連大衛(wèi)+許藝飛+任文康+扶麗君+范平龍+操紅纓+黃萍

[摘要]探討廣藿香醇對于幽門螺桿菌Helicobacter pylori脲酶活性的抑制及其相關(guān)基因的表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究廣藿香醇對幽門螺桿菌定植感染的影響奠定基礎(chǔ)。培養(yǎng)幽門螺桿菌并采用革蘭染色、快速尿素酶及PCR的方法鑒定后，在酸性條件（pH 5.3）和中性條件（pH 7.0）培養(yǎng)液中給予不同濃度的廣藿香醇干預(yù)1 h，應(yīng)用瓊脂稀釋法測定細(xì)菌的存活率；Berthelot顯色法檢測細(xì)菌的脲酶活性；RT-qPCR法檢測細(xì)菌中ureA，ureB，ureE，ureH，ureI和nixA相關(guān)脲酶基因的表達(dá)變化。經(jīng)過鑒定生長良好幽門螺桿菌在不同濃度的廣藿香醇干預(yù)后， 細(xì)菌存活率沒有明顯變化；其脲酶活性出現(xiàn)了顯著的下降；同時脲酶的相關(guān)基因ureA，ureB，ureE，ureH，ureI和nixA的表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的降低。廣藿香醇在酸性條件和中性條件下均可以抑制幽門螺桿菌脲酶的活性，可能與降低細(xì)菌脲酶相關(guān)的基因表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]幽門螺桿菌； 脲酶； 廣藿香醇

[Abstract]To investigate the effect of patchouli alcohol on inhibiting Helicobater pylori urease activity， and its effect on expression levels of related genes， and lay the foundation for further research on the effect of patchouli alcohol on H. pylori colonization and infection. H. pyloriwas cultured and identified by gram staining， rapid urease test （RUT） and PCR method. Then agar dilution method was used to detect the bacterial survival after 1 h intervention by different concentrations of patchouli alcoholin the acidic （pH 5.3） and neutral （pH 7.0） conditions； berthelot method was used to detect urease activity and RT-qPCR method was used to detect the expression changes of ureA， ureB， ureE， ureH， ureI， and nixA related urease genes. The results showed that the survival rate of H. pyloriwas not significantly changed but the urease activity was obviously decreased after intervention by different concentrations of patchouli alcohol； meanwhile， the expression levels of ureA， ureB， ureE， ureH， ureI， and nixA were decreased to different degrees. Therefore， patchouli alcohol could inhibit H. pylori urease activity in both acidic and neutral conditions， and the mechanism may be related to down-regulation of urease gene expression.

[Key words]Helicobacter pylori； urease activity； patchouli alcohol

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）屬于彎曲桿狀的革蘭陰性微需氧細(xì)菌，定植于宿主的胃部，是世界范圍內(nèi)最常見的傳染性病原菌之一，全球有超過50%的人群感染。我國約有6億以上人口感染，且有呈逐年上升的趨勢^[1-2]。正常情況下人體的胃內(nèi)的pH大約在1～2，因此極少有細(xì)菌能夠在胃中存活下來，而H.pylori能夠在此環(huán)境下生存主要是依靠其能夠產(chǎn)生具有強(qiáng)大活性的脲酶^[3]，該種酶即使在胃液中也可以充分發(fā)揮分解胃液中少量的尿素而產(chǎn)生氨的作用，在幽門螺桿菌周圍形成一片“氨云”，中和胃酸保護(hù)細(xì)菌不被胃酸殺滅^[4]。脲酶占據(jù)整個細(xì)菌可溶蛋白的10%～15%，其不僅是區(qū)別于其他胃腸道微生物的主要特征，也是重要的定植和致病因子^[5-6]。廣藿香是中醫(yī)常用的芳香化濕類中藥，其主要藥效研究現(xiàn)多集中于其中的揮發(fā)油成分，廣藿香醇為廣藿香醇揮發(fā)油中含量最高的成分^[7]，各項研究顯示了廣藿香醇具有良好的抗菌、抗病毒、抗?jié)兊确矫娴淖饔?，具有多種生物活性^[8]。本實驗旨在觀察廣藿香醇對于H.pylori脲酶活性的抑制及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器和試劑 Campylobacter agar base（Oxoid，批號1589242）；無菌脫纖維羊血[平睿生物科技（北京）有限公司，批號20150917]；Brain-heart unfusion（Oxoid，批號1677862）；胎牛血清（Gibco，批號730840）；革蘭染色液試劑盒（海博生物，批號HB8278）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生物，批號DP302-2）；Super Real Pre Mix×Plus（天根生物，批號03120）；FastQuant RT Kit（天根生物，批號03326）；Trizol Reagent（Thermo Life technology，批號28218）；麥?zhǔn)媳葷醿x（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）； NU-5831E三氣培養(yǎng)箱（Nuaire）；生物安全柜（ESCO）；全波長酶標(biāo)儀（Thermo）； BioSpec-nano核酸分析儀（島京）；CFX 96實時熒光定量PCR儀器（Bio-Rad）。

