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基因編輯技術(shù)簡介

2017-03-20 21:13陳兆亮康珍
中學(xué)生物學(xué) 2017年2期
關(guān)鍵詞:靶位核酸酶鋅指

陳兆亮+康珍

摘 要 基因編輯技術(shù)是對基因組進(jìn)行精確定點(diǎn)改造的一項(xiàng)新技術(shù),同時(shí)也是研究基因生物功能的一個有力工具。經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展,目前主要有鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶和RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas核酸酶技術(shù)三種新型的基因編輯技術(shù)。綜述了三種技術(shù)的結(jié)構(gòu)原理和作用機(jī)理,并對基因編輯技術(shù)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 基因編輯 鋅指核酸酶 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 CRISPR/Cas9核酸酶

中圖分類號 Q-49 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 E

基因編輯是指對基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的一項(xiàng)新技術(shù)。利用該技術(shù),可以精確地定位到基因組的某一位點(diǎn)上,在這位點(diǎn)上剪斷靶標(biāo)DNA片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變,又修改并編輯了原有的基因組,真正達(dá)成了“編輯基因”。

1 研究背景

近年來,隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,研究人員正通過定點(diǎn)突變的方法使目的基因完全失活來研究特定基因的功能,這是一種最直接有效的研究方法。隨著高特異性及更具操作性的人工核酸酶的出現(xiàn)和技術(shù)體系的完善,基因編輯技術(shù)獲得了飛速發(fā)展,并將靶向基因操作推向高潮,使得定點(diǎn)基因敲除、敲入變得更為簡單且高效。與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細(xì)胞(ES)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比,基因編輯新技術(shù)保留了可定點(diǎn)修飾的特點(diǎn),并應(yīng)用到更多的物種上,效率更高,構(gòu)建時(shí)間更短,成本更低。

2 基因編輯原理

現(xiàn)代基因編輯技術(shù)的基本原理是相同的,即借助特異性DNA雙鏈斷裂(DSB)激活細(xì)胞的天然修復(fù)機(jī)制,包括非同源末端連接(NHEJ)和同源重組修復(fù)(HDR)兩條途徑。

2.1 非同源末端連接

非同源末端連接是一種低保真度的修復(fù)過程,斷裂的DNA修復(fù)重連的過程中會發(fā)生堿基隨機(jī)地插入或丟失,造成移碼突變,使基因失活,實(shí)現(xiàn)目的基因敲除。如果一個外源性供體基因序列存在,NHEJ機(jī)制會將其連入雙鏈斷裂DSB位點(diǎn),從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的基因敲入。

2.2 同源重組修復(fù)

同源重組修復(fù)是一種相對高保真度的修復(fù)過程,在一個帶有同源臂的重組供體存在的情況下,供體中的外源目的基因會通過同源重組過程完整地整合到靶位點(diǎn),不會出現(xiàn)隨機(jī)的堿基插入或丟失。若在一個基因兩側(cè)同時(shí)存在DSB及同源供體的情況下,可以進(jìn)行原基因的替換。

3 基因編輯技術(shù)的種類

目前主要有3種基因編輯技術(shù),分別為人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶(ZFN)技術(shù);轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)技術(shù);RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas核酸酶技術(shù)(CRISPR/Cas RGNs)。

3.1 ZFN基因組編輯技術(shù)

ZFN技術(shù)是第一代基因編輯技術(shù),是基于鋅指蛋白發(fā)展起來的。1986年,Diakun等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2/His2鋅指模塊。1996年,Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。2005年,Urnov等發(fā)現(xiàn)一對由4個鋅指連接而成的ZFN,可識別24 bp的特異性序列,由此揭開了ZFN在基因編輯中的應(yīng)用。

ZFN由鋅指蛋白(ZFP)和FokⅠ核酸內(nèi)切酶組成。其中,由ZFP構(gòu)成的DNA識別域能識別DNA特異位點(diǎn)并與之結(jié)合,而由FokⅠ構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能,兩者結(jié)合可使靶位點(diǎn)的雙鏈DNA斷裂。于是,細(xì)胞可以通過同源重組修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接修復(fù)機(jī)制來修復(fù)DNA。HDR修復(fù)有可能會對靶位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾,而NHEJ修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變,由此達(dá)到基因敲除的目的。

ZFN誘導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點(diǎn)的編譯,具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但是目前?個缺陷制約了該技術(shù)的推廣:① 以現(xiàn)有的策略設(shè)計(jì)高親和性的ZFN,需投入大量的工作和時(shí)間;② 在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)ZFN對細(xì)胞有毒性;③ 雖然三聯(lián)體設(shè)計(jì)具有一定特異性,但仍存在不同程度的脫靶效應(yīng)。

3.2 TALEN基因組編輯技術(shù)

2009年,研究者在植物病原體黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活子樣因子效應(yīng)物,是特異識別DNA序列的基礎(chǔ)。TALEN識別模塊一般由34個氨基酸組成,其中第12、13位氨基酸高度可變,被稱為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基(RVD)。RVD決定了對特異性核苷酸的識別,其與A、G、C、T有恒定的對應(yīng)關(guān)系,如即NI識別A,NG識別T,HD識別C,NN識別G。隨后,TALEN特異識別DNA序列的特性被用來取代ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它的可設(shè)計(jì)性更強(qiáng),不受上下游序列的影響,具備比ZFN更廣闊的應(yīng)用潛力。

