劉 穎,劉麗宅,于曉紅,付 薇,張 丹,竇博鑫

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076)

限制性酶解乳清蛋白功能性質(zhì)研究

劉 穎,劉麗宅,于曉紅,付 薇,張 丹,竇博鑫

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076)

探究乳清蛋白在堿性蛋白酶限制性水解下功能性質(zhì)變化。以乳清蛋白的溶解性，乳化性、乳化穩(wěn)定性，起泡性、起泡穩(wěn)定性為考察指標(biāo),確定乳清蛋白的等電點(diǎn)及分析不同水解度下乳清蛋白功能性質(zhì)在pH調(diào)控下的變化。結(jié)果表明:乳清蛋白的等電點(diǎn)為4.8。乳清蛋白進(jìn)行限制性酶解后功能性質(zhì)有了很大提高,其中溶解性在DH14、pH10下達(dá)到最大值,較原蛋白提高了14.55%;起泡性在DH14、pH4下達(dá)到最大值,較原蛋白提高了107.5%;起泡穩(wěn)定性在DH4、pH4下達(dá)到最大值,比原蛋白提高了8.66%;乳化性在DH14、pH12下達(dá)到最大值,比原蛋白提高了56.1%;乳化穩(wěn)定性DH4、pH12下達(dá)到最大值,比原蛋白提高了50.42%。

乳清蛋白,限制性酶解,功能性質(zhì)

乳清蛋白是利用現(xiàn)代生產(chǎn)工藝從牛奶中提取出來的蛋白質(zhì)。乳清蛋白在牛奶中的含量?jī)H為0.7%,可見其彌足珍貴,被稱為蛋白之王[1]。乳清蛋白的主要成分是β-乳球蛋白(56%～60%)﹑α-乳白蛋白(18%～24%)﹑血清白蛋白(6%～12%)和免疫蛋白(6%～12%),此外還有少量的乳鐵蛋白、過氧化物酶和生長(zhǎng)因子等生物活性物質(zhì)[2]。乳清蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最全面的蛋白之一[3-5],它獨(dú)特的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)[6-7]賦予它廣泛的功能特性,而且營(yíng)養(yǎng)功能極佳[8-10],這些性質(zhì)對(duì)亞洲和中國(guó)的食品加工者來說是十分有益的。

國(guó)內(nèi)外對(duì)乳清蛋白酶解的研究主要集中于乳清蛋白酶解條件優(yōu)化[11-13],酶解物抗氧化活性[14],降低抗原性[15]等,而功能性質(zhì)等問題的研究較少。所以,為了提高乳清蛋白的功能性質(zhì),并避免高水解度下苦味肽的大量產(chǎn)生和乳清蛋白結(jié)構(gòu)被破壞,本文在較低的水解度下改性乳清蛋白,并研究乳清蛋白在pH調(diào)控下功能性質(zhì)的變化,對(duì)不同水解度下的乳清蛋白的功能性質(zhì)進(jìn)行較全面的分析,為乳清蛋白在食品加工領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

WPI-9410乳清蛋白 美國(guó)HILMAR;堿性蛋白酶,測(cè)定酶活130480 U/g 諾維信(中國(guó))公司北京辦事處。

pHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;SY-2-4型磁力恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司;80-2型高速離心機(jī) 上海浦東物理光學(xué)儀器廠;LNK-871型凱氏定氮儀 上海貝特儀器有限公司;ALC-2100型電子分析天平 上海精密儀器儀表有限公司;721E型紫外可見分光光度 上海光譜儀器有限公司;DJ1C型増力攪拌器 金壇市三和儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳清蛋白純度測(cè)定 根據(jù)GB 5009.5-2010進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。乳清蛋白純度按式(1)計(jì)算。

乳清蛋白純度(%)=樣品中乳清蛋白含量(g)/稱取樣品質(zhì)量(g)×100

式(1)

