袁 錦,周 煌,佟 平,吳志華,4,陳紅兵,4,高金燕

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330047;3.吉安職業(yè)技術(shù)學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)林工程學(xué)院,江西吉安 343000;4.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047)

雞蛋過敏原卵轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的研究

袁 錦1,2,周 煌3,佟 平1,吳志華1,4,陳紅兵1,4,高金燕2，*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330047;3.吉安職業(yè)技術(shù)學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)林工程學(xué)院,江西吉安 343000;4.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047)

目的:制備高純度的雞蛋過敏原卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,并詳細(xì)表征其理化性質(zhì)及免疫學(xué)性質(zhì),滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的質(zhì)量要求。方法:通過兩步柱層析法制備卵轉(zhuǎn)鐵蛋白并分裝、凍干,然后借助質(zhì)譜鑒定身份;采用SDS-PAGE銀染方法鑒定純度,圓二色光譜、熒光光譜和核磁共振表征高級(jí)結(jié)構(gòu);利用Bradford法檢測(cè)含量和SDS-PAGE銀染方法評(píng)估穩(wěn)定性,間接ELISA方法評(píng)估其與IgE結(jié)合能力。結(jié)果:制備的蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定為雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,分子量約79.55 ku,等電點(diǎn)為6.85,純度高達(dá)94.6%;結(jié)構(gòu)分析顯示,制備的卵鐵蛋白保留了其天然結(jié)構(gòu)特性,并且凍干未使卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的變化;在4 ℃條件下儲(chǔ)藏5個(gè)月,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量、純度、結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)活性均無明顯變化。結(jié)論:制備的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白可作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物。

雞蛋過敏原,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物

食物過敏是目前公認(rèn)的人類健康問題之一,發(fā)生率在幼兒中約占8%,在成人中約占3%～4%,且近年來逐漸增高[1]。牛奶、雞蛋、花生、堅(jiān)果、魚、甲殼類水產(chǎn)動(dòng)物、小麥和大豆是公認(rèn)的八大過敏食物[2]。其中,雞蛋可為人體提供優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì),氨基酸比例適合人體生理需要,易被吸收,但同時(shí)也是僅次于牛奶的第二大過敏食物[3],其主要的過敏原蛋白包括卵白蛋白、卵類粘蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶、卵黃糖蛋白42和α-卵黃蛋白[4]。據(jù)報(bào)道,約有1%～2%的嬰兒和1.6%～3.2%的兒童對(duì)雞蛋過敏[5],嚴(yán)重影響了他們的健康。為了減少雞蛋過敏的危害,需要進(jìn)行食品中雞蛋過敏原蛋白的精準(zhǔn)檢測(cè)以及雞蛋過敏的正確診斷,而檢測(cè)和診斷離不開過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的參比作用。Brand[6]等已經(jīng)開展了雞蛋過敏原卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(ovotransferrin,OVT)的分離和純化研究工作,市場(chǎng)上也有一些昂貴的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白試劑,但尚不能滿足精準(zhǔn)檢測(cè)和診斷需求,無法保證食物蛋白過敏原測(cè)量的溯源性、有效性、可比性以及國(guó)際等效性。迄今為止,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究仍是空白,值得探索。因此,本研究以蛋清為原料,通過離子交換和羥基磷灰石柱層析兩步法制備卵轉(zhuǎn)鐵蛋白并分裝、凍干,然后進(jìn)行蛋白身份和純度鑒定,并借助一系列理化和免疫學(xué)方法評(píng)價(jià)其質(zhì)量性能,為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供關(guān)鍵技術(shù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柱材CM Sepharose Fast Flow和Bio-Gel HT Fully Hydrated Hydroxyapatite GE公司(美國(guó));牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)國(guó)家計(jì)量院(NIM);過硫酸銨(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)和α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì) Sigma公司(美國(guó));40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺儲(chǔ)液 伯樂公司(美國(guó));乙腈和三氟乙酸 默克公司(德國(guó));其他化學(xué)試劑 均為分析純;雞蛋 從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買。

Milli-Q純水儀 美國(guó)Millipore公司;蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、Mode 1860酶標(biāo)儀 美國(guó)伯樂公司;N2000色譜工作站STS 浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司;高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)貝克曼公司;PB-10酸度計(jì) 德國(guó)Sartorius公司;ABI 4800 MALDI TOF/TOF串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 美國(guó)Applied Biosystems;MOS-450/AF-CD圓二色光譜 法國(guó)Bio-Logic公司;核磁共振儀 德國(guó)Bruker Avance。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的制備

