伏園園，吳一諾，喻 秀，郭 訥，張仁偉，劉 翠，鄭雪萍，戴 琪，劉培慶，李 民

(中山大學(xué)藥學(xué)院，新藥成藥性評估與評價國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

自噬相關(guān)蛋白ATG4B抑制劑的虛擬篩選及體外活性測定

伏園園，吳一諾，喻 秀，郭 訥，張仁偉，劉 翠，鄭雪萍，戴 琪，劉培慶，李 民

(中山大學(xué)藥學(xué)院，新藥成藥性評估與評價國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

目的 通過計算機(jī)虛擬篩選和體外活性測定，篩選自噬相關(guān)蛋白ATG4B的特異性小分子抑制劑。方法 基于ATG4B蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:2CY7)找出合適的對接口袋；用分子對接方法對SPECS數(shù)據(jù)庫20萬化合物進(jìn)行虛擬篩選并確定候選化合物；用熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法(FRET)檢測候選化合物對ATG4B的體外抑制活性并對其特異性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 確定受體蛋白2CY7的site 5為最適的對接口袋；分子對接后經(jīng)綜合分析選擇并購買30個代表性化合物做進(jìn)一步活性測定?；钚詼y定結(jié)果顯示，AG-690/10400046能有效抑制ATG4B蛋白的活性，而對半胱氨酸蛋白酶家族的另一成員caspase-3無酶切抑制作用。結(jié)論 建立了一種ATG4B蛋白抑制劑的虛擬篩選方法。篩選得到的化合物AG-690/10400046具有明顯的體外抑制活性，為后續(xù)ATG4B抑制劑的生理功能研究奠定基礎(chǔ)。

ATG4B；抑制劑；分子對接；虛擬篩選；自噬；活性口袋5

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞所特有的對細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及長壽命蛋白通過溶酶體途徑進(jìn)行降解的細(xì)胞生物學(xué)過程[1]。自噬對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)能量代謝具有重要意義[2]。細(xì)胞自噬是一個動態(tài)變化的過程，可大致分為以下幾個階段：誘導(dǎo)與成核、延伸、自噬體的成熟、自噬體與溶酶體的融合及其內(nèi)容物的降解[3]。在這一過程中，有多種自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes, ATG)的參與，其中兩條泛素樣通路ATG12-ATG5-ATG16 和ATG8-PE(phosphatidylethanolamine)在自噬體的延伸和成熟過程中起著重要的作用，而ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物作為E3樣酶有助于ATG8與PE的結(jié)合[4]。ATG8必須經(jīng)過一個蛋白水解過程暴露C末端的甘氨酸才能錨定在自噬泡膜上。ATG4作為C54家族的一種半胱氨酸蛋白酶，在ATG8連接系統(tǒng)中起了非常關(guān)鍵的作用。ATG4可以剪切ATG8的C端精氨酸，使其暴露出C端的甘氨酸殘基，以便與PE共價連接形成ATG8-PE錨定在自噬泡膜上。接下來ATG4還能去脂化ATG8-PE，以便使自噬體與溶酶體融合[5]。因此，通過調(diào)控ATG4介導(dǎo)的ATG8-PE的去脂化過程能調(diào)控整個自噬的過程。