1.2.2 水解度的測(cè)定 采用pH-stat法[16-17]。自加入酶制劑始,用pH計(jì)連續(xù)監(jiān)視逐滴加入0.1 mol·L-1NaOH溶液以保持反應(yīng)體系pH不變,記錄遞加NaOH的時(shí)間和加入量。水解度的計(jì)算公式(2):

式(2)

式中:B堿液的體積(mL);Nb堿液的摩爾濃度(mol·L-1);α氨基的解離度,α=10(pH-pK)/(1+10pH-pK),其中pH是反應(yīng)體系的pH,pK是反應(yīng)條件下α-氨基酸解離常數(shù)(一般取7.0計(jì)算);Mp底物中蛋白質(zhì)的含量(g);htot底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)(mmol·g-1),乳清蛋白htot=7.3477。

1.2.3 堿性蛋白酶限制性作用乳清蛋白 配制一定濃度的乳清蛋白溶液,在堿性蛋白酶最適反應(yīng)條件pH9.0,50 ℃進(jìn)行酶解,為了避免苦味肽大量產(chǎn)生,也同時(shí)提高乳清蛋白的功能性質(zhì),控制乳清蛋白的水解度小于15%,通過對(duì)添加到維持體系的0.1 mol·g-1NaOH添加量的控制對(duì)乳清蛋白的酶解過程進(jìn)行控制,分別對(duì)水解度DH2、DH4、DH6、DH8、DH10、DH12、DH14下乳清蛋白的溶解性,起泡及起泡穩(wěn)定性,乳化及乳化穩(wěn)定性進(jìn)行分析,并考察不同水解度下乳清蛋白酶解液在pH調(diào)控下功能性質(zhì)變化。

1.2.4 乳清蛋白溶解性的測(cè)定 配制2%的蛋白液,25 ℃恒溫振蕩1 h,4000 r/min離心25 min,得上清液。采用福林酚法測(cè)定上清液中的蛋白含量[18]。每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,溶解性以NSI表示,按式(3)計(jì)算。

式(3)

1.2.5 乳清蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性測(cè)定 配制2%的蛋白液,調(diào)節(jié)不同pH,放入250 mL的燒杯中,用高速分散器在10000 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌2 min,立即記錄此時(shí)溶液上部體積(V0),靜置30 min后再次記錄泡沫體積[19](V1)。每個(gè)樣品都重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

式(4)

式中:FS起泡穩(wěn)定性,%;V0起泡能力,mL;V1泡沫體積,mL。

1.2.6 乳清蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定采用濁度法[20]。具體操作如下:

以2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的乳清蛋白溶液 21 mL,邊攪拌邊加入純大豆色拉油 9 mL,然后以 8000～10000 r/min的速度高速勻漿 1 min制成乳狀液,用微量注射器從底部抽取乳狀液50 μL,放入試管中,與預(yù)先在試管中加5 mL,0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液混合制成混合液,在500 nm的波長(zhǎng)下測(cè)吸光值E0,該值為乳化活性指數(shù)(EAI),再過 10 min測(cè)吸光值Et,每個(gè)樣品都重復(fù)三次實(shí)驗(yàn),乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)按公式(5)計(jì)算:

式(5)

式中:E0乳化活性指數(shù);Et 10 min后的吸光度值;t 10 min。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 在SPSS 17.0軟件和Excel中進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清蛋白純度測(cè)定

經(jīng)公式(1)計(jì)算后得:乳清蛋白的純度為93.24%,試劑包裝標(biāo)注乳清蛋白>90%,測(cè)定值與乳清蛋白包裝標(biāo)注相同。

2.2 乳清蛋白溶解性及等電點(diǎn)測(cè)定

經(jīng)過3次平行實(shí)驗(yàn)確定乳清蛋白的等電點(diǎn)為4.8,與陳靜廷[21]等的結(jié)果一致,在等電點(diǎn)處乳清蛋白的溶解度為50.08%。

圖1 福林酚法測(cè)定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The Folin method for the determination of protein standard curve