1.2 細(xì)菌 H.pylori（SS1）由澳大利亞莫納什大學(xué)Richard Ferrero教授饋贈。

1.3 樣品的制備 廣藿香醇（HPLC>98%），由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究與開發(fā)中心蘇子仁教授提供。臨用前用溶解于DMSO，再配成20，10，5 mg·L^-1的含藥BHI培養(yǎng)液。

2 方法

2.1 幽門螺桿菌的復(fù)蘇和傳代 將凍存的幽門螺桿菌菌株從超低溫冰箱（-80 ℃）取出，復(fù)蘇于彎曲桿菌瓊脂培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，含7%脫纖維新鮮羊血及聯(lián)合抗生素（萬古霉素10 mg·L^-1，甲氧芐氨嘧啶5 mg·L^-1、頭孢磺啶5 mg·L^-1、兩性霉素5 mg·L^-1） 的血平板上，其中平板分為pH 7的中性平板和pH 5.3的酸性平板。倒置平板置于37 ℃，5%O₂，10%CO₂，85%N₂的培養(yǎng)箱中復(fù)蘇48～72 h。待細(xì)菌長滿平板后，使用一次性無菌棉簽刮取并重懸于的PBS中接種于新的血平板上，再生長48～72 h。

2.2 幽門螺桿菌菌株的鑒定 使用一次性接種環(huán)取部分細(xì)菌，于載玻片水滴上充分涂布均勻，酒精燈烤干。使用革蘭染色試劑盒染色細(xì)菌，于顯微鏡下使用油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)；取少量菌液置于快速脲素酶試劑里，37 ℃孵育4 h后觀察試劑顏色變化；同時取少量單菌落，按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA，使用引物16 s：5′-TATGACGGGTATCCGGC-3′和5′-ATTCCACTTACCTCTCCCA-3′，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃解鏈2 s，53 ℃退火2 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)。配制1.5%瓊脂糖凝膠，100 V，35 min，5 μL上樣量，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物目的長度為375 bp。

2.3 瓊脂稀釋法檢測幽門螺桿菌存活率 分別收集傳代生長的中性和酸性菌株于PBS之中，隨后冷凍離心（4 ℃，5 000×g，15 min）去除上清液并重懸于PBS中再洗滌2次。將酸性和中性菌株分別置于對應(yīng)的酸性（pH 5.3）和中性（pH 7）含10%血清的BHI培養(yǎng)液中，使用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)整細(xì)菌濃度均為1×108 CFU·mL^-1。加入不同劑量的廣藿香醇，使受試藥物濃度最終分別為20，10，5 mg·L^-1，對照組加入等體積的DMSO；放入微需氧環(huán)境中孵育1 h。隨后取出部分菌液等比例稀釋并涂板，再放入微需氧環(huán)境中培養(yǎng)3 d后進(jìn)行菌落計數(shù)，觀察廣藿香醇對幽門螺桿菌存活率的影響。