已有文獻(xiàn)報道，ATG4B在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用。ATG4B被認(rèn)為是一個致癌基因，能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長且獨(dú)立于其自噬調(diào)節(jié)作用[6]。除此之外，在慢性髓細(xì)胞性白血病及骨肉瘤細(xì)胞中，ATG4B也被看作致癌基因[7-8]。另外使用ATG4B的小分子抑制劑NSC185058能抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長[8]。不僅如此，ATG4B在博來霉素誘導(dǎo)的心肌纖維化過程中起了重要作用。由此我們可以看出，ATG4B可能是疾病治療中的潛在靶點(diǎn)，抑制ATG4B可以作為疾病治療的手段。但目前關(guān)于ATG4B小分子抑制劑的研究還少見報道，抑制劑效價偏低，缺少系統(tǒng)的虛擬篩選方法。本實(shí)驗(yàn)將建立了一種計算機(jī)虛擬篩選ATG4B抑制劑的方法，結(jié)合體外活性驗(yàn)證，篩選出特異性ATG4B小分子抑制劑。這些研究為ATG4B抑制劑的虛擬篩選奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究抑制劑在抗腫瘤等疾病治療中的作用提供了研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料 虛擬篩選的軟件Discovery Studio Client 2.5(Accelrys,San Diego, CA)；分子三維結(jié)構(gòu)顯示軟件PyMoL(DeLano Scientific, Palo Alto, CA)；ATG4B 的晶體結(jié)構(gòu)來自PDB 數(shù)據(jù)庫(Protein DataBank)；化合物數(shù)據(jù)庫來自SPECS(http://www.specs.net)；篩選到的30個小分子化合物購自美國SPECS數(shù)據(jù)庫；NEM、考馬斯亮藍(lán)R250購自上海生工生物工程有限公司；IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)購自美國Merck；星形孢菌素購自美國LC Laboratories；caspase-3底物肽Ac-DEVE-AFC購自中肽生化有限公司；Z-VAD-FMK購自美國Selleck公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用DMEM培養(yǎng)基和類胎牛血清購自美國Gibco公司；表達(dá)ATG4B及其酶切底物蛋白FRET-GATE-16的質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存[9]；HELA細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存[10]。

1.2 數(shù)據(jù)庫準(zhǔn)備 考慮到化合物的結(jié)構(gòu)多樣性及來源可獲得性，本研究選擇含有200 000個小分子的SPECS數(shù)據(jù)庫作為原始數(shù)據(jù)庫。首先利用MOE.2010.軟件，對數(shù)據(jù)庫中的小分子進(jìn)行初篩。在MOE.2010.中，每個化合物將被生成250個構(gòu)象，經(jīng)過Lipinski類藥五原則方法篩選，以下小分子將被篩除：分子質(zhì)量>600，LogP<-4，LogP>8，氫鍵供體和受體之和>12，柔性鍵>7，單鍵鏈長>6，手性中心>4，自由的手性中心>3和過渡金屬>8等。通過該方法，每一個化合物都能得出一組物理和生物性質(zhì)的相關(guān)數(shù)據(jù)，以對數(shù)據(jù)庫中的小分子進(jìn)行類藥性評價。篩選得到的小分子組成數(shù)據(jù)庫A，所有數(shù)據(jù)庫A中的小分子都將用于之后的分子對接篩選。

1.3 蛋白活性口袋的準(zhǔn)備 我們選擇PDB代碼為2CY7的晶體作為分子對接的受體結(jié)構(gòu)。在受體蛋白結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備過程中，刪除受體結(jié)構(gòu)中的水分子，添加氫原子同時將電離殘基在中性pH條件下質(zhì)子化，將電場設(shè)置為CHARMm。準(zhǔn)備好受體結(jié)構(gòu)后，開始進(jìn)行分子對接。

1.4 分子對接篩選 我們使用Accelrys Discovery Studio Client 2.5軟件里的LigandFit板塊來進(jìn)行分子對接。準(zhǔn)備工作就緒后，將數(shù)據(jù)庫A中的所有分子對接到蛋白口袋中，每個小分子設(shè)置50種對接構(gòu)象，通過Consence Score對化合物進(jìn)行打分，產(chǎn)生排名前500的化合物，然后考慮較好的對接打分值以及符合的結(jié)合模式(主要與蛋白口袋中關(guān)鍵氨基酸殘基CYS74、ASP278及HIS280的作用模式)。從而篩選出30個化合物進(jìn)行購買并用于接下來的生物活性測試。

1.5 重組蛋白的表達(dá)純化 將重組質(zhì)粒FRET-GATE-16和ATG4B分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)CodonPlus和BL21(DE3)PLYSs中。LB平板挑取單克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r·min-1過夜培養(yǎng)，1 ∶100進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.6～0.8時加入0.5 mmol·L-1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，16℃，16 h培養(yǎng)后收菌。離心收集菌體，加入濕菌重量5～10倍的結(jié)合緩沖液(含5 mmol·L-1的咪唑)稀釋菌體后超聲破碎菌體。離心收集上清，使用鎳NTA填料進(jìn)行純化，加入菌液上清使目的蛋白掛柱，之后分別用20 mmol·L-1和50 mmol·L-1的咪唑緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，最后用200 mmol·L-1的咪唑洗脫并收集洗脫液。將收集到的洗脫液過脫鹽柱后濃縮并于-80℃冰箱保存。