圖2 乳清蛋白等電點(diǎn)處溶解性曲線Fig.2 Whey protein solubility curve at isoelectric point

通過對(duì)不同pH下乳清蛋白各水解度下溶解性曲線圖3所示,各水解度下乳清蛋白的溶解性隨著pH的增加基本呈現(xiàn)上升趨勢(shì),當(dāng)DH>8,pH>10時(shí),乳清蛋白的溶解性下降,這是因?yàn)殡S著水解度的增加,不溶性乳清蛋白被分解成可溶性小分子蛋白,這些可溶的小分子蛋白在高pH下會(huì)發(fā)生變性,影響了乳清蛋白溶解性。

圖3 不同pH下乳清蛋白各水解度下溶解性曲線Fig.3 Whey protein solubility curve under different degree of hydrolysis and pH

pH4處距離乳清蛋白的等電點(diǎn)接近,在此pH條件下堿性蛋白酶限制作用下的乳清蛋白的溶解性在分析水解度下有了很大提高,DH14時(shí)溶解性可達(dá)到83.14%,這是因?yàn)槿榍宓鞍自趬A性蛋白酶作用下,結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,產(chǎn)生的一些可溶性蛋白的等電點(diǎn)較原來乳清蛋白發(fā)生一些偏移,使得等電點(diǎn)處的乳清蛋白溶解性增大。

圖4 不同DH下乳清蛋白酶解物溶解性曲線Fig.4 Whey protein solubility curve under different degree of hydrolysis

在極端pH(pH2和pH12)下,乳清蛋白的溶解性隨著水解度的增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這是因?yàn)樵诖藀H下乳清蛋白及水解作用產(chǎn)生的小分子可溶性蛋白會(huì)部分變性,影響其溶解性。

當(dāng)DH達(dá)到14時(shí),pH10下乳清蛋白的溶解性達(dá)到分析范圍內(nèi)的最大值為96.42%;較原蛋白在此pH下的溶解性提高了14.55%。

2.3 乳清蛋白起泡性測(cè)定

通過對(duì)不同pH下乳清蛋白各水解度下起泡性曲線圖5可知,乳清蛋白的起泡性隨著pH的變化呈現(xiàn)不同變化;當(dāng)pH<4時(shí)在輕度水解下(DH0～DH2)下乳清蛋白因pH偏離等電點(diǎn),起泡性增加;這是因?yàn)槿榍宓鞍捉Y(jié)構(gòu)相對(duì)其他水解度下較穩(wěn)定,偏離等電點(diǎn)處會(huì)使乳清蛋白的溶解性大大提高,從而使可溶的乳清蛋白含量增加,起泡性增大。

圖5 不同pH下乳清蛋白各水解度下起泡性曲線Fig.5 Whey protein foaming curve under different degree of hydrolysis and pH

隨著水解程度的不斷加大(DH4～DH14)，在pH4即等電點(diǎn)附近，乳清蛋白的起泡性隨著pH的降低呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)出一些可溶的乳清蛋白具有很好的溶解空氣的能力,這些可溶的乳清蛋白分子提高了氣-液界面的交互能力,從而提高了其起泡能力,當(dāng)pH降低達(dá)到極端條件下,這些因水解作用而產(chǎn)生的可溶乳清蛋白分子特性受pH影響顯著,發(fā)生改變,從而影響其起泡性。

