勞 哲，江恩源

（梧州市疾病預(yù)防控制中心,廣西 梧州 543002）

試論聯(lián)用在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測(cè)定毒鼠強(qiáng)的效果

勞 哲，江恩源

（梧州市疾病預(yù)防控制中心,廣西 梧州 543002）

目的：研究聯(lián)用在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（GPC-GC-MS/MS）測(cè)定液、固體樣品中毒鼠強(qiáng)含量的效果。方法：將毒鼠強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中的6個(gè)特征離子（m/z 240、m/z 212、m/z 132、m/z121、m/z132、m/z149）作為母離子，使用3V～45V的電壓對(duì)其進(jìn)行碰撞處理，經(jīng)產(chǎn)物離子優(yōu)化后得到離子豐度較高的 6個(gè)離子對(duì)（212→132； 212→92；240→212；240→149；132→105；212→200）。將離子對(duì)豐度最高的離子對(duì)（212→132）作為定量離子對(duì)，將其余5個(gè)離子對(duì)作為定性離子對(duì)設(shè)為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）參數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)液與樣品同時(shí)進(jìn)行提取、純化、濃縮、定容，然后進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線為: y=215232.7x+31 x+31，r=0.9996，回收率為：98.7%，RSD =4.5%，液體樣品的檢出限為0.00001mg/L，固體樣品的檢出限為0.00002mg/kg。結(jié)論：聯(lián)用在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測(cè)定毒鼠強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液具有高效、準(zhǔn)確性好、檢出限低的特點(diǎn)。

毒鼠強(qiáng)；準(zhǔn)系列溶液；在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)

目前，臨床上測(cè)定毒鼠強(qiáng)的方法主要有GC[1]、GCMS[2]和GC-MS/MS[3]。不過，用上述方法測(cè)定毒鼠強(qiáng)的效果均不理想。在本文中，筆者聯(lián)用在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜對(duì)毒鼠強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)定，取得了很好的效果。研究發(fā)現(xiàn)[4]，用在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜對(duì)毒鼠強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)定，可直接注入GPC，而且經(jīng)過GPC在線分離脂肪和色素后，可直接將純化后的待測(cè)液經(jīng)大體積進(jìn)樣器（PTV）注入到GC-MS/MS中進(jìn)行測(cè)定，從而大大縮短檢測(cè)的時(shí)間，降低MS受到污染的幾率。同時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）中的高選擇性準(zhǔn)確定量法[5]對(duì)毒鼠強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及樣品進(jìn)行測(cè)定，并將檢測(cè)的過程與選擇性離子檢測(cè)模式（SIM）的定量方法[6]進(jìn)行了比較和分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀GPC-GCMS-TQ8030（由日本島津公司生產(chǎn)）；GPC色譜柱：Shodex-EV-200（2.0mmID*150mm，5μm）；GC毛細(xì)管色譜柱；Rxi-5 Sil MS（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）；N1氮吹儀（產(chǎn)自上海屹堯）；毒鼠強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為：1.0mg /ml（由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院中毒控制中心提供，批號(hào)為∶ 201605號(hào)）；乙酸乙酯（色譜純）；無水硫酸鈉（分析純）。

1.2 檢測(cè)的條件

1.2.1 GPC的條件 A泵流速為：0.10mL/min；B泵流速為：0.10mL/min；A、B泵的流動(dòng)相為：丙酮為：環(huán)己烷=3∶7；氘燈波長為：210nm；檢測(cè)池的溫度為：40℃；氟胺氰菊酯的保留時(shí)間為：3.36min。

1.2.2 GC的條件 載氣為∶高純氦氣;柱流速為∶2.10ml /min;大體積進(jìn)樣器（PTV）進(jìn)樣口升溫的程序?yàn)椋撼跏紲囟葹?20℃（保持0 min），以100℃ /min 的速度升溫至180℃（保持4.40 min），以﹣49.8 ℃ /min的速度降溫至120 ℃（保持18.80 min）；柱溫箱升溫的程序?yàn)椋撼跏紲囟葹?2 ℃（保持5.00min），以8℃ /min的速度升溫至180 ℃（保持0 min），以50℃ /min 的速度升溫至300 ℃（保持5.35 min）；進(jìn)樣量為∶10.0μl，不進(jìn)行分流進(jìn)樣[7]。

