郭曉青 韋隆華 代甜甜 伍 慶

(1. 貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽 550081；2. 貴州師范大學(xué)山地環(huán)境重點實驗室，貴州 貴陽 550001)

水芹化學(xué)成分檢測及降血糖作用

郭曉青1韋隆華1代甜甜1伍 慶2

(1. 貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽 550081；2. 貴州師范大學(xué)山地環(huán)境重點實驗室，貴州 貴陽 550001)

研究黔產(chǎn)野生水芹(后簡稱水芹)天然藥物化學(xué)成分及水芹提取物對鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿小鼠降血糖作用。應(yīng)用天然藥物化學(xué)成分單項預(yù)試驗方法檢測水芹化學(xué)成分類型，分光光度法測定總酚酸、總黃酮、總糖含量。用STZ建立小鼠糖尿模型，二甲雙胍做陽性對照，水芹醇提物灌胃，檢測血糖。結(jié)果表明，水芹含酚類、黃酮類、糖類、生物堿等多種活性物質(zhì)，總酚酸、總黃酮、總糖含量較高；水芹醇提物具有一定的降血糖作用，高劑量組血糖均值從27.6降至17.7。黔產(chǎn)水芹具有一定的研究開發(fā)價值。

水芹；提取物；鏈脲佐菌素；降血糖

水芹[Oenanthejavanica(Bl.)DC.]屬傘形科多年生宿根草本水生植物，又名小葉芹、水芹菜、河芹等，中國各地均有分布，喜生于濕洼地、水溝或田地間。水芹藥用歷史悠久，具有清熱解毒、清肝利膽、抗肝炎、脈溢、驅(qū)風(fēng)等功效[1-3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，水芹在提高免疫功能[4]、抗心律失常[5]、抗癌[6]等方面也有一定的功效。目前中國對水芹抗凝血和抗血栓形成[7]、增強免疫力[8]、保肝退黃[9-10]等方面的研究都取得較好的成效，但對水芹降血糖作用研究尚未見報道。

本試驗擬以黔產(chǎn)野生水芹為研究對象，利用各類化學(xué)成分的溶解性和某些特性化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)天然藥物化學(xué)成分檢識，通過分光光度法測定其主要活性成分，用STZ誘導(dǎo)糖尿小鼠模型，水芹提取物灌胃，試驗降血糖作用，旨在為水芹天然藥物化學(xué)活性成分提取分離、活性成分篩選以及尋找新的藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黔產(chǎn)野生水芹：貴州省貴陽、遵義等8地區(qū)11個點考察取樣；

昆明小鼠：生產(chǎn)許可證號：SCXK(黔)2014-0001，動物質(zhì)量合格證號：小鼠0201403，貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；

小鼠飼料：許可證號：SCXK(川)2015-01，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所；

原兒茶酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：純度>98%，上海源葉生物科技有限公司；

葡萄糖、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、硝酸鈉等：分析純，國藥集團化學(xué)試劑公司；

鏈脲佐菌素：純度>98%，美國Sigma公司；

鹽酸二甲雙胍片：中美上海施貴寶制藥有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

制冷水浴恒溫振蕩器：SHA-2型，金壇市醫(yī)療儀器廠；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：GZX-GFC.101-3-S型，上海博泰實驗設(shè)備有限公司；

高速粉碎機：ZH-500型，中南制藥機械廠；

冷凍干燥機：DYYB-12型，上海德洋意邦儀器有限公司；

紫外分光光度計：TU-1810型，上海申光儀器儀表有限公司；

超純水機：YC-ROI-20Z型，四川怡創(chuàng)科技有限公司；

高壓滅菌器：GR60DA型，致微儀器有限公司；

血糖儀：AW06477503A型，強生醫(yī)療器材有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 天然藥物化學(xué)成分類型檢識 利用尋找成分的溶解性能或某些特性，采用適宜的方法制備供試液，根據(jù)常見化學(xué)類型成分檢識表[11]進(jìn)行檢識。

(1) 以水為溶劑供試液的制備：取水芹粉末20 g，加水100 mL，浸泡24 h，用吸管吸取少量水液作蛋白質(zhì)、氨基酸檢識。浸泡液再次在55℃水浴加熱浸泡1 h，過濾，濾液作苷、糖、有機酸、酚、鞣質(zhì)、生物堿類型成分檢識。

(2) 以乙醇為溶劑供試液的制備：取水芹粉末20 g，加100 mL 95%乙醇室溫浸漬24 h，過濾，濾液加水稀釋至含醇量為65%～75%，置分液漏斗中，用2/3量的石油醚萃取兩次。石油醚液體用作油脂和葉綠素檢識。將乙醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸餾，回收乙醇，制成浸膏，浸膏一分為二，一份加NaOH溶解，過濾，濾液作苷類、黃酮、蒽醌、酚類、萜類、內(nèi)酯、生物堿、甾體、有機酸檢識。另一份浸膏用5% HCl溶解，上清液用作生物堿檢識。殘渣用乙酸乙酯溶解，分別用5% NaHCO3、2% NaOH，萃取數(shù)次，NaHCO3液用作有機酸、多元酚檢識，NaOH液用作酚類檢識，回收乙酸乙酯，殘渣液用乙醇溶解，乙醇液用作萜類、內(nèi)酯、甾體等檢識。