當(dāng)pH>4時(shí),乳清蛋白隨著水解度程度的增加起泡性呈現(xiàn)不同變化;在DH0～DH4之間,乳清蛋白的起泡性隨著pH的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì),這是因?yàn)槿榍宓鞍纂S著pH的增加溶解性增大,而溶解性影響乳清蛋白的起泡性[18],此條件下溶解性的影響大于pH的影響;在DH6～DH8之間,乳清蛋白的起泡性隨著pH的增加先增大后減少,當(dāng)pH達(dá)到10時(shí)達(dá)到最大值,當(dāng)pH達(dá)到12極端條件下,乳清蛋白的起泡性下降,且下降幅度大,這是因?yàn)殡S著水解度的增加,一些不溶的乳清蛋白分子在堿性蛋白酶的作用下變?yōu)榭扇艿男》肿拥鞍?這些小分子蛋白受pH的影響顯著,極端pH下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,從而影響其起泡性;當(dāng)DH10～DH14之間,水解程度的增大使乳清蛋白在pH10處起泡性開始下降,當(dāng)在極端pH下下降程度很大,說明了因堿性蛋白酶作用產(chǎn)生的小分子可溶蛋白受pH的影響顯著。

在pH為4時(shí),即等電點(diǎn)附近,乳清蛋白的起泡性隨著堿性蛋白酶作用程度的增大提高幅度明顯,且在分析范圍內(nèi)的水解度下起泡性一直在提高。這是說明堿性蛋白酶可以使乳清蛋白中不溶性蛋白變?yōu)榭扇苄缘鞍?可溶性蛋白的提高直接影響乳清蛋白的起泡性。

通過對(duì)不同DH下乳清蛋白起泡性曲線圖6可知,在酸性條件下(pH<7),乳清蛋白的起泡性隨著酶作用程度的增加不斷提高,但是當(dāng)DH達(dá)到14時(shí),在pH2下開始下降,下降趨勢(shì)較小,這是因?yàn)樗獬潭燃哟?產(chǎn)生的小分子蛋白在極端pH下特性變化引起。當(dāng)在堿性條件下(pH>7),當(dāng)pH為8時(shí),在DH12下乳清蛋白的起泡性達(dá)到分析范圍內(nèi)的最大值,隨著水解程度的增加,起泡性降低;當(dāng)pH為10時(shí),在DH8下乳清蛋白的起泡性達(dá)到分析范圍內(nèi)的最大值,隨著水解程度的增加,起泡性降低;當(dāng)pH為12時(shí),在DH4下乳清蛋白的起泡性達(dá)到分析范圍內(nèi)的最大值,隨著水解程度的增加,起泡性降低,這說明了乳清蛋白隨著堿性蛋白酶作用程度的加大,起泡性受pH影響越來越大。經(jīng)過堿性蛋白酶作用后的乳清蛋白的起泡性有了很大提高,在DH14,pH4下乳清蛋白的起泡性能力達(dá)到最值83 mL。

圖6 不同DH下乳清蛋白酶解物起泡性曲線Fig.6 Whey protein foaming curve under different degree of hydrolysis

2.4 乳清蛋白起泡穩(wěn)定性性測(cè)定

通過對(duì)不同pH下乳清蛋白各個(gè)水解度下起泡穩(wěn)定性曲線圖7可知,乳清蛋白在pH為4下即等電點(diǎn)附近,起泡穩(wěn)定性在分析范圍內(nèi)各個(gè)水解度下達(dá)到最大值,這是因?yàn)榇颂幦芙獾娜榍宓鞍自诮缑嫔湘i形成的界面膜的穩(wěn)定性最好,且此處乳清蛋白之間的靜電排斥作用小,有利于泡沫的穩(wěn)定。這與彭新顏在乳清蛋白的功能性質(zhì)研究中的結(jié)果一致[20]。

圖7 不同pH下乳清蛋白各水解度下起泡穩(wěn)定性曲線Fig.7 Rice bran protein foam stability curve under differentdegree of hydrolysis and pH

在極端pH下乳清蛋白的泡沫穩(wěn)定性下降程度大,在此條件下,隨著水解程度的增大,起泡穩(wěn)定性變差,這是因?yàn)榻?jīng)過堿性蛋白酶的作用后,產(chǎn)生的可溶的小分子蛋白在極端pH下所形成的界面膜的穩(wěn)定能力弱,穩(wěn)定泡沫的能力大幅度下降。

