欒學斌,王荻,劉紅柏

(1.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院,江蘇無錫214081;2.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070)

恩諾沙星誘導施氏鱘藥物性肝損傷模型的建立及復方中草藥保肝作用研究

欒學斌1、2,王荻2,劉紅柏1、2

(1.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院,江蘇無錫214081;2.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070)

為探究復方中草藥對施氏鱘Acipenser schrenckii藥物性肝損傷的保護作用,通過建立恩諾沙星肝損傷模型,在水溫 (15.5±1)℃下對3組自組中草藥復方的保肝作用進行了篩選比較研究,試驗設5組,對空白對照組及模型對照組1+齡施氏鱘以每天2%體質量投喂基礎飼料,對3組復方中草藥組施氏鱘投喂相應中草藥藥餌,試驗進行至第11天時,復方中草藥組及模型對照組分別口灌160 mg/kg(體質量)恩諾沙星,連續(xù)10 d,空白對照組以等量雙蒸水代替,口灌期間各組仍按原方式繼續(xù)投喂 (基礎飼料或藥餌),試驗結束后,測定各組血清中與肝損傷相關的活性物質含量及酶活性,并觀察肝組織病理變化情況。結果表明:與空白對照組相比,模型對照組供試鱘血清中T-AOC能力顯著下降 (P＜0.05),T-SOD活力極顯著下降 (P＜0.01),ALT、AST活力和MDA含量極顯著上升 (P＜0.01),肝組織切片顯示,器質性病變明顯,肝損傷建模成功;3組復方中草藥均可升高供試鱘血清中T-SOD活力、T-AOC能力,降低MDA含量和AST、ALT活力;供試鱘血清生化指標同其肝組織病理變化趨勢相吻合。研究表明,3組復方中草藥均能有效減輕恩諾沙星致施氏鱘肝細胞損傷,并對肝細胞恢復起到積極作用,尤其復方三中草藥效果明顯。

施氏鱘;中草藥;肝損傷;恩諾沙星

施氏鱘Acipenser schrenckii隸屬于鱘科Acipenseridae、鱘屬 Acipenser,主要分布于中國黑龍江流域[1-2],憑借其生長速度快、抗病力強、經(jīng)濟價值高等優(yōu)勢,已成為中國備受歡迎的養(yǎng)殖魚品種[3-4]。然而,病害頻發(fā)及養(yǎng)殖業(yè)者科學用藥知識匱乏,導致生產(chǎn)實踐中抗菌藥物的盲目使用。恩諾沙星作為廣譜抗菌、滲透性強的第三代喹諾酮類代表藥物,在水生動物養(yǎng)殖過程中的應用極其廣泛[5-6]。趙蕾等[6]、郭嬌嬌等[7]研究表明,恩諾沙星的不當使用可導致銀鯽 Carassius auratus gibelio、鱘等魚類肝損傷。肝臟是魚體內(nèi)最大的實質性器官,參與魚體分泌、消化、解毒和免疫等多種生命活動[8]。魚類經(jīng)胃腸吸收的物質幾乎全部進入肝臟,并于其內(nèi)部進行分解、轉化、合成和貯存,大幅度提高了肝臟受有毒物質感染及損傷的機率[9-10]。

中草藥用于防治哺乳類動物肝臟疾病的歷史悠久[11],而應用于水產(chǎn)動物方面的研究則起步較晚,目前仍處于摸索階段。研究表明,部分中草藥及其提取物對水產(chǎn)動物的肝臟具有保護作用。有報道指出,當歸Angelica sinensis[11]、枸杞Lycium chinense[12]、大黃Rheum officinale Baill[13]等中草藥提取物及部分中草藥復方[14]對建鯉Cyprinus carpio var. Jian、團頭魴Megalobrama amblycephala Yih等水產(chǎn)動物的肝臟也具有較好的保護作用。但施氏鱘藥物性肝損傷及適用于施氏鱘肝損傷修復的中草藥組方的篩選研究仍未見報道。

