馬淑芳,王慶奎,戴偉,孫學(xué)亮,陳成勛,邢克智

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,天津市水產(chǎn)與養(yǎng)殖生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300384)

當(dāng)歸多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚Toll樣受體22信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

馬淑芳,王慶奎,戴偉,孫學(xué)亮,陳成勛,邢克智

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,天津市水產(chǎn)與養(yǎng)殖生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300384)

為研究當(dāng)歸多糖Angelica sinensis polysaccharide(ASP)對(duì)點(diǎn)帶石斑魚Epinephelus malabaricus Toll樣受體22(Toll-like receptor 22,TLR22)信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響,以當(dāng)歸多糖體外孵育點(diǎn)帶石斑魚頭腎白細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法檢測(cè)了不同時(shí)間點(diǎn) (3、6、12、24、48 h)TLR22信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。結(jié)果表明:TLR22及與其接頭的Toll樣接頭蛋白1(TIR-domaincontaining adaptor inducing interferon-β,TRIF)的表達(dá)量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,分別于24、12 h達(dá)到峰值;TRIF下游的干擾素調(diào)節(jié)因子 (Interferon regulatory factor 3,IRF3)在24 h表達(dá)量達(dá)到最大值,此時(shí)主要組織相容性復(fù)合體 (Major histocompatibility complex,MHC)與腫瘤壞死因子 (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)的表達(dá)量也開始到達(dá)峰值;白介素-8(Interleukin-8,IL-8)的表達(dá)量在48 h達(dá)到最高。研究表明:當(dāng)歸多糖可激活TLR22及其下游相關(guān)基因,并在免疫調(diào)節(jié)過程中起到重要作用。

點(diǎn)帶石斑魚;當(dāng)歸多糖;TLR22信號(hào)通路;基因表達(dá)

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用點(diǎn)帶石斑魚由天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司提供,選取30尾體質(zhì)健壯、規(guī)格為(218.45±0.35)g的魚用于試驗(yàn)。當(dāng)歸多糖按王慶奎[7]的方法提取獲得。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)中隨機(jī)選取點(diǎn)帶石斑魚30 尾,分成3組,每組10尾。用MS-222將魚麻醉后從尾柄處取血,然后解剖取出頭腎,經(jīng)分離得到頭腎白細(xì)胞。用RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)至6×106cells/L,并分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,每瓶10 mL,于27℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h貼壁。貼壁完成后,棄掉原培養(yǎng)液,收集細(xì)胞(記為0 h)。根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)得到當(dāng)歸多糖最佳孵育濃度為800 μg/mL,試驗(yàn)組中加入該濃度的當(dāng)歸多糖培養(yǎng)液,對(duì)照組加入RPMI-1640培養(yǎng)液,分別于培養(yǎng)后3、6、12、24、48 h棄掉上層培養(yǎng)液,收集細(xì)胞。使用qPCR法檢測(cè)貼壁細(xì)胞中TLR22、TRIF、IRF3、MyD88、TNF-α、IL-8、MHCⅡ-β基因的表達(dá)。1.2.2 白細(xì)胞的分離 在超凈工作臺(tái)上,用小剪刀將點(diǎn)帶石斑魚的頭腎剪成5～10 mm3的小塊,置于150目無菌不銹鋼細(xì)胞篩中,用研缽棒輕輕研磨,并不斷用RPMI-1640維持液 (含2%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素、10 U/mL肝素)沖洗。將獲得的細(xì)胞液離心10 min(4℃,400×g)后,再用PBS平衡鹽溶液洗滌離心10 min(4℃,400× g),重復(fù)3次,再將獲得的細(xì)胞懸液加到提前配制的不連續(xù)的34%/51%的細(xì)胞分離液Percoll溶液中,并離心25 min(4℃,400×g)。用巴斯德吸管小心吸出Percoll液最上層的灰白色細(xì)胞帶,再用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)懸液,于顯微鏡下計(jì)數(shù),用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞成活率 (要求大于95%)。1.2.3 總RNA的提取 向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入3.0 mL Rnaiso Plus試劑 (TaKaRa),將細(xì)胞刮起,用移液槍反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解,采用氯仿抽提方法提取RNA。使用超微量紫外分光光度計(jì)在260、280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定RNA的吸光度,比值為1.8～ 2.0的用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 cDNA的合成 依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (TaKa-Ra)說明書進(jìn)行試驗(yàn),在200 μL離心管中加入4 μL的5×PrimeScript RT Master Mix和2 μL提取的RNA模板溶液,用去離子水 (ddH2O)將溶液定容到20 μL,在37℃水浴鍋中反應(yīng)15 min后,在85℃水浴中反應(yīng)5 s,放入冰箱 (4℃)中15 min,最后將得到的cDNA產(chǎn)物放入冰箱 (-20℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR TLR22、TRIF、IRF3、MyD88、TNF-α、IL-8、MHCⅡ-β和內(nèi)參基因βactin引物序列見表 1。根據(jù) Real Master Mix (SYBR Green I)試劑盒 (天津沙船生物科技有限公司)說明書設(shè)計(jì)反應(yīng)體系,對(duì) β-actin (HQ007251)、TLR22(HQ456304)、TRIF(HQ880-668)、IRF3(JX975468)、MyD88(JF271883)、TNF-α(FJ009049)、IL-8[21](FJ913064)、MHCⅡ-β[22](FJ598318)進(jìn)行qPCR。PCR反應(yīng)體系 (共20 μL) 為:ddH2O 7 μL,正、反向引物各0.5 μL,模板2 μL,LSYBR 10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃下預(yù)變性3 min;95℃下變性15 s,60℃下退火30 s, 72℃下延伸30 s,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。