1.2.1.1 CM Sepharose Fast Flow柱層析分離卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 新鮮雞蛋取蛋清,用玻璃棒輕輕攪拌,使蛋清中膠狀物溶解,于4 ℃層析柜中低速磁力攪拌30 min。用50 mmol/L、pH4.7的醋酸鈉緩沖液將蛋清pH調(diào)至6.0,再4 ℃層析柜中磁力攪拌3.5 h,8000×g離心30 min,取上清液分裝,于-20 ℃保存。參照袁角建[7]分離純化卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法,采用CM Sepharose Fast Flow陽離子柱對(duì)前處理蛋清中的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行初步分離,所選柱子的規(guī)格為3.5 cm×50 cm。經(jīng)活化、脫氣等步驟處理后,將柱材裝入柱子中,用蒸餾水以7 mL/min的流速壓柱,用陽離子柱平衡液以5 mL/min的流速平衡陽離子柱,基線平穩(wěn)后,取63 mL處理過的蛋清上樣,用700 mL陽離子柱平衡液加上700 mL陽離子柱梯洗液進(jìn)行線性梯度洗脫。

1.2.1.2 羥基磷灰石柱層析分離 同樣參照袁角建[7]的實(shí)驗(yàn)方法,采用450 mL羥基磷灰石柱(Bio-Gel HT Fully Hydrated Hydroxyapatite)對(duì)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白作進(jìn)一步純化。具體步驟如下:用蒸餾水以4 mL/min的流速壓柱,羥基磷灰石柱平衡液以3 mL/min的流速平衡,平衡后上樣PEG20000濃縮的粗提物卵轉(zhuǎn)鐵蛋白16 mL,分別用450 mL羥基柱梯度洗液1(pH7.0,80 mmol/L的磷酸緩沖液)和450 mL的羥基柱梯度洗液2(pH7.0,300 mmol/L的磷酸緩沖液)進(jìn)行線性梯度洗脫,收集目標(biāo)產(chǎn)物。

1.2.1.3 蛋白的真空冷凍干燥 將收集到的純卵轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液,按860 μL/瓶均勻分裝到3 mL凍干瓶中,并于-80 ℃冰箱中冷凍30 h。采用VIRTIS真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干,-70 ℃下抽真空,凍干約23.5 h后,將凍干機(jī)加熱溫度調(diào)為30 ℃;30 min后停止凍干,取出用鋁蓋封口、貼標(biāo),保存在4 ℃冰箱中。

1.2.2 蛋白質(zhì)身份鑒定 制備的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解后真空凍干,用1.5 μL質(zhì)譜上樣緩沖液(30%乙腈,0.1%三氟乙酸)溶解,取0.8 μL點(diǎn)在384孔不銹鋼點(diǎn)樣板上,加0.4 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液(5 mg/mL),自然風(fēng)干、結(jié)晶后采用ABI 4800 MALDI/TOF串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。獲得的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用GPS Explore(V3.6,Applied Biosystems)軟件進(jìn)行分析,并通過內(nèi)置的MASCOT(V2.1,Matrix Science,London,U.K)搜庫軟件對(duì)本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索、鑒定蛋白質(zhì)。

1.2.3 純度鑒定 用不連續(xù)的SDS-PAGE電泳檢測(cè)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,上樣量為0.125 μg/孔(4%的濃縮膠和12%的分離膠),待電泳跑完后,剝膠進(jìn)行銀染,對(duì)所制備卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的純度進(jìn)行鑒定。

1.2.4 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)表征

1.2.4.1 二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè) 采用MOS-450/AF-CD圓二色光譜儀表征卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度稀釋至0.1 mg/mL(500 μL),以蒸餾水做空白。設(shè)定遠(yuǎn)紫外掃描波長(zhǎng)范圍為190～240 nm,光徑為0.1 cm,帶寬為1 nm,光譜間隔0.1 nm,掃描速度為0.05～20 nm/s,每個(gè)樣品分別做三次平行,取其平均值。所得數(shù)據(jù)用CD在線軟件http://dichroweb. cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml進(jìn)行分析。

