR靈敏度測試 以1.2.1提取的轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6和非轉(zhuǎn)基因大豆的基因組DNA為材料,按照一定的體系分數(shù)進行混合,分別配制成轉(zhuǎn)基因大豆含量為100%、10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%的樣品,以1.2.3的反應體系進行多重熒光定量PCR,每個濃度梯度重復3次,以確定本方法檢測方法的靈敏度。

表2 多重熒光定量PCR特異性驗證Table 2 Specificity test of the multiplex real-time PCR

注:+代表陽性,-代表陰性。

1.2.6 多重熒光定量PCR重復性實驗 對1.2.5種配置成的轉(zhuǎn)基因大豆含量為100%、10%、1%、0.1%的樣品,以1.2.3的反應體系進行多次熒光定量PCR,每個濃度重復9次,計算這4個濃度、每個濃度9次重復的標準偏差(SD)和相對標準偏差(RSD),進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重熒光定量PCR的建立

調(diào)整2對引物和探針的濃度,引物濃度調(diào)整范圍為0.5、0.4、0.3、0.2 μmol/L,探針濃度調(diào)整范圍為0.2、0.15、0.1、0.05 μmol/L,最終確定2對引物的濃度均為0.4 μmol/L,2條探針的濃度均為0.1 μmol/L,建立了多重熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6,結(jié)果如圖2所示,2個基因均順利擴增,陰性對照無擴增。

圖2 多重熒光定量PCR的建立Fig.2 Establish of the multiplex real-time PCR

2.2 多重熒光PCR特異性實驗

結(jié)果如表2所示,所有的轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆樣品Lectin基因結(jié)果均為陽性,其余樣品Lectin基因結(jié)果均為陰性;僅有轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6樣品出現(xiàn)DAS44406-6品系特異性陽性結(jié)果,其余樣品均為陰性,品系特異性結(jié)果與歐盟標準方法一致。上述結(jié)果表明本研究建立的多重熒光定量PCR檢測方法對大豆內(nèi)源基因Lectin及轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6品系均表現(xiàn)高特異性。

表3 多重熒光定量PCR體系的重復性實驗Table 3 Reproducible test of the multiplex real-time PCR

2.3 多重熒光PCR靈敏度測試

如圖3所示,當模板含量為100%～0.001%時,大豆內(nèi)源基因Lectin以及轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6品系均可觀察到擴增曲線,且模板含量與Ct值成比例關系,當模板含量為100%～0.01%時,每個含量的2個基因、3次重復均能順利擴增,而當模板含量為0.001%時,均無擴增,因此本方法同時檢出Lectin內(nèi)源基因以及DAS44406-6品系的最低檢出限為0.01%。許多國家實施轉(zhuǎn)基因食品標識管理制度,將轉(zhuǎn)基因食品和傳統(tǒng)食品區(qū)分開來,從而保障消費者的知情權和選擇權,并且規(guī)定食品中含有的轉(zhuǎn)基因生物成分不能超過一定的閾值。不同國家對轉(zhuǎn)基因標識閾值規(guī)定不同,例如歐盟為0.9%(轉(zhuǎn)基因成分來源獲得歐盟批準)和0.5%(轉(zhuǎn)基因成分來源未獲得歐盟批準)[17];巴西、澳大利亞、捷克、沙特阿拉伯、以色列為1%[18];瑞士、韓國為3%[19];日本、俄羅斯、泰國、中國臺灣地區(qū)為5%[20]。標識管理制度能否有效實施依賴于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術,這就要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術要能夠進行精確定量。本研究中轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6和大豆內(nèi)源基因Lectin的擴增條件一致,且檢測靈敏度可以達到0.01%,完全可以滿足國際上對轉(zhuǎn)基因食品檢測低限的要求。

圖3 多重熒光定量PCR靈敏度測試Fig.3 Sensitivity test of the multiplex real-time PCR

2.4 多重熒光PCR重復性測試

對100%、10%、1%、0.1%轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6共4個含量,每個濃度9次重復的擴增結(jié)果進行分析。結(jié)果表明,Lectin基因4種含量、9次重復反應Ct值的標準偏差介于0.064～0.095,相對標準偏差介于0.204%～0.295%;DAS81419品系4種含量、9次重復反應Ct值的標準偏差介于0.050～0.222,相對標準偏差介于0.169%～0.677%,均在可接受范圍內(nèi)[17-20],表明本研究建立檢測方法具有比較好的可重復性。

3 結(jié)論

針對目前我國沒有建立標準的轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6,采用大豆內(nèi)源基因Lectin作為指示PCR反應假陽性的有效方式,針對大豆內(nèi)源基因Lectin和轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6品系的5′端插入位點序列,設計特異性引物及探針,建立一種多重熒光定量PCR方法,在單一反應管內(nèi)同時檢測轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406-6和大豆內(nèi)源基因Lectin兩種基因,并運用15種轉(zhuǎn)基因大豆、3種轉(zhuǎn)基因玉米、1種轉(zhuǎn)基因油菜、1種轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因大豆對該方法進行特異性評價,靈敏度高達0.01%,重復性實驗表明DAS81419品系4種含量、9次重復反應Ct值的標準偏差介于0.050～0.222,相對標準偏差介于0.169%～0.677%,均在可接受范圍內(nèi),該方法提高了轉(zhuǎn)基因檢測效率,有較好的推廣和應用前景。

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Multiplex real-time PCR for the detection of genetically modified soybean DAS44406-6

FU Wei1,REN Jiao2,WEI Shuang2,YUAN Jun-jie3,ZHOU Guang-biao2,WU Xi-yang4,ZHU Shui-fang1,LIU Zhong-yong2,*

(1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100176,China;2.Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shantou 515041,China;3.Department of Food Science and Engineering,College of Science and Technology,Jinan University,Zhanjiang 835000,China;4.Zhanjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510632,China)

Specific primers and probes based on the 5′ flanking sequence of exogenous fragments of genetically modified(GM)soybean DAS44406-6 and endogenousLectingene of soybean were designed. A multiplex real-time PCR for the detection of GM soybean DAS44406-6 and endogenousLectingene of soybean simultaneously had been developed. The specificity,sensitivity and stability of this method had been tested by 15 GM soybean,3 GM maize,1 GM rape,1 GM rice and 1 non-GM soybean. Results indicated that this multiplex real-time PCR method could accurately detect target from 20 GM samples and 1 non-GM sample,which was in accordance to the predicted results.. The sensitivity of this method was 0.01%. The repeatability test showed that the standard deviation(SD)of the Ct value ranged from 0.050 to 0.222 and the relative standard deviation(RSD)ranged from 0.169% to 0.677% of the 9 replicates about 4 concentration DNA templates,which were all in acceptable range. In conclusion,this multiplex real-time PCR method was high specific,sensitive and reliable,and would be an effective tool for the detection of GM DAS44406-6 in the laboratory of CIQ(China entry-exit inspection and quarantine bureau,CIQ).

multiplex real-time PCR;genetically modified soybean DAS44406-6;detection

2016-08-09

付偉(1983-)，女，博士，副研究員，研究方向：轉(zhuǎn)基因生物安全，E-mail:fuwei0212@163.com。

*通訊作者:劉中勇(1962-)，男，本科，研究員，研究方向：生物安全，E-mail:liuzy@cichk.com.hk。

廣東省科技計劃項目(2014A040401029)；轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品抽制樣和精準檢測技術(2016ZX08012-001)；廣州市科技計劃項目(2014J4100105)。

TS214

A

:1002-0306(2017)04-0063-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.003