表1 試驗(yàn)用引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in the experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)按照2-△△Ct法進(jìn)行處理,所有數(shù)值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Excel軟件作圖,用SPSS 18.0軟件對(duì)同一基因不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析,對(duì)同一時(shí)間當(dāng)歸多糖組和對(duì)照組的同一基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA電泳結(jié)果

點(diǎn)帶石斑魚頭腎白細(xì)胞體外孵育24 h的總RNA樣本,經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示(圖1),RNA無明顯降解,每個(gè) RNA樣本的OD260 nm/OD280 nm值均為1.8～2.0,說明 RNA純度較好,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 當(dāng)歸多糖對(duì)TLR22及其信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響

從圖2可見:當(dāng)歸多糖組TLR22隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量顯著上調(diào),在24 h達(dá)到峰值且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05);與其接頭的MyD88基因的表達(dá)量則隨著時(shí)間的變化顯著下調(diào),當(dāng)歸多糖組顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05);而TRIF基因的表達(dá)趨勢(shì)與TLR22一致,在12 h達(dá)到峰值且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05);IRF3基因在3、24 h表達(dá)量達(dá)到峰值且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05),其他時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組無顯著性差異 (P＞0.05)。

圖1 點(diǎn)帶石斑魚頭腎白細(xì)胞RNA電泳結(jié)果Fig.1 The RNA electrophoresis of head kidney leukocytes in Epinephelus malabaricus

圖2 當(dāng)歸多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚頭腎白細(xì)胞TLR22、TRIF、MyD88、IRF3表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of ASP on expression of TLR22,TRIF,MyD88,and IRF3 in head kidney leukocytes of Epinephelus malabaricus

從圖3可見:當(dāng)歸多糖組TNF-α基因表達(dá)量在24 h達(dá)到峰值且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05);當(dāng)歸多糖組MHCⅡ-β表達(dá)量也在24 h達(dá)到峰值,較對(duì)照組顯著上調(diào) (P＜0.05),在3、12 h表達(dá)量顯著增高且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05);IL-8基因的表達(dá)趨勢(shì)與MHCⅡ-β基本一致,但在48 h表達(dá)量達(dá)到峰值且顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)。

3 討論

TLR22作為水產(chǎn)動(dòng)物特有的TLRs家族成員,在免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,TLR22可通過識(shí)別病原微生物保守組分 (PAMPs),激活MyD88 和TRIF依賴型信號(hào)通路[22]。MyD88是TLR非常重要的接頭蛋白之一,含有N端的death結(jié)構(gòu)域(DD)和C端TIR結(jié)構(gòu)域。MyD88一般通過TIR結(jié)構(gòu)域募集下游IL-1R相關(guān)激酶 (IRAK)-4,再由IRAK-4激活其他IRAK家族蛋白,被活化的IRAK蛋白復(fù)合物與腫瘤壞死相關(guān)因子6(TRAF6)相互作用,從而激活TAK1,TAK1再活化IκB激酶 (IκB kinase,IKK)復(fù)合體和MAPK家族。同時(shí),磷酸化后被激活的MAPKs還會(huì)激活MAPK通路,從而導(dǎo)致某些轉(zhuǎn)錄因子的釋放。MyD88依賴型途徑可通過再活化NF-κB、MAPKs等通路來促進(jìn)一些免疫因子,如IFN、IL-8等的分泌到胞外,從而起到增強(qiáng)免疫的作用[23-24]。TRIF作為另一類重要的接頭蛋白,在TRIF依賴型信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)病原體入侵機(jī)體TLR被激活后,開始募集下游一系列接頭蛋白進(jìn)而引起免疫反應(yīng), 如TLR3和TLR4識(shí)別相應(yīng)的配體后就會(huì)通過TRIF直接激活TAK1和TBK1,然后TAK1將會(huì)激活MAPKs和NF-κB這兩條信號(hào)通路,如抗菌肽、炎性因子、MHC、共刺激分子和趨化因子等[25-26]。

