孫聰 劉文佳 金巖 金鈁

正畸牙齒移動(dòng)是一種對(duì)機(jī)械力的生物學(xué)反應(yīng)。牙齒移動(dòng)是加力裝置導(dǎo)致牙槽骨改建的結(jié)果，應(yīng)力分別會(huì)導(dǎo)致壓力側(cè)的骨質(zhì)吸收和張力側(cè)骨質(zhì)形成。為了使牙齒移動(dòng)到想要的位置，壓力側(cè)的牙槽窩形成間隙以便牙齒移動(dòng)而張力側(cè)會(huì)出現(xiàn)進(jìn)行性的骨形成。骨的改建包括骨的吸收和骨的生成，正常骨組織這一過(guò)程是相互平衡的。正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中壓力側(cè)破骨細(xì)胞活化破骨，牙齒向壓力側(cè)移動(dòng)，張力側(cè)形成間隙被新生骨充滿[1]。正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程不僅僅和破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)，其復(fù)雜之處在于各種信號(hào)通路、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞因子等變化都參與其中，了解它們之間的相互關(guān)系對(duì)研究牙齒移動(dòng)機(jī)制具有重要意義。

糖原合酶激酶- 3β(glycogen synthase kinase- 3，GSK- 3β) 是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在蛋白質(zhì)合成、信號(hào)傳遞、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)功能、腫瘤形成及胚胎發(fā)育等眾多細(xì)胞進(jìn)程中均扮演重要的角色。GSK- 3β能夠使多種底物發(fā)生磷酸化，并參與胰島素、Wnt、Rankl以及Hedgehog等多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控，在其中發(fā)揮重要作用[2]。許多研究表明GSK- 3β在炎癥反應(yīng)和骨改建中發(fā)揮重要作用[3-4]。因此我們引進(jìn)GSK- 3β基因敲除小鼠來(lái)研究GSK- 3β在正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

正畸用鎳鈦螺旋拉簧(上海埃蒙迪)，正畸測(cè)力計(jì)(奧杰G212- 01，杭州)，結(jié)扎鋼絲(0.1 mm)，自制開(kāi)口器，酸蝕劑(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院)，3M粘結(jié)劑(3M Unitek，美國(guó))，光固化燈(LY- B200，廣東佛山)，器械盒(剪刀，鑷子，針持，手術(shù)刀，眼科剪)，牙科氣槍，戊巴比妥鈉(1%)，Micro CT(GE公司，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選擇10 周齡，無(wú)特定病原體動(dòng)物(SPF級(jí))，雄性C57小鼠20 只(由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重20 g左右，動(dòng)物飼養(yǎng)于完全潔凈環(huán)境下(第四軍醫(yī)大學(xué)組織功能工程中心動(dòng)物房)。自由進(jìn)食消毒固體飼料，飲消毒清水，室溫控制下飼養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)分組：GSK- 3β基因敲除組與野生型注射LiCl，各加力3、7 d后處死，5 只/組；野生型組與GSK- 3β基因敲除組：各加力3、5、7、14 d處死，5 只/組。

1.3 基因敲除小鼠繁殖鑒定

1.3.1 基因敲除小鼠繁殖 取1 只雄性GSK- 3β基因敲除C57小鼠和2 只雌性野生型C57小鼠合籠，每天檢查受孕，雌性小鼠出現(xiàn)精栓后分籠。產(chǎn)仔3 周左右進(jìn)行基因鑒定，雌雄分籠。

1.3.2 基因敲除小鼠基因鑒定 待小鼠滿3 周后，打耳標(biāo)，取尾約1 mm，分別放入100 μl裂解液+2 μl蛋白酶K中，55 ℃水浴過(guò)夜，再調(diào)節(jié)溫度85 ℃水浴1 h使蛋白失活。進(jìn)行PCR擴(kuò)增后凝膠劑電泳，熒光燈下觀察結(jié)果(圖 1)，同時(shí)含有2 個(gè)條帶450 bp和333 bp的樣本2、4、8為基因敲除小鼠，其余樣本只含有1 個(gè)條帶333 bp為野生型。

圖 1 小鼠基因鑒定結(jié)果

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1%戊巴比妥鈉腹腔注射全身麻醉(注射時(shí)頭部朝下，回抽無(wú)血注射，防止損傷內(nèi)臟)，待麻醉徹底后在手術(shù)板上固定小鼠四肢，開(kāi)口器開(kāi)口，酒精棉球擦洗第一磨牙(M1),氣槍吹干，酸蝕劑酸蝕約40 s，酒精棉球擦洗干凈，氣槍吹干牙面，涂3M底膠，光固化燈照射10 s，拉簧剪4 mm左右一側(cè)彎圈，用3M固體膠粘于M1表面，注意清潔膠體不要接觸第二磨牙和牙齦，光固化燈固化40 s。同樣酸蝕切牙吹干，在2 個(gè)切牙上制作樹(shù)脂球，將另一側(cè)拉簧綁在磨牙上，測(cè)力計(jì)測(cè)力，大小控制在30 g。剪斷多余結(jié)扎絲，樹(shù)脂球包裹切端，防止磨傷黏膜[5](圖 2)。