1.6 FRET方法檢測ATG4B活性 384孔黑板中加入終濃度為100 μmol·L-1的指定化合物與0.75 mg·L-1的ATG4B在Tris緩沖液中37℃共孵育30 min，之后加入50 mg·L-1的FRET-GATE-16，反應(yīng)總體系為50 μL，反應(yīng)時間為30 min。該體系的中含有0.1% DMSO終濃度。527/477 nm的RFUs比值在反應(yīng)30 min時測定。ATG4B相對酶切活性的計算公式為：抑制率/%=(RFUmax-RFUX)/(RFUmax-RFUmin)×100%，其中RFUmax指沒發(fā)生酶切反應(yīng)時的527/477 nm的比值，RFUmin指酶切反應(yīng)進(jìn)行到最徹底的527/477 nm的比值，RFUX指在特定化合物處理條件下的527/477 nm的比值。

1.7 SDS-PAGE方法檢測ATG4B活性 將3 ng的ATG4B單獨(dú)或與指定濃度的化合物在緩沖液中37℃共孵育30 min，之后加入4 μg的底物蛋白FRET-GATE-16，反應(yīng)總體系為20 μL，反應(yīng)時間為30 min。用5X上樣緩沖液終止反應(yīng)，將蛋白變性，采用SDS-PAGE進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色方法對條帶進(jìn)行著色，之后脫色進(jìn)行分析。

1.8 caspase-3活性測定 HELA細(xì)胞于含有10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。用星形孢菌素(1 μmol·L-1, 5 h)來誘導(dǎo) HELA細(xì)胞凋亡，對照組細(xì)胞不做任何處理，在同樣的條件下培養(yǎng)。非變性提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測細(xì)胞蛋白含量，上樣量為10 μg。384孔黑板中加入終濃度為100 μmol·L-1的指定化合物與10 μg的細(xì)胞裂解液在Tris緩沖液中37℃共孵育30 min，之后加入終濃度為25 μmol·L-1的熒光底物Ac-DEVE-AFC，反應(yīng)總體系為50 μL，立即檢測熒光值，測定時間為60 min，反應(yīng)溫度為37℃。分別于激發(fā)光400 nm和發(fā)射光505 nm處檢測熒光AFC的動力學(xué)曲線。

2 結(jié)果

2.1 計算機(jī)虛擬篩選ATG4B抑制劑 ATG4B的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析出來(PDB ID:2CY7)。因ATG4B晶體結(jié)構(gòu)中不含有與受體蛋白共結(jié)晶的小分子配體，我們使用Accelrys Discovery Studio Client 2.5軟件里的Find sites模塊對受體中可能存在的口袋位置進(jìn)行尋找并找到10個可能的口袋位置。因site 5口袋在ATG4B的N末端尾巴部分(1～20位氨基酸殘基)與調(diào)節(jié)環(huán)(259～262位氨基酸殘基)之間的凹槽處，且site 5口袋包含ASP278和HIS280這兩個非常重要的氨基酸殘基，因此我們選擇site 5為本次對接工作的口袋位置。Site 5口袋的位置如Fig 1A～B所示。Site 5口袋包含的氨基酸殘基如下：THR10、LEU11、ALA14、ASN261、SER262、HIS264、TYR276、ASP278、HIS280和CYS306。將數(shù)據(jù)庫A(含有149,214個小分子)與site 5進(jìn)行對接，通過Consence Score給出打分，并對排名前500的化合物通過骨架進(jìn)行分類，結(jié)合化合物與受體的結(jié)合模式，從中挑選并購買了30個有代表性的化合物進(jìn)行生物活性測試。

Fig 1 The structure and active pocket site 5 of ATG4B

A：Surface presentation of the active pocket site 5 of ATG4B. The regulatory loop was colored marine, the N-terminal tail was colored slate, and the site 5 was colored red； B：Surface model of site 5. Atom coloring was the same as in(A)

