劉興辰+高靜賢+劉茜

摘要：藥品包裝材料上市前需要做風(fēng)險(xiǎn)管理過程中的評價(jià)，評價(jià)中包括對其生物學(xué)安全性的評定。熱原屬于生物學(xué)評價(jià)中的一個(gè)重要檢測項(xiàng)目。本文以需要高溫滅菌處理的幾種藥品包裝材料為樣品，對清洗和未清洗的兩組樣品滅菌后進(jìn)行兔熱原試驗(yàn)以及細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)。結(jié)果表明，未清洗樣品會(huì)對熱原產(chǎn)生影響。

關(guān)鍵詞：熱原；細(xì)菌內(nèi)毒素

1 熱原檢查法（兔熱原法）

1.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.1.1樣品來源 ①注射用冷凍干燥用覆聚四氟乙烯乙烯膜氯化丁基橡膠塞，批號(hào)：M150331122-78（江蘇華蘭藥用新材料股份有限公司）；②藥用合成聚異戊二烯墊片，批號(hào)：150353515-16（江蘇華蘭藥用新材料股份有限公司）。

1.1.2動(dòng)物來源 南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場（許可證號(hào)SCXK（蘇）2012-0008）、合格證號(hào)：201505970、201506377、201506729，顆粒飼料，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場提供。

1.1.3器具除熱原 與供試品接觸的所有玻璃器皿置電熱干燥箱內(nèi)250℃干烤30 min（實(shí)驗(yàn)前1 d）。

1.1.4實(shí)驗(yàn)分組 注射用冷凍干燥用覆聚四氟乙烯乙烯膜氯化丁基橡膠塞（下面簡稱橡膠塞）、藥用合成聚異戊二烯墊片（下面簡稱墊片）拆開包裝，用純化水清洗后，暴露在空氣中（普通環(huán)境）3 d。①橡膠塞未再洗；②橡膠塞經(jīng)純化水水洗；③墊片未再洗；④墊片經(jīng)純化水水洗。

1.1.5浸提介質(zhì)（浸提液） 氯化鈉注射液（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司），規(guī)格：500 ml，批號(hào)：150129 5T。

1.1.6供試品浸提液制作方法 橡膠塞：將供試品用純化水沖洗干凈后，用濾紙吸干，置浸提容器內(nèi)。供試品置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，115℃滅菌30 min后，按0.2 g/ml比例加入浸提液，使液體浸沒供試品。浸提條件37℃，24 h。

墊片：將供試品用純化水沖洗干凈后，用濾紙吸干，切成0.5 mm×3 cm條狀，置浸提容器內(nèi)。供試品置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，115℃滅菌30 min后，按規(guī)定量加入浸提液，使液體浸沒供試品。浸提條件37℃，24 h。

1.1.7供試用家兔及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境 供試用的家兔應(yīng)健康合格，體重1.7 kg以上，雌兔應(yīng)無孕。預(yù)測體溫前7 d即應(yīng)用同一飼料飼養(yǎng)，在此期間內(nèi)，體重應(yīng)不減輕，精神、食欲、排泄等不得有異常現(xiàn)象。家兔之前均未曾用于熱原檢查，經(jīng)過預(yù)測體溫，挑選合格供試用家兔。在熱原檢查前2 d內(nèi)，供試用家兔處于同一溫度的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)室和飼養(yǎng)室的溫度相差1℃以內(nèi)，溫度均在（21±1）℃。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 取適用的家兔3只，測定其正常體溫符合要求后15 min以內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入溫?zé)嶂良s38℃的供試品溶液，注射劑量為10 ml//kg。然后每隔30 min按前法測量其體溫1次，共測6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔的升高溫度（℃）。如3只家兔中有1只溫度升高0.6℃或高于0.6℃，或3只家兔體溫升高的總和達(dá)1.3℃或高于1.3℃，應(yīng)另取5只家兔復(fù)試。檢查方法同上。

1.3結(jié)果 在初試的3只家兔中，體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總和低于1.3℃；或在復(fù)試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超過1只，并且初試、復(fù)試合并8只家兔的體溫升高總和為3.5℃或低于3.5℃，均判定供試品的熱原檢查符合規(guī)定。在初試的3只家兔中，體溫升高0.6℃或高于0.6℃的家兔超過1只；或在復(fù)試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或高于0.6℃的家兔超過1只；或在初試、復(fù)試合并8只家兔的體溫升高總和超過3.5℃，均判定供試品的熱原檢查不符合規(guī)定。當(dāng)家兔升溫為負(fù)值時(shí)，均以0計(jì)。

2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

2.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

2.1.1樣品來源 聚丙烯輸液瓶（由江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供），規(guī)格均為250 ml，批號(hào)為14081424、14081518、14081609。

2.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 混和器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）ZH-2，細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法測定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）ET-96，潔凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）SW-CJ-2F，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）規(guī)格：GH6000，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）DHG-143BS-III。

2.1.3器具除熱原 與供試品接觸的所有玻璃器皿置電熱干燥箱內(nèi)250℃干烤30 mim（實(shí)驗(yàn)前1 d）。

2.1.4供試品浸提液制作方法：取輸液容器剪成0.5 cm×3 cm小條，按內(nèi)表面積（cm2）與水（6：1）混合，經(jīng)（121±2）℃，60 min滅菌，放冷，備用，作為試驗(yàn)液，并用同批水作為空白液。

2.1.5供試品細(xì)菌內(nèi)毒限值 每1 ml供試液中含內(nèi)毒素不得過0.25EU。

2.2實(shí)驗(yàn)方法 凝膠法-通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理進(jìn)行限度檢測或半定量檢測內(nèi)毒素的方法。

按表1制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)不超過MVD（確定最大有效稀釋倍數(shù)）并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見圖1。

2.4結(jié)果判斷 保溫（60±2）min后觀察結(jié)果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗(yàn)有效。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管中一管為陽性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。

3 討論

常用的三種熱原檢測方法，限于設(shè)備、試劑等條件，我們只能進(jìn)行其中兩種-熱原檢查法（兔熱原法）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法進(jìn)行熱原檢測。

雖然我們不能說未清洗就滅菌的熱原檢測就一定不合格，一定會(huì)給使用者帶來各種熱原反應(yīng)的后果，但禍生于懈慢，藥品包裝材料的好壞直接關(guān)系到使用者的生命安危，防微杜漸，我們需要做的更多。

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編輯/蔡睿琳