圖 2 建立小鼠正畸牙齒移動(dòng)模型

50 只小鼠同樣方法固定拉簧，力值大小控制為30 g，術(shù)后喂養(yǎng)松軟食物(如面包)，每天觀察小鼠體征，檢查拉簧固定狀況，拉簧損壞脫落及時(shí)同樣方法修復(fù)。

1.5 標(biāo)本采集

野生型組和GSK- 3β組根據(jù)分組在3、5、7、14 d；野生型注射LiCl組(隔天100 ng/ml)[6]3、7 d采取脫頸法處死，迅速分離小鼠上頜骨，取右側(cè)小鼠牙及牙周組織，迅速放入4%多聚甲醛固定24 h，每組各隨機(jī)取3 只掃M(jìn)icro CT。然后，自來(lái)水沖洗24 h，16%EDTA脫鈣，2～3 d換液1 次，脫鈣3 周左右，針刺法檢測(cè)脫鈣狀況，脫鈣結(jié)束后，30%蔗糖脫水過(guò)夜，包埋液包埋，冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色。

1.6 免疫熒光染色

冰凍切片室溫下晾干30 min，PBS洗5 min×3，2%BSA37 ℃封閉60 min，置切片于濕盒內(nèi)，滴加一抗(trap)4 ℃過(guò)夜，PBS洗5 min×3，滴加二抗37 ℃ 30 min，PBS洗5 min×3，用1 g/ml Hoechst染核20 min，PBS洗5 min×3，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察或-20 ℃避光保存。

2 結(jié) 果

2.1 正畸牙齒移動(dòng)距離

加力3、5、7、14 d(本實(shí)驗(yàn)重在觀察基因敲除小鼠與野生型的差別因此分多組進(jìn)行觀察)的Micro CT掃描結(jié)果顯示：野生型小鼠與GSK- 3β基因敲除小鼠各組內(nèi)對(duì)比，牙齒明顯移動(dòng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；野生型小鼠與GSK- 3β基因敲除小鼠同期相比，加力后牙齒移動(dòng)距離有差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；蚯贸∈蟮难例X移動(dòng)距離較野生型的明顯縮短(表 1)。

表 1結(jié)果顯示：抑制GSK- 3β可以抑制小鼠正畸牙齒移動(dòng)，而注射LiCl會(huì)產(chǎn)生與敲除GSK- 3β在牙齒移動(dòng)方面會(huì)產(chǎn)生類似的效果。

表 1 野生型小鼠與GSK- 3β基因敲除小鼠牙齒移動(dòng)距離

注： 野生型小鼠與GSK- 3β基因敲除小鼠各組內(nèi)對(duì)比，P<0.05； 野生型小鼠與GSK- 3β基因敲除小鼠同期各組相比，P<0.05

GSK- 3β基因敲除型與野生型注射LiCl小鼠加力后取材掃描MicroCT結(jié)果顯示：正畸加力后牙齒出現(xiàn)明顯移動(dòng)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示3、7d(查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用3、7 d時(shí)間進(jìn)行研究正畸牙齒移動(dòng)較多；另一方面只是對(duì)比基因敲除與藥物注射的區(qū)別無(wú)需長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行觀察因此只選用2 個(gè)時(shí)間段)的GSK- 3β基因敲除小鼠與野生型注射LiCl小鼠牙齒移動(dòng)距離無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表 2)。

表 2 GSK- 3β基因敲除小鼠與野生型注射LiCl小鼠牙齒移動(dòng)距離

Tab 2 Tooth movement distance of the GSK- 3 gene knockout mice and wild type mice injected with LiCl

(n=5， μm)

注： 3 d：P>0.05； 7 d：P>0.05

2.2 加力后破骨細(xì)胞變化

免疫熒光(Trap)染色結(jié)果顯示：加力3d破骨細(xì)胞野生型高于基因敲除型小鼠水平；而加力7 d時(shí)破骨細(xì)胞野生型也明顯高于基因敲除小鼠水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而GSK- 3β基因敲除組與野生型注射LiCl組相比無(wú)明顯差異。此結(jié)果與Micro CT結(jié)果相一致(表 3)。

由此可得出結(jié)論:GSK- 3β可以通過(guò)改變破骨細(xì)胞的水平從而影響小鼠正畸牙齒移動(dòng)。

表 3 破骨細(xì)胞數(shù)量

注： 野生型組與GSK- 3β基因敲除組相比, 3 d：P<0.05； 7 d：P<0.05； 野生型注射LiCl組與野生型注射LiCl組相比3 d：P>0.05； 7 d：P>0.05

