吳 琪，曹廣英，唐月異，王秀貞，孫全喜，王志偉，陳劍洪，姜啟雙，王傳堂

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；3.福建省泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 泉州362212；4.山東省臨沭縣農(nóng)業(yè)局，山東 臨沭 276700)

鈣是細(xì)胞信號傳導(dǎo)中重要的第二信使，在很多胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)中起重要作用[1-2]。通過對細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度的精細(xì)調(diào)控，細(xì)胞將遺傳信號轉(zhuǎn)化為特定的細(xì)胞事件，其中負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度升高的流入系統(tǒng)主要包括鈣離子通道(Ca2+channels)，Ca2+濃度降低的流出系統(tǒng)主要包括鈣泵(Ca2+pumps)和反向轉(zhuǎn)運蛋白(antiporters)[3]。Cation exchanger(CAX)是一種定位于生物膜(液泡膜，質(zhì)膜)的反向轉(zhuǎn)運蛋白，選擇性轉(zhuǎn)運Ca2+等陽離子，該基因首先在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Ca2+敏感型突變體中被克隆[4-5]。在Ca2+完成信使作用后，CAX主要參與Ca2+轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)和胞外的鈣庫，使細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+恢復(fù)到靜息電位，為下一次信號的起始做好準(zhǔn)備，同時解除了離子對細(xì)胞的毒害作用，保證胞內(nèi)各種生理、生化反應(yīng)順利進(jìn)行，對Ca2+信號傳導(dǎo)和細(xì)胞正常生理、生化活動起重要作用[2]。CAX interacting protein(CXIP)是一類能夠激活CAX的鈣離子轉(zhuǎn)運活性的蛋白，也在離子轉(zhuǎn)運體系中起重要作用。在模式生物擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，AtCAX1的N末端調(diào)節(jié)區(qū)域能被CXIP4(CAX interacting protein 4)激活[6-8]。本研究獲得了花生CXIP4基因全長序列，對其組織表達(dá)及脅迫表達(dá)情況進(jìn)行了分析，并構(gòu)建了其過表達(dá)載體、反義干擾載體以及原核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究該基因在花生青枯病中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

花生材料為栽培品種日花1號，菌株為日照青枯菌菌株[9]。

1.2 青枯菌活化

將-80℃保存的青枯菌菌株劃線培養(yǎng)于YGPA培養(yǎng)基上(葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，酵母提取物0.5%，瓊脂1.8%，pH7.2)，28℃培養(yǎng)48h。挑單菌落于5 mL YGPA液體培養(yǎng)基中活化，28℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。取1mL菌液于50 mL YGPA液體培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)約4 h，使用顯微鏡和血球計數(shù)器將培養(yǎng)好的青枯菌菌液稀釋到終濃度為109CFU。

1.3 總RNA提取

取花生種子1粒，液氮下研磨成粉，取0.1g粉末，向其中加入800μL SDS提取液及125μL β-巰基乙醇，旋渦混勻，靜置1 min，4℃ 15000 r/min離心5 min；吸取上清，并加入500μL氯仿和500μL Tris-飽和酚，混勻、靜置，4℃ 12000 r/min離心5 min；取上清，加入400 μL 3 mol/L醋酸鈉(pH 4.8)、500μL氯仿及500 μL水飽和酚，混勻，靜置，4℃ 12000 r/min離心5 min；取上清加入等體積異丙醇，-20℃沉淀，4℃ 12000 r/min離心10 min，棄上清；用1 mL 75%乙醇漂洗沉淀，風(fēng)干后加入50 μL ddH2O溶解。按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4 cDNA序列和DNA序列獲得

根據(jù)Genefishing技術(shù)獲得的EST序列(已包括3'末端序列)，使用premier primer 5.0軟件，設(shè)計5'RACE基因特異性引物GSP1和GSP2(附表)。反應(yīng)體系(25 μL)為2.5 μL 10×Buffer(Mg2+)(Takara，Japan)，1.5 μL dNTP(Takara)，2.5 μL UPM(10×)，0.5μL GSP1/GSP2(10 μmol/L)，1.0 μL 5'-RACE-Ready cDNA(30 ng/μL)，17 μL ddH2O，0.25μL rTaq(Takara)。第一輪反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性30 s，72℃延伸3 min，5個循環(huán)；94℃變性30 s，70℃退火30 s，72℃延伸3 min，5個循環(huán)；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸3 min，25個循環(huán)。第二輪反應(yīng)反應(yīng)程序為：94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸3 min，30個循環(huán)。反應(yīng)完成后，使用添加1μL Super GelRed (US， Everbright Inc)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，純化后進(jìn)行克隆測序。

使用BioEdit 7.0.9.0軟件[10]將測序結(jié)果進(jìn)行拼接。根據(jù)拼接序列設(shè)計基因全長引物F/R(附表)，分別以cDNA和DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將得到的PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測，并純化后進(jìn)行克隆測序。

1.5 序列分析

序列多重比對采用ClustalX軟件進(jìn)行分析；用Protparam程序(http://www. expasy.ch/tools/protparam.html)對蛋白的基本物理化學(xué)性質(zhì)預(yù)測；蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用Predictprotein (http://www.predic-tprotein.org)，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測由SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)完成，Plant-mPLoc程序預(yù)測基因亞細(xì)胞定位情況(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 組織表達(dá)及脅迫表達(dá)情況