2.2 FRET方法檢測候選化合物對ATG4B的體外抑制活性 為保證該體系的可靠性和穩(wěn)定性，用考馬斯亮藍(lán)染色的方法對純化出來的兩種蛋白的純度及活性進(jìn)行了驗(yàn)證。FRET-GATE-16(4 μg)與合適量的ATG4B(3 ng)在37℃共孵育0 min或30 min。如Fig 2A所示，全長的FRET-GATE-16(0 min)的純度(>90%)可以用于接下來的實(shí)驗(yàn)，而30 min時全長的FRET-GATE-16(0 min)幾乎可以完全被3 ng的ATG4B酶切為CFP-GATE-16和CFP兩部分，說明ATG4B的活性良好。我們選擇半胱氨酸蛋白酶的通用型抑制劑N-乙基馬來酰亞胺(NEM)作為本次篩選的陽性對照，利用該檢測體系測得NEM的IC50值為134.2 μmol·L-1(Fig 2B)。接著對購買的30個小分子化合物用FRET方法測定100 μmol·L-1的濃度下對ATG4B的抑制活性。如Fig 2C所示，化合物AG-690/10400046表現(xiàn)出最高的抑制活性，該化合物的結(jié)構(gòu)如Fig 2D所示。

2.3 AG-690/10400046對ATG4B的體外抑制活性驗(yàn)證 為進(jìn)一步驗(yàn)證AG-690/10400046對ATG4B的體外抑制活性，采用考馬斯亮藍(lán)染色的方法檢測該化合物對ATG4B的酶切抑制效果。如Fig 3A所示，AG-690/10400046能劑量依賴性地抑制ATG4B的活性，且在100 μmol·L-1的條件下幾乎可以完全抑制住ATG4B的活性。FRET方法測得該化合物的IC50值為36.8 μmol·L-1(Fig 3B)。此外，從AG-690/10400046與受體的對接結(jié)果來看，該化合物與受體蛋白2CY7 的口袋位置具有良好的結(jié)合模式，且與受體蛋白的PHE16及GLU312位點(diǎn)形成了氫鍵作用(Fig 3C～D)，表明該化合物與ATG4B之間有較好的相互作用。以上結(jié)果表明該化合物具有較強(qiáng)的ATG4B抑制能力。

Fig 2 Screening of ATG4B inhibitors by FRET assay

A：Verification of the cleavage of FRET substrates by ATG4B using SDS-PAGE. B：NEM was used as a positive control with an IC50of 134.2 μmol·L-1for ATG4B using the FRET-based assay. C：A total of 30 compounds were further tested for their inhibitory effects on ATG4B activity using the FRET-based assay. D：The structure of AG-690/10400046

2.4 AG-690/10400046的特異性抑制作用分析 為了判斷AG-690/10400046是否廣泛的抑制其他半胱氨酸蛋白酶，我們采用半胱氨酸蛋白酶家族的另一成員caspase-3來驗(yàn)證。如Fig 4A所示，星形孢菌素能有效的誘導(dǎo)HELA細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。caspase-3的特異性抑制劑Z-VAD-FMK在50 μmol·L-1的濃度下能有效抑制caspase-3的酶切活性。而AG-690/10400046在100 μmol·L-1的濃度下對caspase-3的酶切活性沒有影響，說明該化合物不是普遍的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。

3 討論

ATG4家族成員在脂化與去脂化ATG8家族成員以形成自噬體的過程中扮演著非常重要的作用。ATG4在酵母中僅有一個成員，其功能的缺失將阻斷整個自噬的進(jìn)程[11]。而在哺乳動物細(xì)胞中ATG4有4個家族成員：ATG4A、ATG4B、ATG4C和ATG4D。ATG4B作為ATG4家族中研究最為廣泛的成員，對ATG8家族成員(LC3家族及GABARAP家族)均具有酶切活性[12]。

ATG4B的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:2CY7)已經(jīng)被解析出來，其酶切活性位點(diǎn)為：CYS74、ASP278及HIS280[11]，這些位點(diǎn)的突變將導(dǎo)致ATG4B酶切活性的喪失[13]。正常情況下，ATG4B的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)CYS74被一個調(diào)節(jié)環(huán)(259～262位氨基酸殘基)所遮蓋。一旦ATG4B與LC3形成復(fù)合物，ATG4B的調(diào)節(jié)環(huán)部分被LC3的尾部殘基PHE119提升起來，導(dǎo)致ATG4B蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，使得LC3的C末端尾巴可以伸入到ATG4B的酶切位點(diǎn)[14]。另外ATG4B一旦與LC3結(jié)合，其N端尾巴(1～20位氨基酸殘基)經(jīng)歷了很大的構(gòu)型變化，這可能與其對LC3的去脂化作用有關(guān)，因?yàn)橹挥挟?dāng)ATG4B處于游離狀態(tài)時更傾向于與膜上脂化形式的LC3-PE相結(jié)合[15]。