3 討 論

3.1 基因小鼠在正畸研究中的應(yīng)用

本實(shí)驗(yàn)引進(jìn)基因敲除小鼠和常規(guī)注射抑制劑做對(duì)比，發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠比常規(guī)注射抑制劑效果稍明顯，但是差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然不具有顯著區(qū)別，但在以后的研究中應(yīng)用基因小鼠不失為一種更好的選擇，一方面可以從根本上抑制目的基因，目的蛋白，避免藥物其他影響的干擾性；另一方面會(huì)使得實(shí)驗(yàn)更加容易操作，避免注射藥物過(guò)程中導(dǎo)致的動(dòng)物受傷，死亡等狀況。談及基因敲除動(dòng)物，最佳動(dòng)物是小鼠，但是在正畸牙齒移動(dòng)模型中往往是應(yīng)用稍大型動(dòng)物，因?yàn)橐子诓僮?，然而也有其弊端，就是很難用大樣本實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)明問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)嘗試應(yīng)用小鼠作為正畸加力模型，成功制作模型后進(jìn)行加力，采取較大樣本，各階段觀察的方法，較為有力的證明GSK- 3β影響正畸牙齒的移動(dòng)。

3.2 GSK- 3β對(duì)正畸牙齒移動(dòng)影響的潛在途徑

研究表明LiCl可以通過(guò)Wnt/β- catenin信號(hào)通路增強(qiáng)骨的形成。LiCl通過(guò)抑制GSK- 3β增強(qiáng)β- catenin信號(hào)來(lái)治療躁郁癥已幾十年了[7]。GSK- 3β影響牙齒移動(dòng)可能通過(guò)：(1)通過(guò)Wnt等通路影響骨質(zhì)改建從而影響牙齒移動(dòng)。Wnt影響骨改建已經(jīng)被證實(shí)。而目GSK- 3β對(duì)Wnt系統(tǒng)的調(diào)節(jié)方式，目前認(rèn)為有如下2 種方式：①GSK- 3磷酸化β- catenin的第33 、37 、41、45位點(diǎn)上的絲氨酸和蘇氨酸。這些位點(diǎn)的磷酸化對(duì)于β- catenin的降解具有重要意義。實(shí)驗(yàn)證明，β- catenin N- 端的缺失(缺乏以上這些位點(diǎn))后在體內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)的穩(wěn)定，并且不影響其與a- catenin、E- cadherin以及LEF- 1/Tcf的結(jié)合。在多種腫瘤中的確發(fā)現(xiàn)類似的突變。②GSK- 3對(duì)β- catenin的另一個(gè)調(diào)節(jié)機(jī)制是通過(guò)對(duì)APC的調(diào)節(jié)β- catenin產(chǎn)生影響。GSK- 3可以經(jīng)axin直接磷酸化APC。磷酸化的APC會(huì)增加其與β- catenin的結(jié)合，繼而降解β- catenin。β- catenin在N- 端有一個(gè)序列，該序列是APC等的結(jié)合域。但是實(shí)驗(yàn)證明，缺乏APC結(jié)合區(qū)的β- catenin仍然會(huì)被APC誘導(dǎo)降解，這就提示我們，APC誘導(dǎo)β- catenin降解的作用不僅可以通過(guò)直接與β- catenin結(jié)合產(chǎn)生，而且可以通過(guò)其它 間接途徑產(chǎn)生。目前推測(cè)這種間接途徑是經(jīng)conductin/axin對(duì)β- catenin產(chǎn)生影響[8]。(2)通過(guò)NF- κB等通路影響炎癥反應(yīng)的過(guò)程從而影響正畸過(guò)程中的破骨啟動(dòng)。目前對(duì)于GSK- 3β在該系統(tǒng)中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制并不清楚，但實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在NF- κB系統(tǒng)中，如果出現(xiàn)GSK- 3β的缺失，將會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞對(duì)TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡非常敏感[9]。而TNF是正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中非常重要的細(xì)胞因子。(3)影響巨噬細(xì)胞的極化來(lái)影響牙齒移動(dòng)。周彥恒等[10]發(fā)現(xiàn)當(dāng)在正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中注射巨噬細(xì)胞抑制劑時(shí)，牙齒移動(dòng)距離和破骨細(xì)胞量明顯減少；而當(dāng)在正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中注射M1型巨噬細(xì)胞時(shí)牙齒移動(dòng)近距離明顯增加。而且GSK- 3β是巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子[11]。(4)通過(guò)影響神經(jīng)效應(yīng)進(jìn)而改變過(guò)改建。周彥恒等[12]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)可以影響正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程，而且GSK- 3β在神經(jīng)發(fā)育方面也有重要作用[3]。

3.3 展望

正畸牙齒移動(dòng)的主要影響因素還未明確，如今研究重點(diǎn)大多放在各種藥物如何影響破骨上，而巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，而且周彥恒等的最新研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的極化可以影響正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中的破骨和牙根吸收，這正好和GSK- 3β的效果相符，而且GSK- 3β是巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子，丁寅等研究也發(fā)現(xiàn)在正畸大鼠牙齒移動(dòng)過(guò)程中iNOS發(fā)生顯著變化[13]，而iNOS是巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)因子，因此下一步研究可以重點(diǎn)放在GSK- 3β是否影響巨噬細(xì)胞極化上，這不僅有利于對(duì)正畸過(guò)程的進(jìn)一步研究，而且對(duì)于巨噬細(xì)胞的研究也有重要意義。