2.4 Berthelot顯色法檢測幽門螺桿菌脲酶活性 取部分與不同濃度的廣藿香醇共孵育的幽門螺桿菌菌液于離心管中，冷凍離心（4 ℃，5 000×g，15 min）洗滌3次后，置于-20 ℃保存過夜。第2天取出至室溫解凍后，超聲波振蕩冰浴3 min，冷凍離心（4 ℃，15 000×g，10 min）取上清液混合等體積甘油，在離心管中加入等體積尿素溶液（10 mmol·L^-1），混勻，室溫避光反應(yīng)20 min，然后加入依據(jù)參考文獻(xiàn)方法配制的Berthelot顯色液^[8]，混勻，室溫顯色10 min，吸取反應(yīng)液在酶標(biāo)儀上檢測其A635，脲酶殘余活性（residual activity）=（A樣本-A空白）/（A對照-A空白）×100%。

2.5 RT-qPCR法檢測幽門螺桿菌脲酶相關(guān)基因表達(dá) 取部分與廣藿香醇共孵育后的幽門螺桿菌菌液，經(jīng)過3次洗滌后去除上清液，加入1 mL Trizol試劑，參照Trizol說明書方法提取細(xì)菌的總RNA，在超紫外分光光度儀上測A260/A280達(dá)到1.8～2.0后，按逆轉(zhuǎn)入試劑盒操作方法得到其cDNA。引物設(shè)計：委托Takara公司設(shè)計并合成引物，具體引物序列見表1。

實時熒光定量RT-qPCR擴(kuò)增程序按照熒光定量檢測試劑盒進(jìn)行操作，在Bio-Rad熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。分析結(jié)果，得出各組內(nèi)參基因和目的基因C_t，運用2-ΔΔCt公式計算。

2.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差檢驗和最小顯著性差異法（LSD）及Dunnett′s；以P<0.05或P<0.01作為具有統(tǒng)計學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 幽門螺桿菌鑒定結(jié)果 涂片經(jīng)革蘭染色后，在油鏡下觀察幽門螺桿菌形態(tài)呈紅色彎曲桿狀，沒有發(fā)生球變。刮取菌株置于快速脲素酶反應(yīng)試劑內(nèi)，試劑變?yōu)樽霞t色；16s PCR擴(kuò)增可見在375 bp處有明顯的條帶。綜上表明該菌株為幽門螺桿菌且生長良好（圖1）。

3.2 廣藿香醇對幽門螺桿菌存活率的影響 與對照組相比，不管在酸性和中性條件下，廣藿香醇20，10，5 mg·L^-1均對幽門螺桿菌的存活率無明顯影響。

3.3 廣藿香醇對幽門螺桿菌中脲酶活性的影響 與對照組相比，廣藿香醇20，10 mg·L^-1在酸性和中性條件下均可以對幽門螺桿菌中脲酶活性產(chǎn)生明顯的抑制效果（表2）。

3.4 廣藿香醇對幽門螺桿菌脲酶相關(guān)基因表達(dá)的影響 與對照組相比，在酸性條件下廣藿香醇20，10，5 mg·L^-1均可以使幽門螺桿菌中ureB，ureE，ureI和nixA的基因表達(dá)出現(xiàn)顯著下降，廣藿香醇20 mg·L^-1可以明顯降低ureH基因表達(dá)；在中性條件下廣藿香醇20，10，5 mg·L^-1均可以使ureA， ureI和nixA基因表達(dá)出現(xiàn)顯著下降，廣藿香醇20，10 mg·L^-1可以使ureH基因表達(dá)明顯降低，廣藿香醇20 mg·L^-1可以明顯降低ureE的基因表達(dá)（表3，4）。