Fig 3 Inhibitory effects of AG-690/10400046 on ATG4B activity

A: Determination of the different concentrations of AG-690/10400046 on ATG4B activity using the SDS-PAGE assay; B: AG-690/10400046 showed an IC50of 36.8 μmol·L-1for ATG4B by using the FRET-based assay; C: The binding mode of AG-690/10400046 with ATG4B; D: AG-690/10400046 can form hydrophobic interactions with residues PHE16 and GLU312 of ATG4B

Fig 4 Selectivity of AG-690/10400046 and diagram of virtual screening

(A) Selectivity test of AG-690/10400046 on another cysteine protease caspase-3.(SP:staurosporine).(B)The diagram of virtual screening of ATG4B inhibitors

目前，自噬被報導(dǎo)與多種疾病相關(guān)，包括腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、感染性疾病、心血管和代謝性疾病等[16]。而ATG4B作為自噬過程中的一個關(guān)鍵性靶標(biāo)，通過調(diào)控ATG4B的活性可以調(diào)控整個自噬的過程。因此，作為一個潛在的生物標(biāo)記物及疾病治療的靶標(biāo)，特異性ATG4B小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要。

本研究旨在建立一種虛擬篩選的方法，并利用該方法篩選出特異性ATG4B小分子抑制劑(Fig 4B)。我們基于游離態(tài)ATG4B 的晶體結(jié)構(gòu)2CY7，綜合計算機(jī)虛擬篩選以及體外生物活性測試，得到具有明顯ATG4B抑制活性的小分子化合物AG-690/10400046。AG-690/10400046，其IC50為36.8 μmol·L-1，優(yōu)于文獻(xiàn)報道的化合物NSC185058[8]。AG-690/10400046對半胱氨酸家族另一成員caspase-3無酶切抑制作用，說明該化合物為選擇性ATG4B小分子抑制劑而不是廣泛的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。以上結(jié)果表明，我們建立了一種可靠的ATG4B小分子抑制劑的虛擬篩選方法，且篩選到了高選擇性ATG4B小分子抑制劑AG-690/10400046。這為進(jìn)一步尋找或設(shè)計更為高效的ATG4B小分子抑制劑及研究ATG4B抑制劑在疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Virtual screening andinvitroactivity studies of novel ATG4B inhibitors

FU Yuan-yuan,WU Yi-nuo,YU Xiu,GUO Ne,ZHANG Ren-wei,LIU Cui,ZHENG Xue-ping,DAI Qi,LIU Pei-qing,LI Min

(SchoolofPharmaceuticalSciences,NationalandLocalUnited
EngineeringLabofDruggabilityandNewDrugsEvaluation,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510006,China)

Aim To screen out novel ATG4B inhibitors based on the computer-aided drug screening and investigate theinvitroactivities of these inhibitors.Methods By performing in silico docking based on the crystal structure of ATG4B(PDB ID: 2CY7), the SPECS database with 200 000 compounds were screened. The inhibitory effect on ATG4B of those candidate compounds was verified by fluorescence resonance energy transfer assay(FRET).Results Site 5 of the 2CY7 was the most suitable pocket for molecular docking. After screening, 30 compounds were purchased from SPECS database for further bioassay. Among them, AG-690/10400046 effectively inhibited ATG4B activityinvitrowith high specificity.Conclusion A promising method is established for screening ATG4B inhibitors.Compound AG-690/10400046 is screened out with high activity and specificity.This work lays a foundation for virtual screening and later physiological function studies of ATG4B inhibitors.

ATG4B; inhibitors; molecular docking; virtual screening; autophagy; pocket site 5

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.014.html

2016-10-25,

2016-12-02

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 31671437)；廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No 2016A030313335)

伏園園(1991-)，女，碩士生，研究方向：藥物篩選，E-mail:863068184@qq.com; 李 民(1976-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞自噬，通訊作者，E-mail: limin65@mail.sysu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.007

A

1001-1978(2017)03-0321-06

R329.24；R319；R965.1；R977.6