本試驗中,首先摸索出恩諾沙星誘導供試鱘肝損傷的最適用藥時間及劑量,然后對供試鱘連續(xù)投喂拌飼中草藥藥餌,再加以口灌恩諾沙星,通過測定供試鱘血清中肝損傷相關的活性物質含量及酶活性,以及觀察鱘肝組織病理變化情況,評價復方中草藥對施氏鱘藥物性肝損傷的保護作用,旨在為施氏鱘提供保肝中草藥組方以及為中草藥方劑在施氏鱘養(yǎng)殖中的科學應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗供試鱘購自中國水產(chǎn)科學研究院鱘魚繁育技術工程中心,為1+齡非免疫施氏鱘,體質量為(100±2)g,飼養(yǎng)于室內(nèi)圓形水泥池 (半徑為1 m)中,以充分曝氣的地下水為水源,水溫為(15.5±1)℃。

試驗用中藥飲片購自哈爾濱寶豐藥店;鹽酸恩諾沙星購自浙江國邦藥業(yè)有限公司,批準文號浙獸藥字 (2003)X087212;總超氧化物歧化酶 (TSOD)、總抗氧化能力 (T-AOC)、丙二醛(MDA)、谷草轉氨酶 (AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、總蛋白 (TP)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;伊紅、蘇木精染色液購自珠海貝索生物技術有限公司;無水乙醇 (分析純)、二甲苯(分析純)購自天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 恩諾沙星藥液的制備 準確稱取鹽酸恩諾沙星,參照李紹戊等[15]的方法配制成50 g/L恩諾沙星藥液,避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 中草藥藥餌的制備 中草藥組方及每千克供試鱘給藥量如表1所示。按配比稱取3組復方中草藥,參照李超等[16]的方法制得水煎劑,待其常溫冷卻后,按比例加入到基礎飼料中攪拌均勻,置陰涼通風處晾干,制得藥餌。

表1 中草藥組方及給藥量Tab.1 Ingredient and dose of the Chinese herbal medicines uesd in the experiment

1.2.3 藥物性肝損傷模型的構建 參照趙蕾等[6]的方法,取部分供試鱘隨機分為4組,每組30尾鱘。試驗組分別按40、80、160 mg/kg(體質量,下同)劑量口灌恩諾沙星,連續(xù)10 d,對照組口灌等體積雙蒸水 (0 mg/kg)。于試驗開始后第5、7、10天,按照孫裔雷等[17]的方法取供試鱘血清及肝組織,測定血清中ALT、AST活力及TP含量,同時參照白潔[18]的方法,制作肝組織病理切片并進行H.E染色。

1.2.4 復方中草藥保肝試驗 將供試鱘隨機分為空白對照組、模型對照組和3組復方中草藥組(復方一、復方二、復方三),每組30尾鱘。停飼24 h后,空白對照組及模型對照組按每天2%體質量投喂基礎飼料,3組復方中草藥組投喂相應藥餌,連續(xù)投喂20 d。期間于第11天,按預試驗建模所得的最適損傷劑量對復方中草藥組及模型對照組連續(xù)口灌恩諾沙星10 d(空白對照組以等量雙蒸水代替)。試驗結束后,分別從各組隨機取供試鱘5尾,按照試劑盒說明書步驟,測定其血清中ALT、AST、T-SOD活力、TP、MDA含量和 TAOC能力,制作肝組織病理切片并進行H.E染色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。采用SPSS 21軟件進行單因素方差分析 (One-Way ANOVA)。

2 結果與分析

2.1 恩諾沙星藥物性肝損傷模型的建立

2.1.1 恩諾沙星對施氏鱘血清中ALT、AST活力及TP含量的影響 從圖1可見:與對照組 (0 mg/kg)相比,以160 mg/kg劑量連續(xù)口灌恩諾沙星7～10 d可導致鱘血清ALT、AST活力極顯著升高 (P＜0.01),連續(xù)口灌10 d后可導致TP含量極顯著降低 (P＜0.01);以80 mg/kg劑量連續(xù)口灌5 d可導致鱘血清TP含量顯著降低 (P＜0.05),連續(xù)口灌10 d后可導致 ALT、AST活力顯著升高(P＜0.05)、TP含量極顯著降低 (P＜0.01);以40 mg/kg劑量連續(xù)口灌10 d可導致鱘血清ALT活力極顯著升高 (P＜0.01)、AST活力顯著升高 (P＜0.05)。