4 討論與結(jié)論

幽門螺桿菌脲酶是一種六聚體鎳金屬酶，相對分子質(zhì)量約為500～600 kDa^[9]，而脲酶基因簇由多個開放閱讀框架構(gòu)成，其中ureE，ureF，ureG，ureH 為輔助基因，編碼脲酶輔助蛋白；ureI 為幽門螺桿菌脲酶特有的基因，編碼脲酶特異性通道蛋白；ureA和 ureB 為結(jié)構(gòu)基因，編碼脲酶結(jié)構(gòu)蛋白。細(xì)菌體內(nèi)的脲酶成熟過程由細(xì)菌內(nèi)膜上的高親和力鎳轉(zhuǎn)運蛋白NixA獨立從外界攝取Ni²⁺進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)開始，通過形成二聚體的輔酶蛋白UreE將Ni²⁺傳遞給由輔酶蛋白UreF，UreG和UreH組成的復(fù)合體，輔酶蛋白復(fù)合體攜帶Ni²⁺與脲酶前體蛋白（由結(jié)構(gòu)蛋白UreA和UreB構(gòu)成）的活性中心結(jié)合后將攜帶的Ni²⁺留在脲酶前體蛋白活性中心，促使其成熟并發(fā)揮分解尿素的生物學(xué)功能。UreI 為酸激活蛋白，在酸性條件下，UreI 被激活而開啟通道，加速轉(zhuǎn)運尿素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，最大化脲酶活動水平^[10-11]?；罨碾迕覆粌H其水解的產(chǎn)物可直接損害組織，同時也可以激活單核細(xì)胞，導(dǎo)致免疫炎性遞質(zhì)和超氧自由基的分泌，促使空泡的形成介導(dǎo)胃上皮細(xì)胞凋亡。

在前期實驗中，課題組已經(jīng)證實廣藿香醇具有體外抑制脲酶活性的作用^[12]，本實驗重點探討廣藿香醇是否具有抑制幽門螺桿菌脲酶活性并對脲酶相關(guān)基因表達(dá)的影響。與對照組相比，不管在酸性或中性的條件下，廣藿香醇20，10，5 mg·L^-1在與幽門螺桿菌其共孵育的1 h均沒有抑菌或殺菌作用，但20，10 mg·L^-1出現(xiàn)了明顯的脲酶活性抑制效果，說明廣藿香醇在酸性和中性的條件下都可以特異性抑制幽門螺桿菌脲酶的活性。為了探討其作用機(jī)制是否與抑制脲酶成熟過程有關(guān)，本實驗在不同的條件下檢測廣藿香醇對幽門螺桿菌的脲酶成熟過程所需相關(guān)基因表達(dá)變化的影響，結(jié)果顯示酸性條件下廣藿香醇對結(jié)構(gòu)基因ureB的表達(dá)有顯著的抑制作用，而在中性條件下能明顯降低結(jié)構(gòu)基因ureA的表達(dá)，同時不論條件如何，均可以不同程度的抑制脲酶輔酶基因ureE，ureH，鎳離子轉(zhuǎn)運基因nixA和尿素轉(zhuǎn)運基因ureI的表達(dá)，其中以廣藿香醇20，10 mg·L^-1作用更加明顯；因此表明廣藿香醇具有抑制幽門螺桿菌脲酶活性，可能不僅通過影響脲酶結(jié)構(gòu)基因ureA和ureB的表達(dá)，而且與抑制脲酶輔酶基因ureE，ureH以及鎳離子轉(zhuǎn)運基因nixA，從而阻斷鎳離子轉(zhuǎn)運入脲酶前體的活性中心的途徑，抑制其成熟有關(guān)；同時抑制尿素轉(zhuǎn)運基因ureI，減少尿素與脲酶的接觸，進(jìn)而抑制其分解作用。

鑒于活化后的脲酶在幽門螺桿菌致病過程的重要作用，廣藿香醇不僅作為植物源性的化合物具有較低的毒性^[13]，且具有下調(diào)與Ni²⁺轉(zhuǎn)運的脲酶相關(guān)基因表達(dá)，阻斷脲酶成熟過程，從而高選擇性抑制其脲酶活性的作用。研究顯示，Ni²⁺及相關(guān)輔助蛋白對脲酶活性極其重要，阻斷脲酶活性位點上的Ni²⁺與脲酶亞基的結(jié)合能有效抑制脲酶活性^[14]，因此繼續(xù)對廣藿香醇進(jìn)行深入的結(jié)構(gòu)改造及構(gòu)效關(guān)系研究，有可能開發(fā)成新一代的脲酶抑制劑，為從中藥中研發(fā)抗幽門螺桿菌感染及相關(guān)疾病的創(chuàng)新藥物奠定重要的基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]