(3) 以石油醚為溶劑供試液的制備：取水芹粉末2 g，加20 mL石油醚，密閉浸漬24 h，過濾，濾液作揮發(fā)油、甾體、油脂、氰苷等親脂性成分鑒別。

1.3.2 主要活性成分含量的測定

(1) 待測液制備：準(zhǔn)確稱2 g水芹粉 (80目以下)，加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為65%乙醇溶液，攪拌均勻，在70℃水浴中浸提55 min，過濾，濾液用65%乙醇100 mL容量瓶定容，即為總酚酸、總黃酮含量測定待測液。

準(zhǔn)確稱取一定量水芹粉，應(yīng)用水浴回流方法，用石油醚脫脂，待石油醚揮發(fā)完全后，沸水溶解，用活性炭脫色，過濾，濾液定容，即為總糖含量待測液。

(2) 活性成分含量測定：取1 mL樣液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的方法測定吸光度，根據(jù)式(1)求出活性成分含量。

(1)

式中：

G——活性成分含量，mg/g；

C——活性物質(zhì)量濃度，mg/mL，由標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度換算而得；

V——待測樣液總體積，mL；

W——樣品質(zhì)量，g。

(3) 總酚酸含量測定：采用Folin-Ciocalteu法，根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]的方法，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=13.348x-0.008 8，R2=0.997 1，標(biāo)準(zhǔn)液濃度在0.000～0.028 mg/mL范圍線性關(guān)系良好。取1 mL待測液，按上述測定標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定其吸光度，按式(1)求出樣品總酚酸含量。

(4) 總黃酮含量測定：采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法，根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法，得到蘆丁吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=6.184 8X-0.003 6，R2=0.996 3，標(biāo)準(zhǔn)液濃度在0.000～0.036 mg/mL范圍呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。取1 mL待測液，按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定其吸光度，按式(1)求出樣品總黃酮含量。

(5) 總糖含量測定：采用苯酚―硫酸比色法，根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式為y=19.455x+0.012 2，R2=0.994 7，多糖在0.000～0.032 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。取1 mL待測液，按上述測定標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定其吸光度，按式(1)求出樣品總糖含量。

1.3.3 STZ誘導(dǎo)的糖尿小鼠模型建立 選70只35 g左右雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間抽查血糖是否正常。留10只做正常組，60只相同條件下造模。用0.1 mol/L、pH 4.0的枸櫞酸鈉緩沖溶液做溶劑，將STZ配成1%的溶液，按55 mg/kg 劑量對小鼠進(jìn)行腹腔注射[14-15]，每天1次，連續(xù)5 d。3周后檢測血糖，血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。

1.3.4 水芹灌胃液制備 將水芹用去離子水清洗干凈，瀝干表面水分，置恒溫干燥箱中60℃干燥至恒重，粉碎后過15 μm 的篩得到水芹粉。用95%乙醇做溶劑，按1∶50(g/mL)料液比在微波爐中提取至沸騰，冷至室溫，重復(fù)2次。抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸餾，冷凍干燥，得到提取物粉。生理鹽水作溶劑，吐溫80作助劑，用1%吐溫80的生理鹽水溶解提取物配制不同濃度的提取物溶液進(jìn)行灌胃。

1.3.5 提取物對小鼠體質(zhì)的影響及降血糖作用 將造模成功體質(zhì)量接近的小鼠分為模型組、陽性對照組、給藥組(低劑量、高劑量)，每組10只。用1%吐溫80生理鹽水溶解二甲雙胍及水芹醇提物。陽性對照小鼠以380 mg/kg二甲雙胍劑量灌胃，給藥低劑量、高劑量組小鼠分別以400，800 mg/kg水芹提取物灌胃，正常組和模型組用1%吐溫80生理鹽水(NS)代替，灌胃液體積控制在5～8 mL。每天1次，連續(xù)3周。給藥1周后開始每周固定時間測定小鼠體重和空腹血糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水芹中化學(xué)成分分析

由表1可知，水芹中含有多種類型的物質(zhì)，研究天然藥物活性成分，必須進(jìn)行化學(xué)成分檢識試驗，了解某些天然藥物中所含化學(xué)成分類型的大致情況。天然藥物中所含化學(xué)成分種類較多，但針對某一疾病有活性的成分往往只有一種或一類，化學(xué)成分檢識試驗為提取天然藥物中某類活性成分以及活性追蹤提供導(dǎo)向。

表1 水芹化學(xué)成分類型檢識結(jié)果Table 1 The detection results of chemicalcomponentsof the Oenanthe Javanica

2.2 水芹天然藥物活性成分測定分析

由表2可知，水芹總黃酮、總酚酸及總糖含量都較高，但各地區(qū)含量有差異。對天然藥物的研究，其作用與有效成分的存在和含量的多少有關(guān)，而有效成分又受到天然藥物的品種、產(chǎn)地、采收季節(jié)、加工方法等影響。該試驗初步探究了貴州不同地區(qū)的3種活性成分含量情況，為建立不同地區(qū)的黔產(chǎn)野生水芹的質(zhì)量評價體系提供依據(jù)。