1.2.3 進(jìn)行選擇性離子檢測(cè)（SIM）的條件 EI 源的溫度為∶200 ℃; MS連接口的溫度為：300℃；溶劑延遲的時(shí)間為∶ 9.70 min;檢測(cè)器的電壓為：0.1kV；間隔為∶0.30 amu；掃描的速度為∶ 2000 ms；閾值為∶1000。SCAN的質(zhì)量范圍為∶m/z 86～m/z 600。SIM的離子設(shè)定為∶ 選取特征離子中相對(duì)離子對(duì)豐度最高的m/z 240作為定量離子， 將m/z 212、m/z 132、m/z121、m/z132、m/z149作為定性離子。

1.2.4 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）的條件 檢測(cè)器的電壓為：0.10kV；間隔為∶0.30 amu；閾值為∶1000。碰撞氣為：高純氬氣；經(jīng)優(yōu)化產(chǎn)物離子后得到離子豐度較高的 6個(gè)離子對(duì)與相應(yīng)的最佳碰撞電壓為：212→132，CE9V；212→92，CE12V； 240→212，CE12V； 240→149，CE9V；132→105，CE6V；212→200，CE3V。將相對(duì)離子對(duì)豐度最高的離子對(duì)（212→132）作為定量離子對(duì)，將其余5個(gè)離子對(duì)（212→92；240→212；240→149；132→105；212→200）作為定性離子對(duì)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 毒鼠強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配置 分別配制毒鼠強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，其濃度分別為∶ 0.000 1μg/ml、0.000 5μg/ml、0.001μg/ml、0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.50μg/ml、1.00μg/ml。

1.3.2 樣品的處理 取固體樣品5 g、液體樣品（包括血液樣品）10 ml置于50ml的塑料離心管中，然后加入乙酸乙酯10 ml，進(jìn)行漩渦振蕩提取 3 min，進(jìn)行5000 r/min的離心處理5 min，再取出上層的乙酸乙酯提取液。用加有無水硫酸鈉的濾紙將提取液過濾到另一支50ml的塑料離心管中，并再次對(duì)其進(jìn)行提取（步驟同上）。完成提取后，用2 ml的乙酸乙酯沖洗濾紙，并將沖洗液與濾出液合并，放入氮吹儀中（設(shè)定水溫為45℃）濃縮至約5 ml。用注射器吸取濃縮液，將其推過抽濾頭（0.22μm濾膜），最后將此濾出液用氮吹儀（設(shè)定水溫45℃）濃縮至近干，用乙酸乙酯將其準(zhǔn)確定容至1.00mL[8]。

2 結(jié)果

2.1 SIM的測(cè)定結(jié)果

將標(biāo)準(zhǔn)系列與樣品以相同的條件經(jīng)過GPC裝置分別進(jìn)樣10μL，得到數(shù)據(jù)圖譜后用定量離子的峰面積y和對(duì)應(yīng)的濃度x（μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，把樣品數(shù)據(jù)圖譜中定量離子的峰面積、稀釋體積、取樣量輸入工作站，經(jīng)計(jì)算后得出樣品中的毒鼠強(qiáng)濃度。當(dāng)毒鼠強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的范圍為0.000 1μg/ml～1.00μg/ml時(shí)，其響應(yīng)值與濃度呈正相關(guān)，色譜峰的保留時(shí)間為18.161 min，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=136594.2x+5926，r=0.998 2，回收率為92.5%。液體樣品的檢出限為0.0005mg/L，固體樣品的檢出限為0.001mg/kg。

2.2 MRM的測(cè)定結(jié)果

當(dāng)毒鼠強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的范圍為0.000 1μg/ml～1.00μg/ml時(shí)，其響應(yīng)值與濃度呈正相關(guān)，色譜峰的保留時(shí)間為18.170 min，標(biāo)準(zhǔn)曲線為∶ y=215232.7x+3169，r=0.999 1，回收率為98.1%。液體樣品的檢出限為0.00001mg/L，固體樣品的檢出限為0.00002mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明MRM方法比SIM方法的檢出限低了50倍，檢測(cè)的靈敏度更高。

2.3 MRM測(cè)定的精密度和樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

取9份陽性洗胃水（每份10mL）。對(duì)其中6 份進(jìn)行平行樣和精密度實(shí)驗(yàn)，RSD =4.5%；將其中3份分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液25μl、50 μl、100 μl（標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為1. 00μg /ml），然后進(jìn)行漩渦振蕩 1 min。按照1.3.2中的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，按照1.2.4中的方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，三份樣品的回收率分別為96.2%、103.1%、97.9%。