圖1 恩諾沙星對施氏鱘血清中ALT、AST活力和TP含量的影響Fig.1 Effect of enrofloxacin on the activities of serum ALT and AST and total protein(TP)content in Amur sturgeon Acipenser schrenckii

2.1.2 恩諾沙星對施氏鱘肝組織病理變化的影響

圖2為連續(xù)口灌恩諾沙星10 d各組供試鱘肝臟組織病理切片。從圖2可見:0 mg/kg對照組肝細胞具有完整的肝索,肝細胞排列緊密,核近圓形,胞質飽滿,組織致密 (圖2-B);80 mg/kg組雖偶有血細胞浸潤,但數(shù)量少、程度輕,與0 mg/kg對照組差異不明顯 (圖2-E);160 mg/kg組肝細胞結構稀疏,肝細胞索結構紊亂,同時伴有炎性細胞浸潤及細胞核固縮 (圖2-H),與0 mg/kg對照組差異明顯。

圖2 劑量篩選試驗中鱘肝臟組織結構觀察Fig.2 Histological observation of the liver of Amur sturgeon Acipenser schrenckiiin the dose sereening experiment

綜上所述,模型對照組按160 mg/kg劑量連續(xù)口灌恩諾沙星10 d,供試鱘血清中ALT、AST活力上升及TP含量降低,且其肝組織出現(xiàn)顯著器質性損傷,恩諾沙星致施氏鱘肝損傷模型建立成功。

2.2 復方中草藥預防肝損傷

2.2.1 復方中草藥對施氏鱘血清中T-SOD活力、T-AOC能力和MDA含量的影響 從圖3可見:與空白對照組相比,模型對照組以160 mg/kg劑量口灌恩諾沙星10 d,可導致T-SOD活力極顯著降低(P＜0.01)、T-AOC能力顯著降低 (P＜0.05)、MDA含量極顯著升高 (P＜0.01);與模型對照組相比,3組復方中草藥均可導致T-SOD活力、TAOC能力不同程度的升高,且均對T-SOD活力影響極顯著 (P＜0.01),復方二、復方三對T-AOC能力影響極顯著 (P＜0.01),3組復方中草藥均可導致MDA含量顯著或極顯著降低 (P＜0.05或P＜0.01)。

圖3 復方中草藥對恩諾沙星致肝損傷的施氏鱘血清中T-SOD、T-AOC和MDA含量的影響Fig.3 Effect of Chinese herb medicines on the activities of serum T-SOD and T-AOC and MDA content in hepatic injury Amur sturgeon Acipenser schrenckii

2.2.2 復方中草藥對施氏鱘血清中AST、ALT活力的影響 從圖4可見:與空白對照組相比,模型對照組以160 mg/kg劑量口灌恩諾沙星10 d,可導致AST、ALT活力極顯著升高 (P＜0.01);與模型對照組相比,3組復方中草藥均可導致AST、ALT活力不同程度的降低,復方二、復方三對AST活力影響極顯著 (P＜0.01),對ALT活力影響顯著(P＜0.05)。

圖4 復方中草藥對恩諾沙星致肝損傷的施氏鱘血清中AST及ALT活性的影響Fig.4 Effect of Chinese herb medicines on the activities of AST and ALT in hepatic injury Amur sturgeon Acipenser schrenckii

2.2.3 復方中草藥對施氏鱘肝組織病理變化的影響 從圖5可見:空白對照組鱘肝細胞組織致密、結構清晰,肝細胞結構及形態(tài)正常,細胞核大而圓,核邊界清晰,未見細胞腫脹及壞死;模型對照組鱘肝細胞存在炎性細胞浸潤、細胞核固縮等現(xiàn)象,且高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn),肝細胞出現(xiàn)內(nèi)灶狀壞死、變形,另有部分肝細胞萎縮凋亡;與模型對照組相比,3組復方中草藥組鱘肝細胞結構均有不同程度的改善,細胞核邊界清晰,細胞空泡化程度減輕、無大片內(nèi)灶狀壞死,偶有炎性細胞浸潤,其中以復方三效果最明顯。