1.2.4.2 表面疏水性檢測(cè) 將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白樣品稀釋至0.1 mg/mL,取6 mL蛋白,加入60 μL的ANS(5 μmol/L),混勻后避光反應(yīng)2 h。用日立F-4500熒光分光光度計(jì),激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為400～600 nm,掃描速度為1200 nm/min,測(cè)定卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的熒光值,分析卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的表面疏水性。

1.2.4.3 三級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè) 取450 μL,10.13 mg/mL的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和50 μL D2O于核磁管中,使卵轉(zhuǎn)鐵蛋白最終濃度為0.12 mmol/L。通過Bruker Avance 600 MHz核磁共振波譜儀,分析卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的核磁圖譜。測(cè)定中脈沖序列為zgpr,磁體為14.09 Tesla,掃描次數(shù)為1228,溫度控制為25 ℃。

1.2.5 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白穩(wěn)定性檢驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性是指在規(guī)定的貯存條件下,在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi),使其描述的特性值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力[8]。

1.2.5.1 含量、純度及其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性檢測(cè) 將凍干后的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白置于4 ℃、避光及干燥條件下保存。隨機(jī)抽取3瓶樣品,在放置第0至5個(gè)月后,分別采用Bradford法和SDS-PAGE銀染的方法測(cè)定含量和純度。

1.2.5.2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的免疫活性檢測(cè) 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的免疫學(xué)活性采用人血清間接ELISA對(duì)凍干前后卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的IgE結(jié)合能力和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè),雞蛋過敏患者的血清池由18位對(duì)雞蛋過敏的患者的血清混合而成,這18位雞蛋過敏患者的信息如表1。所選患者的血清具備如下特點(diǎn):對(duì)雞蛋過敏呈陽性,且總IgE水平基本都在100 IU/mL左右。

表1 雞蛋過敏患者信息Table 1 Information of egg allergic patients

注:ND*:未檢測(cè)。

間接ELISA具體步驟如下:將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白稀釋至1.5 μg/mL,在一塊酶標(biāo)板上包被100 μL,用PBS(磷酸鹽緩沖液)作陰性對(duì)照。4 ℃過夜后,用PBST(磷酸緩沖溶液溶液加上Tween-20)洗板3次,每次5 min;每孔加入250 μL 5%的脫脂乳,37 ℃封阻1 h,然后用PBST洗板3次;每孔加入100 μL 1∶20稀釋度的人血清池,37 ℃反應(yīng)1 h,PBST洗板3次;每孔加入1∶5000稀釋的生物素標(biāo)記羊抗人IgE二抗100 μL,37 ℃反應(yīng)1 h,PBST洗板3次;每孔加入100 μL 1∶60稀釋的HRP-鏈霉素標(biāo)記的親和素,37 ℃反應(yīng),PBST洗板3次;每孔加入100 μL現(xiàn)配的OPD顯色液后,置37 ℃恒溫箱中避光反應(yīng)15 min,反應(yīng)結(jié)束后,每孔加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),于490 nm處檢測(cè)其OD值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析,采用p<0.05為顯著性差異;應(yīng)用Origin9.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的身份鑒定和純度分析

制備的蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定分析后,結(jié)果如表2所示。通過本地?cái)?shù)據(jù)庫MASCOT檢索,所鑒定蛋白質(zhì)與數(shù)據(jù)庫中編號(hào)為sp|P02789的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白匹配度達(dá)100%。因此,可以確定制備的蛋白質(zhì)為雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,分子量約79.55 ku,等電點(diǎn)為6.85。

本文首先采用SDS-PAGE考染方法鑒定卵轉(zhuǎn)鐵蛋白純度,結(jié)果顯示為100%。但是,世界衛(wèi)生組織和國(guó)際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)過敏原物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化小組建立的過敏原物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目(Development of certified reference materials for allergenic products and validation of methods for their quantification,CREATE)推薦使用SDS-PAGE銀染方法鑒定過敏原純度[9],因?yàn)殂y染的靈敏性是考染的50～100倍[10]。因此,所制備卵轉(zhuǎn)鐵蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后,經(jīng)銀染方法顯色,結(jié)果如圖1所示,Quantity One灰度掃描顯示卵轉(zhuǎn)鐵蛋白純度為94.6%。

圖1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的SDS-PAGE銀染圖Fig.1 SDS-PAGE profile of the prepared ovotransferrin by silver staining

2.2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)表征及冷凍干燥對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響