圖3 當(dāng)歸多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚TNF-α、MHCⅡ-β、IL-8基因表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of ASP on expression of TNF-α,MHC Ⅱ-β,and IL-8 in head kidney leukocytes of Epinephelus malabaricus

研究發(fā)現(xiàn),多聚肌苷酸-胞苷酸 (Poly I:C)、LPS和刺激隱核蟲等能誘導(dǎo)魚類TLR22通路及通路相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào)。丁旭[27]研究發(fā)現(xiàn),用Poly I:C刺激后,斜帶石斑魚頭腎白細(xì)胞的TLR22基因在被刺激1.5 h后表達(dá)量被顯著誘導(dǎo),并在刺激3 h甚至6 h后依然維持表達(dá)量升高趨勢(shì)。用Poly I:C與LPS刺激斜帶石斑魚之后,TLR22下游的TRIF及MyD88的表達(dá)量分別在6.0、1.5 h顯著升高,而轉(zhuǎn)錄因子IRF3的表達(dá)量也有顯著上調(diào)的趨勢(shì)。大菱鲆受到Poly I:C刺激6 h后,頭腎中的TLR22表達(dá)量顯著上調(diào)[28];石斑魚被隱核蟲感染后,TNF-α表達(dá)量上調(diào),作為一種重要的CXC型趨化因子IL-8,在皮膚和鰓中表達(dá)量上調(diào)量較高,而在脾臟和頭腎中表達(dá)量波動(dòng)不大[21]。

本研究中發(fā)現(xiàn):經(jīng)當(dāng)歸多糖孵育點(diǎn)帶石斑魚頭腎白細(xì)胞后,TLR22的表達(dá)量從6 h開始逐漸呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),24 h達(dá)到峰值;與其接頭的TRIF表達(dá)量開始上調(diào),12 h達(dá)到峰值;而TRIF下游的轉(zhuǎn)錄因子IRF3在24 h表達(dá)量達(dá)到峰值,此時(shí),MHCⅡ-β與TNF-α的表達(dá)量也達(dá)到峰值;48 h IL-8的表達(dá)量較0 h顯著升高。綜上所述,當(dāng)歸多糖孵育點(diǎn)帶石斑魚頭腎白細(xì)胞后,可激活TLR22,并使其募集進(jìn)而激活接頭蛋白TRIF,TRIF被激活后,通過激活下游通路蛋白,從而激活轉(zhuǎn)錄因子 IRF3, IRF3被激活后進(jìn)入核內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞免疫因子釋放,進(jìn)而起到免疫作用。但同為TLR22下游募集蛋白的MyD88,隨著孵育時(shí)間的增加表達(dá)量呈顯著下調(diào),但I(xiàn)RF3、IL-8等基因表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)不規(guī)律性。作者認(rèn)為,出現(xiàn)此結(jié)果的原因有:(1) 在TLR22募集下游蛋白時(shí)TRIF可能與MyD88存在競(jìng)爭(zhēng),或TLR22識(shí)別當(dāng)歸多糖后可能直接募集下游蛋白TRIF; (2)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜, IRF3及IL-8等的表達(dá)可能還受其他通路或蛋白的調(diào)控,或與其他蛋白發(fā)生互作作用。

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Effects of Angelica sinensis polysaccharides on expression of TLR22 pathway-related genes in malabar grouper Epinephelus malabaricus

MA Shu-fang,WANG Qing-kui,DAI Wei,SUN Xue-liang,CHEN Cheng-xun,XING Ke-zhi

(College of Fisheries,Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China)