表2 各地區(qū)水芹總酚酸、總黃酮、總糖含量Table 2 The content of total phenolic acids, flavonoids and sugar in Oenanthe Javanica in different regions (n=3) mg/g

2.3 STZ誘導(dǎo)的糖尿小鼠成模情況

按1.3.3方法造模，每周檢測體重和血糖，觀察病狀。3周后，小鼠體重明顯下降，表征明顯出現(xiàn)了多飲、多食、多尿及體重急劇減少的“三多一少”癥狀，血糖均≥27.5 mmol/L，成模率為100%。

2.4 給藥后對小鼠體質(zhì)的影響

由表3可知，正常組小鼠正常生長，模型組小鼠體質(zhì)量一直下降，給藥3周后體質(zhì)量平均值從31.67 g降至24.51 g。陽性對照組和水芹組體質(zhì)量下降趨勢得到控制，喂藥第2周后體重量稍微增加了一點。模型組小鼠造模7周后全部死亡。陽性對照組小鼠死亡時間推遲了2周。水芹組小鼠死亡時間推遲了3周。給藥后小鼠不僅是體重逐漸增加，死亡時間也延遲了，說明給藥后對小鼠體質(zhì)改善有一定的作用。

表3 小鼠體質(zhì)量變化情況Table 3 The changes of the mice’s body weight (n=3)

2.5 水芹提取物對小鼠血糖的影響

由表4可知，二甲雙胍做陽性對照，對照組用量在380 mg/kg，小鼠血糖基本達(dá)到正常值。水芹提取物具有一定的降血糖的作用，高劑量組血糖均值從27.6降至17.7，低劑量組從28.2降至20.8，高劑量和低劑量效果影響不顯著。與二甲雙胍比較，達(dá)不到二甲雙胍的效果。水芹選擇活性成分含量相對較高的安順地區(qū)水芹，用醇提物的混合物灌胃，可能混合物中的某一個成分有降血糖的效果，用混合物灌胃達(dá)不到最佳效果?；旌衔锼苄砸草^差，這就對提高濃度、加大給藥劑量造成了困難，這些問題有待進(jìn)一步解決。

表4 小鼠血糖變化情況Table 4 The changes of the mice’s blood sugar (n=7)

3 結(jié)論

(1) 黔產(chǎn)水芹總酚酸、總黃酮、總糖含量都較高，不同地區(qū)總黃酮含量差異較大。貴陽安順地區(qū)水芹總黃酮含量最高，為145.2 mg/g，黔東南凱里水芹總黃酮含量最低，為27.5 mg/g。該研究為建立不同地區(qū)水芹質(zhì)量評價體系提供一定的導(dǎo)向。

(2) 水芹醇提物具有一定的降糖作用，同時對體質(zhì)改善也起到積極的作用，但降糖效果沒有二甲雙胍好。該研究為水芹醇提物中降糖有效成分尋找或篩選等提供一定的依據(jù)。

(3) 水芹醇提物是混合物，降糖作用的活性物質(zhì)是哪一種、混合物中的某些物質(zhì)對降糖作用有沒有協(xié)同效應(yīng)等問題有待進(jìn)一步研究。

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The detection of the chemical components inOenanthejavanicaand its hypoglycemic activity

GUO Xiao-qing1WEILong-hua1DAITian-tian1WUqing2

(1.GuiyangNursingVocationalCollege,Guiyang,Guizhou550081,China; 2.KeyLaboratoryofMountainEnvironment,GuizhouNormalUniversity,Guiyang,Guizhou550001,China)

The chemical components ofOenanthejavanicafrom Guizhou and the hypoglycemic effect of its extracts on the diabetic mice induced by streptozotocin (STZ) was investigated in this paper. The chemical composition type in the wildO.javanicawas detected in a single prediction experiment by using various chemical components of natural medicine. The total phenolic acids, flavonoids and sugar ofO.javanicawere determined by spectrophotometry. Diabetic mice model was established by STZ, and metformin was used as a positive control, the extracts fromO.javanicawas fed, blood glucose was measured. The results showed thatO.javanicacontained phenols, flavonoids, alkaloids and other active ingredients, and the total phenolic acids, flavonoids and sugar ofO.javanicawere found higher than other kinds of compounds. The extract fromO.javanicashowed a certain hypoglycemic activity, and according to the data, decreasing blood glucose from 27.6 to 17.7. ThusO.javanicafrom Guizhou contains a variety of natural drug chemical composition, showing a certain hypoglycemic effect, and it was valuable to research and explore it.

Oenanthejavanica; extracts; streptozotocin; hypoglycemic effect

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目(編號：黔科合J字[2014]2002號) ；教育部喀斯特山地生物多樣性保護(hù)與可持續(xù)利用創(chuàng)新團隊(編號：IRT1227)

郭曉青(1964—)，女，貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院教授。 E-mail：gyguoxiaoqing@163.com

2016-11-08

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.035