為進(jìn)一步鑒定所制備的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白是否保持其天然結(jié)構(gòu),同樣參考CREATE項(xiàng)目[9]中推薦的方法,采用圓二色光譜、熒光探針光譜和核磁共振圖譜對(duì)制備卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面疏水性和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,與文獻(xiàn)中報(bào)道的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。同時(shí)在制備過程中,為了保持蛋白質(zhì)原有的生物性狀和活性,采用真空冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥[11-12]。

表2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的質(zhì)譜鑒定報(bào)告Table 2 The identity of ovotransferrin tested by Mass Spectrometry

2.2.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu) 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)圓二色光譜檢測(cè),結(jié)果見圖2。從圖2中可知,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白在195 nm和215 nm附近出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征峰,平均摩爾橢圓率最高在8000 deg·cm2/dmol左右,最低在-7000 deg·cm2/dmol左右,這與袁角建[7]和Jacobsen[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。凍干前后的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白在195 nm附近都有一個(gè)明顯的正峰,為β-折疊的特征峰;在215 nm附近也都有一個(gè)明顯的負(fù)峰,為α-螺旋的特征峰,CD曲線的趨勢(shì)基本一致。將所得的圓二色光譜數(shù)據(jù)通過在線軟件進(jìn)行分析,得到凍干前后卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量(圖2B)。圖2B中顯示,凍干前后卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲)含量基本一致。因此,制備的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白凍干前后未發(fā)生明顯的變化,保持了天然二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 The secondary structure of ovotransferrin

2.2.2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白表面疏水性 ANS熒光探針實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,曲線的趨勢(shì)也與袁角建[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。而卵轉(zhuǎn)鐵蛋白凍干前后的熒光曲線比較,在500 nm左右的熒光強(qiáng)度都達(dá)到最大,在550～600 nm處兩條曲線出現(xiàn)重疊,但在400～550 nm處,凍干卵轉(zhuǎn)鐵蛋白比未凍干卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的熒光值略大,且熒光值在500 nm處達(dá)最大,表明真空冷凍干燥可能會(huì)引起卵轉(zhuǎn)鐵蛋白部分去折疊,導(dǎo)致分子內(nèi)部更多的疏水基團(tuán)暴露出來,從而提高蛋白表面疏水性。

圖3 凍干前后卵轉(zhuǎn)鐵蛋白表面疏水性的變化Fig.3 The surface hydrophobicity of ovotransferrin before and after lyophilization

2.2.3 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu) 抗原抗體特異性結(jié)合是二者空間結(jié)構(gòu)契合、分子間力相互作用的結(jié)果,三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是卵轉(zhuǎn)鐵蛋白過敏原蛋白維持穩(wěn)定免疫活性的基礎(chǔ)。卵轉(zhuǎn)鐵蛋白凍干前后的Bruker Avance 600 MHz1H核磁共振結(jié)果如圖4所示,與Jacobsen[13]的Bruker Avance 700 MHz1H結(jié)果相符,說明所制備卵轉(zhuǎn)鐵蛋白保持其天然三級(jí)結(jié)構(gòu)。從圖4中可以發(fā)現(xiàn),凍干后卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的化學(xué)位移都分布在0～7 ppm處,其中4.8 ppm處都為D2O的化學(xué)位移,證明其三級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯的變化。

圖4 凍干前后卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的1H核磁共振結(jié)果Fig.4 1H NMR spectra of the ovotransferrinbefore(a)and after(b)lyophilization

2.3 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是指在規(guī)定貯存和使用條件下,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量、純度等特性量值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力[8]。本研究參考Itoh[14]和Johnston[15]相類似方法測(cè)試卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性,研究結(jié)果可為用戶提供參考數(shù)據(jù)。不同蛋白質(zhì)具有不同的穩(wěn)定性,在儲(chǔ)藏過程中如果儲(chǔ)藏不當(dāng)或者儲(chǔ)存時(shí)間過久很容易發(fā)生降解,其含量和純度都可能會(huì)發(fā)生變化。本研究將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白凍干后置于4 ℃儲(chǔ)藏,連續(xù)監(jiān)測(cè)5個(gè)月內(nèi)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量和純度(圖5和圖6)。從圖5可以看出卵轉(zhuǎn)鐵蛋白4 ℃儲(chǔ)藏5個(gè)月內(nèi)含量無顯著變化,圖6中采用高靈敏的銀染方法也顯示沒有降解片段。因此,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白在4 ℃儲(chǔ)藏5個(gè)月內(nèi)含量、純度未發(fā)生變化,穩(wěn)定性好,滿足作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的穩(wěn)定性要求。