Head kidney leucocytes of malabar grouper Epinephelus malabaricus were cultured in Angelica sinensis polysaccharides(ASP)in vitro for 3,6,12,24 and 48 h,and changes in mRNA levels of Toll-like receptor 22 (TLR22)pathway-related genes were analyzed by quantitative real-time PCR to investigate effects of ASP on the expression of TLR22 signal pathway-related genes in malabar grouper.The results showed that mRNA levels of TLR22 and TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β(TRIF)were up-regulated gradually with time, with the maximum TLR22 value in 24 h and the maximum TRIF value in 12 h.The peak expression of downstream transcription factor IRF3(interferon regulatory factor 3)was observed in 24 h,and the peak expression of major histocompatibility complex(MHC)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)genes was found in 24 h.The maximal expression of interferon-8(IL-8)mRNA appeared in 48 h.These findings indicate that ASP leads to activate TLR22 and its downstream genes which play an important role in malabar grouper immune regulation.

Epinephelus malabaricus;Angelica sinensis polysaccharide;TLR22 signal pathway;gene expression

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.01.006

2095-1388(2017)01-0033-05

S942.1< class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

A研究較少,且當(dāng)歸多糖對(duì)TLR22及其信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。為此,本研究中檢測(cè)了當(dāng)歸多糖對(duì)點(diǎn)帶石斑魚胞膜TLR22及其信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響,旨在為研究當(dāng)歸多糖提高點(diǎn)帶石斑魚免疫力機(jī)理提供參考。

2016-04-11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (31270456,31402313);國(guó)家 “星火計(jì)劃”重大項(xiàng)目 (2013GA610002);天津市科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目 (12ZCDZNC05900,13ZCZDNC00700);國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目 (2014GB2A100528);天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目 (15JCZDJC33600,15JCZDJC34000)

馬淑芳 (1990—),女,碩士研究生。E-mail:13820289483@163.com

邢克智 (1956—),男,教授。E-mail:kzxing6668@126.com

中草藥多糖具有生物可降解性和環(huán)境安全性,且藥源廣、成本低、不易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來越廣泛[1-3]。通過在飼料中添加中草藥多糖提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力、抗病力,降低發(fā)病率,已成為近幾年研究的熱點(diǎn)[4-6]。當(dāng)歸多糖作為一種重要的中草藥多糖,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已得到廣泛關(guān)注,有研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射當(dāng)歸多糖及其亞組分能顯著提高點(diǎn)帶石斑魚Epinephelus malabaricus體表黏液溶菌酶和血清溶菌酶活力,血液白細(xì)胞數(shù)和NBT陽性細(xì)胞數(shù)[7]。然而,中草藥多糖是一類分子量大且復(fù)雜的化合物,多糖的質(zhì)量控制和作用機(jī)理仍是有待解決的棘手問題[8]。中草藥多糖通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,對(duì)多糖免疫調(diào)節(jié)機(jī)理的闡明是糖生物學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一[9-10]。目前,較為公認(rèn)的多糖免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是:中草藥多糖通過與細(xì)胞表面模式識(shí)別受體結(jié)合后,影響細(xì)胞的信息傳遞過程,進(jìn)而影響細(xì)胞基因表達(dá),起到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用[11]。中草藥多糖可被模式識(shí)別受體和血漿蛋白識(shí)別,模式識(shí)別受體是一種可以識(shí)別病原相關(guān)分子模式結(jié)構(gòu)的非特異性免疫蛋白,其中Toll樣受體 (TLR)和清道夫受體是兩種不同的可以識(shí)別多糖的模式識(shí)別受體[12]。關(guān)于中草藥多糖的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理可以從模式識(shí)別受體方向著手研究。

Toll樣受體 (Toll-like receptors,TLR)是一類重要的跨膜蛋白質(zhì)分子,可識(shí)別微生物具有保守結(jié)構(gòu)的分子,并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。目前,對(duì)作為模式識(shí)別受體之一的TLRs調(diào)控免疫反應(yīng)的研究已成為分子免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[13-16],TLR信號(hào)途徑有MyD88依賴型和TRIF依賴型兩種。

TLR22是水產(chǎn)動(dòng)物特有的TLRs家族成員,且在多種魚類中均有發(fā)現(xiàn)并已報(bào)道[17-18]。有研究表明,TLR22位于細(xì)胞膜表面可識(shí)別LPS、多聚肌苷酸-胞苷酸 (Poly I:C)、長(zhǎng)片段的雙鏈RNA等,其功能與TLR3相似[19-20]。當(dāng)前,大量研究均集中于對(duì)TLR22基因的研究,而對(duì)其下游相關(guān)基因的