3 討論

3.1 恩諾沙星致施氏鱘肝損傷模型的建立

恩諾沙星廣泛應用于水產(chǎn)動物的病害防治,具有較好的抑菌殺菌效果,但其代謝緩慢、半衰期長,且施藥后于水產(chǎn)動物肝臟中含量高、停滯期長[19-21]。Orman等[22]研究表明,恩諾沙星于肝臟內(nèi)部的主要代謝產(chǎn)物在醫(yī)學臨床上可誘發(fā)肝損傷。相關研究亦表明,恩諾沙星在殺滅細菌的同時促進了大腸桿菌釋放內(nèi)毒素[23],內(nèi)毒素通過血液傳遞于肝組織,破壞肝臟細胞及線粒體,損害肝功能[24]。血漿蛋白質由肝細胞合成與分泌,肝細胞損傷削弱其合成蛋白質的能力,降低釋放于血液中的TP含量[25];此外,肝臟病變可導致其生物膜通透性變大,釋放出大量如AST、ALT等包漿酶,使血液中酶活力升高[26],故血液中TP含量、AST、ALT活力成為衡量機體肝損傷程度的常用指標[27]。Suk等[28]研究表明,氧自由基損傷是藥物性、內(nèi)毒素性肝損傷的關鍵機制,血清中T-SOD活力、T-AOC能力和MDA含量可反映機體內(nèi)氧自由基含量及代謝速率,間接表明機體肝損傷情況。本試驗結果顯示,以80、160 mg/kg劑量的恩諾沙星口灌施氏鱘10 d,均可導致鱘血清中ALT、AST活力極顯著升高及TP含量極顯著降低;同時,160 mg/kg劑量可使鱘肝臟形成器質性損傷,破壞肝細胞結構及功能,故本試驗最終確定以160 mg/kg劑量對供試鱘連續(xù)口灌10 d恩諾沙星,建立肝損傷模型。

圖5 保肝試驗中鱘肝臟組織結構觀察Fig.5 Histological observation of the liver of Amur sturgeon Acipenser schrenckii in the protection experiment

3.2 復方中草藥對施氏鱘肝損傷的保護作用

T-AOC是機體抗氧化和清除自由基能力的總和[17],可間接反映機體自由基代謝狀態(tài)[29]。SOD廣泛存在于動物機體內(nèi),是一種重要的氧自由基清除劑,SOD通過催化O-2·歧化為氧和過氧化氫,減少機體內(nèi)過高濃度的超氧陰離子自由基,提高機體免疫能力、保護細胞免受氧自由基毒害[30]。因此,T-AOC能力與T-SOD活力常被同時作為衡量機體抗氧化和清除氧自由基能力的指標。此外,具有強生物毒性的MDA為脂質過氧化反應鏈式終止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物[31],是被普遍認可的能反映氧自由基產(chǎn)生及引發(fā)脂質過氧化反應的間接指標,其含量可以間接反映機體組織細胞的脂質過氧化程度及氧自由基的產(chǎn)生情況[32]。本試驗結果顯示,3組復方中草藥均可導致供試鱘血清中T-SOD活力及T-AOC能力升高、MDA含量降低。究其原因,可能是3組復方中草藥含有的黃芩、甘草等藥材可以抑制機體對恩諾沙星的吸收,加速恩諾沙星的清除,同時提高機體清除自由基酶的活性,避免自由基引起脂質過氧化反應,保護肝細胞免受損傷,此結果同李素婷等[33]的研究結果相吻合。