通過對(duì)不同DH下乳清蛋白起泡穩(wěn)定性曲線圖8可知,乳清蛋白經(jīng)過堿性蛋白酶作用后起泡穩(wěn)定性有了提高,在DH4下達(dá)到最大值。

圖8 不同DH下乳清蛋白起泡穩(wěn)定性曲線Fig.8 Whey protein foam stability curve under different degree of hydrolysis

乳清蛋白的起泡穩(wěn)定性隨著水解程度的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),DH0～DH4之間,起泡穩(wěn)定性在各個(gè)pH條件下均提高;DH6～DH14之間,起泡穩(wěn)定性開始下降;這是因?yàn)樗舛鹊脑龃?產(chǎn)生的小分子由于受pH的影響,特性發(fā)生變化,穩(wěn)定泡沫的能力降低所致。綜上所述,在DH4、pH4下乳清蛋白的起泡穩(wěn)定性達(dá)到最大值為84.21%。

2.5 乳清蛋白乳化性測(cè)定

通過對(duì)不同pH下乳清蛋白乳化性曲線圖9可知,乳清蛋白經(jīng)過堿性蛋白酶作用后乳化活性在pH≥4下隨著pH增加乳化活性增高,pH<4下,偏離等電點(diǎn)處,乳化活性提高,等電點(diǎn)處乳清蛋白在分析水解度的范圍內(nèi)乳化活性最低;這是因?yàn)橐环矫嬗捎谌芙庑栽诘鞍踪|(zhì)的乳化活性方面起著重要作用,隨著溶解性的增加其乳化能力也在增強(qiáng),但這不是絕對(duì)增加的;另一方面,乳清蛋白在酶水解后產(chǎn)生的小分子蛋白隨著pH的增加其分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,部分包埋在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來,促進(jìn)了蛋白分子親水疏水性質(zhì)的平衡,因此提高了乳化活性。

圖9 不同pH下乳清蛋白各水解度下乳化活性曲線Fig.9 Whey protein emulsifying activity curve under different degree of hydrolysis and pH

通過對(duì)不同DH下乳清蛋白乳化穩(wěn)定性曲線圖10可知,乳清蛋白經(jīng)過堿性蛋白酶限制作用下乳化活性不斷提高;這是因?yàn)殡S著水解程度的增大,乳清蛋白質(zhì)分子表面的疏水基團(tuán)及分子大小發(fā)生變化,疏水基團(tuán)逐漸暴露,有利于和油滴的結(jié)合,從而提高了乳清蛋白的乳化能力。在DH14,pH12時(shí)乳清蛋白的乳化活性達(dá)到最大值0.487,比原料蛋白在此pH下的乳化活性提高了56.1%。

圖10 不同DH下乳清蛋白乳化活性曲線Fig.10 Whey protein emulsifying activity curve under different degree of hydrolysis

2.6 乳清蛋白乳化穩(wěn)定性測(cè)定

通過對(duì)不同pH下乳清蛋白各水解度下乳化穩(wěn)定性曲線圖11可知,乳清蛋白經(jīng)過堿性蛋白酶作用在pH≥4時(shí)乳化穩(wěn)定性不斷提高,pH<4偏離乳清蛋白等電點(diǎn)時(shí)乳化穩(wěn)定性增高;這說明了乳清蛋白的溶解性和乳化穩(wěn)定性具有一定關(guān)系,堿性條件下,乳清蛋白的溶解性增加致使更多的蛋白分子在界面上結(jié)合油滴,形成更為穩(wěn)定的油水兩相蛋白質(zhì)層,從未增加乳清蛋白的乳化穩(wěn)定性。

圖11 不同pH下乳清蛋白各水解度下乳化穩(wěn)定性曲線Fig.11 Whey protein emulsion stability curve under different degree of hydrolysis and pH