3 討論

在線凝膠滲透色譜（GPC）技術(shù)是測(cè)定高分子材料分子量及分布特點(diǎn)最快、最有效的方法[9]。該技術(shù)可根據(jù)不同分子的尺寸，用GPC色譜柱將脂肪和色素從毒鼠強(qiáng)中分離出來，同時(shí)用線流路切換閥將毒鼠強(qiáng)的分子捕集在捕集環(huán)路中，再注入GC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定。將在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)合使用檢測(cè)毒鼠強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，大大縮短了檢測(cè)的用時(shí)，省去了很多前期處理的復(fù)雜步驟，而且減少了對(duì)樣品和MS的污染，因此十分符合臨床上快速、準(zhǔn)確檢測(cè)液、固體樣品中毒鼠強(qiáng)含量的要求。

總之，聯(lián)用在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測(cè)定毒鼠強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液具有快速、高效、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、檢出限低的特點(diǎn)。此方法值得推廣使用。

[1] 孫磊龍,楊志華. 氣相色譜法測(cè)定中毒樣品中的毒鼠強(qiáng)[J]. 海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2011,04（3）:47-48.

[2] 梁曉聰,王瑋,郭蓉,等.氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食物中毒樣品中氟乙酰胺與毒鼠強(qiáng)[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2015,20（8）:3457-3459+3462.

[3] 符展明,鮑建國,金米聰,等. GC/MS/MS法測(cè)定中毒樣品中毒鼠強(qiáng)的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2003,03（6）:285-286.

[4] 趙琳,張曉波,任紅波,等.在線GPC-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定玉米中莠去津、乙草胺和2,4-滴丁酯殘留[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理,2013,05（5）:35-39.

[5] 陳小萍,趙道輝,林國斌,等. 微量毒鼠強(qiáng)GC/PFPD和GC/MS/MS分析條件研究[J]. 海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2003,06（12）:11-13.

[6] 張學(xué),朱建民,朱福源,等. 固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)雜基質(zhì)中的氟乙酰胺和毒鼠強(qiáng)[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2015,11（4）:1743-1745+1753.

[7] 沈平,彭進(jìn),謝朝梅,等. GC-MS同時(shí)檢測(cè)食品中多種常見毒物的方法研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2011,04（9）:781-784+787.

[8] 陳蓓,劉華良,榮維廣,等. 氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)食物中的氟乙酰胺與毒鼠強(qiáng)方法研究[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志,2012,06（6）:539-542.

[9] 何智慧,練文柳,蔣臘梅,等. GPC-氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定卷煙主流煙氣中的苯并[a]芘[J]. 湖南文理學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,01（4）:42-46.

Study on detection method for tetramine intoxication by on line GPC-GC-MS/MS

Lao Zhe，Jiang Enyuan
（Center for Disease Control and Prevention of Wu Zhou，Guangxi Wuzhou，543002）

∶ Objective To study the method for determination of tetramine intoxication by on line GPC-GC-MS/MS. Methods With the standard solution to tetramine 6 characteristic ions (m/z 240, m/z 212, m/z 132, m/z121, m/z132, m/z149) as parent ion , use 3V～45V voltage for collision, then got ion abundance high 6 ion pairs(212→132; 212→92; 240→212; 240→149; 132→105; 212→200). After produced ion were optimized, set the highest ion pair (212→132) as the quantitative ion pair, set remained 5 ion pairs as qualitative ion pairs, set MSM parameter. Then to do extraction, purity, concentration, constant volume for standard liquid and sample in the same time, after that ,and do determination.Results Standard curve∶ y=215232.7x 31 x 31, r=0.999 6, recovery rate of 98.7%, RSD =4.5%, The detection limit of the liquid sample was 0.00001 mg/L, and the detection limit of the solid sample was 0.000 02 mg/kg. Conclusion The method for determination of tetramine intoxication by on line GPC-GC-MS/MS effective and exact, had low detection limit.

∶ tetramine; gel permeation chromatography-Gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometer (GPC-GC-MS/MS); multiple reaction monitoring(MRM);

R657.7

B

2095-7629-（2017）7-0020-02

勞哲，男，1977年出生，漢族，學(xué)歷為本科，副主任技師，研究方向?yàn)榧膊☆A(yù)防與控制。E-mail:laozhe2000@163.com

梧州市公共突發(fā)事件處理專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目資助