生物體細胞膜含多種由不飽和脂肪酸構成的脂質,而脂肪酸可同氧自由基發(fā)生氧化反應,改變細胞膜結構,降低細胞膜流動性,引發(fā)細胞膜蛋白變性[32]。當肝細胞膜因脂質過氧化反應而功能受損、結構破壞時,細胞內(nèi)的ALT、AST等會釋放入血液[34],所以可通過檢測血清中ALT、AST的活力判斷藥物治療肝損傷的效果[35]。本試驗結果顯示, 3組復方中草藥均可導致供試鱘血清中ALT、AST活力降低,究其原因,可能是3組復方中草藥中含有的甘草、黃芩等藥材提高了供試鱘肝臟線粒體呼吸鏈復合體酶活性,并通過清除機體內(nèi)氧自由基來降低線粒體膜脂質過氧化,減少線粒體腫脹度,恢復了線粒體結構和功能的完整性[36-37]。相比較而言,AST的變化幅度更加明顯,可能是由于ALT大多位于細胞漿中,AST多位于線粒體、少部分位于細胞漿,而甘草、黃芩等對線粒體細胞膜的修復及細胞器功能的恢復更加有效[36-37]。此外,供試鱘血清生化指標變化趨勢,同供試鱘肝組織病理變化基本吻合。

4 結語

為探究復方中草藥對恩諾沙星致施氏鱘肝損傷的保護作用,本試驗中首先摸索出恩諾沙星誘導施氏鱘肝損傷的最佳劑量及采樣時間分別為160 mg/kg、10 d,然后階段性投喂中草藥藥餌,并輔以口灌恩諾沙星構建肝損傷模型。結果顯示,3組復方中草藥均能有效調動供試鱘機體免疫相關酶活性、清除機體超氧陰離子自由基,以減輕藥物對鱘肝細胞的損傷,并對肝組織結構及功能的恢復起到積極作用,尤其復方三中草藥效果最為顯著,可作為保護鱘藥物性肝損傷的中草藥組方加以深入研究。

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A model of drug-induced liver injury caused by enrofloxacin and protective effects of compound Chinese herbal medicines on livers in Amur sturgeon Acipenser schrenckii

LUAN Xue-bin1,2,WANG Di2,LIU Hong-bai1,2

(1.Wuxi Fisheries College,Nanjing Agricultural University,Wuxi 214081,China;2.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China)

After a trial on an inducing sturgeon liver injury model(M group)via requirement time and dose test, Amur sturgeon Acipenser schrenckii with body weight of(100±2)g were reared in a circular cement pond and fed the basal diet in the control group and diets containing Chinese herbal medicine compound(Chinese herbal medicine groups,CHM groups and drug-induced liver injury model group,M group)at daily feeding rate of 2%at water temperature of(15.5±1.0)℃ for 11 days.Then enrofloxacin was given to the Amur sturgeon in CHM groups and M group at a dose of 160 mg/kg body weight and equivalent double distilled water was given to the Amur sturgeon in control group by oral administration for 10 days to explore the protective effect of compound Chinese herbal medicines on drug-induced liver injury in Amur sturgeon.The levels of hepatic active materials and activities of enzymes in serum were detected and the hepatic histopathology was observed in the Amur sturgeon administrated above.Results showed that there were significantly lower serum level of total antioxidant capacity(T-AOC)(P＜0.05)and very significantly lower total superoxide dismutase(T-SOD)activities(P＜0.01),and very significantly higher activities of glutamic-pyruvic transaminase(ALT),and glutamic oxalacetic transaminase(AST)and malondialdehyde(MDA)level(P＜0.01)in the Amur sturgeon in M group than those in the control group,with obvious liver histopathology under a microscope,indicating that the liver was injured obviously and the liver injury model was established successfully.The Amur sturgeon in CHM groups had higher serum level of T-AOC and activities of T-SOD,and lower serum level of MDA and activities of AST and ALT,with the same characteristics of hepatic histopathology.The findings proved that Chinese herbal medicines inhibited the physical absorption of enrofloxacin, improved the ability of scavenging free radicals,and promoted hepatocyte recovery,especially compoundⅢ.

Acipenser schrenckii;Chinese herbal medicine;liver injury;enrofloxacin

S941.8

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.01.003

2095-1388(2017)01-0013-07

2016-06-24

國家公益性行業(yè) (農(nóng)業(yè))科研專項 (201203085)

欒學斌 (1991—),男,碩士研究生。E-mail:luanxuebin97592@163.com

劉紅柏 (1970—),女,博士,研究員。E-mail:liuhongbai@sina.com