通過對(duì)不同DH下乳清蛋白乳化穩(wěn)定性曲線圖12可知,乳清蛋白經(jīng)過堿性蛋白酶作用后乳化穩(wěn)定性有了提高,隨著水解程度的進(jìn)行,乳化穩(wěn)定性下降。當(dāng)在酸性條件下(pH<7)時(shí),乳清蛋白的乳化穩(wěn)定性先增加后降低,在DH6下達(dá)到最高;在堿性條件下(pH>7)時(shí),乳清蛋白的乳化穩(wěn)定性先增加后降低,在DH4下達(dá)到最高;隨著水解進(jìn)程的加大,乳化穩(wěn)定性開始下降,且隨著水解進(jìn)程的加大下將程度加大。在DH4、pH12時(shí)，乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值66.89%。以上現(xiàn)象是因?yàn)槿榍宓鞍自趬A性蛋白酶作用下分子的體積降低,導(dǎo)致離子化基團(tuán)的數(shù)量增加同時(shí)使基團(tuán)分布變廣,在水解度較小時(shí),隨著水解度的增加乳清蛋白質(zhì)中疏水基團(tuán)外露,液珠中蛋白分子與油滴的吸引作用增強(qiáng),從而使乳清蛋白乳狀液的穩(wěn)定性增加;但隨著水解進(jìn)程的增大,乳清蛋白分子中疏水區(qū)域的結(jié)構(gòu)遭到破壞,乳清蛋白小分子中疏水區(qū)域比例相對(duì)減小,形成的乳狀液穩(wěn)定性降低。

圖12 不同DH下乳清蛋白乳化穩(wěn)定性曲線Fig.12 Whey protein emulsion stability curve under different degree of hydrolysis

3 結(jié)論

乳清蛋白經(jīng)過限制性酶解后溶解性較好,在DH14、pH10下達(dá)到最大值96.42%;起泡性在DH14,pH4下達(dá)到最大值83 mL,起泡穩(wěn)定性在DH4、pH4下達(dá)到最大值84.21%;乳化活性在DH14、pH12下達(dá)到最大值0.487,乳化穩(wěn)定性在DH4、pH12下達(dá)到最大值66.89%;乳清蛋白經(jīng)過限制性酶解后功能性質(zhì)較原蛋白均有很大提高。經(jīng)過限制性酶解后的酶解物具有很高的泡沫膨脹性能,并對(duì)剪切變性有一定的耐受性。起泡性對(duì)于生產(chǎn)冷凍食品、蛋糕、餅干及奶糖等均有重要意義。酶解物乳化性能比原蛋白更易在在脂肪球和水滴之間形成一層界面膜從而防止乳狀液分層及凝聚沉淀,因此其更易應(yīng)用于人造黃油、海鮮食品、冰淇淋及蛋糕中。

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Study on limited enzymatic hydrolysis of whey protein and functional properties

LIU Ying,LIU Li-zhai,YU Xiao-hong,FU Wei,ZHANG Dan,DOU Bo-xin

(College of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

Explored the whey protein functional properties change under alkaline protease restrictive hydrolysis. Using whey protein solubility,emulsification and emulsion stability,foaming and foaming stability as indicators and determined the whey protein isoelectric point and analyzed different degree of hydrolysis of whey protein different functional properties under the pH. The results showed that whey protein isoelectric point was 4.8. Whey protein functional properties had greatly improved under limited enzymatic hydrolysis. Hydrolysis reached the maximum under DH14,pH10,higher than native protein 14.55%,foaming reached the maximum higher than native protein 107.5% under DH14,pH4,foaming stability reached the maximum under DH4,pH4 higher than native protein 8.66%;emulsifying reached the maximum under DH14,pH12 higher than native protein 56.1%,emulsion stability reached the maximum under DH4,pH12 higher than native protein 50.42%.

whey protein;limited enzymatic hydrolysis;functional properties

2016-07-20

劉穎(1968-),女,博士，教授,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:18846169360@163.com。

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(GC13C112)。

TS252.1

A

:1002-0306(2017)04-0127-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.016