TALEN包含2個TALEN蛋白,每個TALEN都是由TALE array與FokⅠ融合而成。在進(jìn)行基因編輯時(shí),其中一個TALEN靶向正義鏈上的靶位點(diǎn),另一個則靶向反義鏈上的靶位點(diǎn)。然后FokⅠ形成二聚體,在靶向序列中間的spacer處切割DNA,造成雙鏈DNA斷裂,隨后細(xì)胞啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制,F(xiàn)okⅠ針對不同的TALEN骨架,其最適宜的spacer長度不同,其長度范圍一般為12~20 bp。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TALEN在靶向DNA時(shí),第一個堿基為T時(shí)其結(jié)合效果更佳。

目前,TALEN已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、哺乳動物和植物的特異性位點(diǎn)來進(jìn)行基因打靶,與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大的應(yīng)用優(yōu)勢,但仍然有些問題需要解決,例如脫靶效應(yīng)、TALEN與基因組進(jìn)行特異結(jié)合受鄰近序列影響等。

3.3 CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是最近生命科學(xué)領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)話題,該項(xiàng)技術(shù)的興起使基因編輯領(lǐng)域得到飛躍發(fā)展。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)源于對細(xì)菌與古生菌的研究。早在1987年,日本的研究人員發(fā)現(xiàn)E.coli中存在一些29 bp的重復(fù)序列,但他們當(dāng)時(shí)并不清楚這些序列的具體功能,經(jīng)過幾十年的研究,在2007年終于證明這種重復(fù)序列與細(xì)菌的獲得性免疫有關(guān)。

2002年,Jansen等將這些間隔排列的重復(fù)序列命名為CRISPR,并且鑒定出了與CRISPR序列位于同一基因簇的CRISPR相關(guān)蛋白Cas,同時(shí)將CRISPR基因簇分為三個不同的類型(Ⅰ型、Ⅱ型與Ⅲ型),在三種不同類型的CRISPR系統(tǒng)中,Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)最為簡單。

CRISPR/Cas9為一種可編輯的短RNA介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶,由Cas9核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成。轉(zhuǎn)錄的sgRNA折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與Cas9蛋白形成復(fù)合體,指導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶識別特定靶位點(diǎn),在間隔序列毗鄰區(qū)(PAM)序列上游切割DNA,造成雙鏈DNA斷裂,并啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制。

經(jīng)研究,從不同菌種中分離的CRISPR/Cas系統(tǒng),其CrRNA(或者是人工構(gòu)建的sgRNA)靶向序列的長度不同,PAM序列也可能不同。

4 基因編輯技術(shù)的展望

隨著越來越多物種基因組測序的完成,基因功能的研究成為后基因時(shí)代的重點(diǎn)?;蚓庉嫾夹g(shù)既可以用正?;蛱娲蛔兓蜻M(jìn)行性狀改良和基因治療,也可以用突變基因代替正常基因進(jìn)行基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)相比,基因編輯技術(shù)擺脫了對ES細(xì)胞的限制,可以應(yīng)用于更多的物種,且定向修飾更加精確,效率更高,所需時(shí)間更短,得到的突變可以通過種系遺傳。其中,CRISPR系統(tǒng)可以同時(shí)進(jìn)行多靶點(diǎn)的切割,易于得到純合子突變體。

伴隨基因編輯技術(shù)的發(fā)展,與之相關(guān)的多基因連接策略,表達(dá)調(diào)控策略等配套技術(shù)體系正在形成,為今后大規(guī)模,多基因動物的改良奠定了基礎(chǔ)。更多基因組編輯畜禽的出現(xiàn)會給畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì),人類營養(yǎng)水平和生活質(zhì)量帶來革命性地影響??梢灶A(yù)見,以基因編輯技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)將進(jìn)入黃金時(shí)期。

總之,基因編輯技術(shù)的研發(fā)還處于起步階段,但其已表現(xiàn)出的相對于基因打靶技術(shù)的優(yōu)勢已十分明顯。在未來的發(fā)展中,基因編輯技術(shù)必將成為生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究與應(yīng)用的重要工具。

參考文獻(xiàn):

[1] Miller J C, Holmes M C, Wang J, et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing[J]. Nature biotechnology, 2007,25(7): 778-785.

[2] Beerli R R, Barbas C F.Engineering polydactyl zinc-finger transcription factors[J]. Nature biotechnology, 2002,20(2): 135-141.

[3] Miller J C, Tan S, Qiao G, et al.A TALE nuclease architecture for efficient genome editing[J].Nature biotechnology,2011, 29(2): 143-148.

[4] Streubel J, Blücher C, Landgraf A, et al.TAL effector RVD specificities and efficiencies[J]. Nature biotechnology,2012,30(7): 593-595.

[5] Cermak T, Doyle E L, Christian M, et al.Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting[J].Nucleic acids research,2011.

[6] Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, et al.Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product[J]. Journal of bacteriology,1987,169(12): 5429-5433.

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