圖5 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白儲(chǔ)藏過程中含量測(cè)定結(jié)果Fig.5 The content of the prepared ovotransferrin during the storage

圖6 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白儲(chǔ)藏過程中銀染純度鑒定結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE silver stainingfor purity of ovotransferrin during the storage

2.4 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白與特異性IgE的結(jié)合能力

除了質(zhì)量、純度的穩(wěn)定性,合格的過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物還應(yīng)進(jìn)行免疫學(xué)性質(zhì)的測(cè)定和免疫活性穩(wěn)定性的測(cè)定[16-17]。過敏患者血清IgE結(jié)合能力的檢測(cè)是評(píng)價(jià)過敏原免疫活性的有效手段[18],本研究采用間接ELISA測(cè)定卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的IgE人血清結(jié)合能力(圖7)。圖7中每個(gè)月的數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測(cè)定所得的平均值,所得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性差異分析,結(jié)果顯示儲(chǔ)藏過程中每個(gè)月卵轉(zhuǎn)鐵蛋白IgE結(jié)合能力與未凍干相比都無顯著性差異(p>0.05)。證明制備的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白免疫活性穩(wěn)定,可以滿足過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的要求。

圖7 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白儲(chǔ)藏過程中IgE結(jié)合能力的變化 Fig.7 IgE binding ability of ovotransferrin during storage

3 結(jié)論

本研究通過兩步法制備了較高純度的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,并對(duì)其身份、純度、結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)性質(zhì)及其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性進(jìn)行了詳細(xì)表征,結(jié)果表明:制備的蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定為雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,分子量約79.55 ku,等電點(diǎn)為6.85,純度可達(dá)94.6%;結(jié)構(gòu)分析顯示,分離純化的卵鐵蛋白保留了其天然結(jié)構(gòu)特性,并且在分裝和凍干過程中,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生明顯的變化;在4 ℃條件下儲(chǔ)藏5個(gè)月,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量、純度和免疫學(xué)活性均無明顯變化。制備的雞蛋過敏原卵轉(zhuǎn)鐵蛋白凍干產(chǎn)品符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的要求,可為最終申報(bào)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支撐。

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Study on hen egg allergen ovotransferrinas a reference material candidate

YUAN Jin1,2,ZHOU Huang3,TONG Ping1,WU Zhi-hua1,4,CHEN Hong-bing1,4,GAO Jin-yan2,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Department of Food Science,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.Jian Vocational and Technical College of Modern Agriculture and Forestry,Ji’an 343000,China;4.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Objective:To guarantee ovotransferrin(OVT)quality as a food allergen reference material candidate,ovotransferrin was prepared with high purity,and the physicochemical and immunological properties were characterized well. Methods:Ovotransferrin was prepared through two step chromatographies,followed by being subdivided and lyophilized. Afterwards,the prepared ovotransferrin was identified by MALDI TOF/TOF,and the purity was tested by SDS-PAGE with silver staining,followed by measuring the structure by circular dichroism spectroscopy,fluorescence spectroscopy and1H NMR. The content and stability were detected by Bradford protein assay and SDS-PAGE with silver staining. The potential allergenicity of ovotransferrin was assessed by ELISA. Results:The prepared protein was identified to be egg ovotransferrin by MALDI TOF/TOF,with a molecular weight of 79.55 ku and a pI of 6.85. The purity of ovotransferrin was 94.6%. The prepared ovotransferrin maintained its natural structure,and the lyophilization had no significantly effect on ovotransferrin structure. The stability,quality and IgE-binding capacity showed no significant difference within 5 months storage period at 4 ℃. Conclusion:The prepared egg allergen ovotransferrin could be qualified as a reference material candidate.

egg allergen;ovotransferrin;reference material candidate

2016-09-02

袁錦(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生，E-mail：yuan2jin@126.com。

*通訊作者:高金燕(1967-)，女，碩士，教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全，E-mail：chbgjy@hotmail.com。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2013AA102205)；科技部國(guó)際科技合作項(xiàng)目(2013DFG31380)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31301524)；江西省自然科學(xué)基金計(jì)劃(20133ACB20009，20142BAB214001)；食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(SKLF-ZZA-201612,SKLF-QN-201514)。

TS253.4

A

:1002-0306(2017)04-0342-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.056