挑選大小均勻的種子，先用70%酒精浸泡20s，再用0.1%的升汞浸泡10 min進(jìn)行表面消毒，用無菌水漂洗5次。

組織表達(dá)：將種子催芽萌發(fā)后播種，置于25℃，12h光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。30d后取9株長勢無明顯差異植株，隨機(jī)分為3組，分別取其根、莖、葉組織，經(jīng)液氮速凍后，放于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

脅迫表達(dá)：取48粒種子催芽萌發(fā)，出芽后移至清水中，25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔1d換一次水，培養(yǎng)45d后，將花生植株隨機(jī)等分為兩組。采用傷根灌菌法，將兩組花生主根用刀片劃1 mm左右切口，其中實驗組置于青枯菌菌液中，對照組放入無菌水中。按以下時間分別取樣：0 h、0.5 h、1h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h，每個時間點分別從實驗組和對照組各取3個植株根部組織，液氮速凍，放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

提取上述材料的總RNA，并根據(jù)試劑盒操作手冊反轉(zhuǎn)錄得到cDNA(abm，Canada)，利用DEPC處理水將cDNA稀釋10倍用于熒光定量實驗。

熒光定量PCR(qRT-PCR)使用Applied Biosystems 7500 Fast熒光定量PCR儀進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(20 μL)為：10 μL EvaGreen 2×qPCR MasterMix(Abm，Canada)，qF和qR(附表)引物各0.5 μL，1.0 μL cDNA模板，8 μL ddH2O，用β-actin作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt算法[11]，每個樣品重復(fù)3次取平均值。

1.7 載體構(gòu)建

以cDNA為模板，利用過表達(dá)引物oeF/oeR及反義表達(dá)引物iF/iR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化產(chǎn)物。將載體pCAMBIA2300進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系(50 μL)為：5 μL10×CutSmartTMBuffer(NEB，UK)，1 μL內(nèi)切酶BamHI-HF，10 μL載體pCAMBIA2300質(zhì)粒，34 μL ddH2O。將上述體系混合后，37℃酶切5h。將酶切載體pCAMBIA2300純化后與PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行連接實驗，反應(yīng)體系(10 μL)為：2 μL 5×In-Fusion HD Enzyme Premix(Takara，Japan)，3 μL PCR純化產(chǎn)物，1 μL酶切載體pCAMBIA2300，4 μL ddH2O。將上述體系混和后50℃水浴15min，再冰浴10min。將上述連接液轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞(Transgen Biotech, Beijing)，PCR鑒定得到的陽性單菌落搖菌并提取質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105中，28℃倒置培養(yǎng)3 d，進(jìn)行PCR篩選，獲得陽性菌落。 原核表達(dá)載體構(gòu)建使用pF/pR引物擴(kuò)增基因cDNA全長，產(chǎn)物純化后，與原核表達(dá)載體pEASY-Blunt E1(Transgen Biotech)連接并轉(zhuǎn)化Trans1-T1(Transgen Biotech)原核表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞。連接體系為(5μL)：載體1μL，PCR產(chǎn)物4μL，25℃ 5min。經(jīng)PCR篩選，獲得陽性菌落。

附表 試驗中所用的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 CXIP4基因cDNA序列及DNA序列

CXIP4基因cDNA序列包含一個966 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼321個氨基酸(圖1)。預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量大小為36706.24 Da，等電點為9.62。由SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)建立的CXIP4基因的3D模型如圖2，其二級結(jié)構(gòu)中包含α-螺旋34.89%，無規(guī)則卷曲48.29%，β-轉(zhuǎn)角7.48%(圖2)。CXIP4基因DNA序列無內(nèi)含子。氨基酸組成顯示：其富含Arg(13.66%)、Lys(12.11%)、Asp(12.42%)、Ser(13.04%)。N端包含一個鋅指結(jié)構(gòu)域CCHC(84-100)。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示其定位在細(xì)胞核。

圖1 CXIP4基因cDNA序列 Fig. 1 cDNA sequence for CXIP4 gene from A. hypogaea

圖2 (a)CXIP4基因的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測； (b)CXIP4 3D結(jié)構(gòu)預(yù)測 Fig. 2 (a) The secondary structure prediction of CXIP4 from A. hypogaea; (b) Predicted 3D structure of CXIP4 protein of A. hypogaea 注： h: α-螺旋；e: 延伸鏈；t: β-轉(zhuǎn)角；c: 無規(guī)則卷曲 Notes: h: alpha helix; e: extended strand; t: beta turn; c: random coil

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載來自其他物種的CXIP4基因cDNA序列。使用ClustalX程序進(jìn)行比對，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖3所示，CXIP4基因序列相對保守，尤其是在豆科植物中。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示(圖4)，花生CXIP4基因與大豆CXIP4基因、鷹嘴豆CXIP4基因、百脈根CXIP4基因聚在一起，說明此基因在豆科中高度保守且具有較近的親緣關(guān)系；而二倍體棉花單獨為一支。

圖3 CXIP4基因序列比對 Fig. 3 The alignment of the amino acid sequences of CXIP4注：大豆(Glycine max，XM_003536681.3)；鷹嘴豆(Cicer arietinum，XM_004497167.2)；百脈根(Lotus japonicus，BT142030.1)；二倍體棉花(Gossypium raimondii，XR_001132960.1)Notes: The sequences used are as follows: Glycine max (XM_003536681.3), Cicer arietinum (XM_004497167.2)，Lotus japonicus(BT142030.1)，Gossypium raimondii(XR_001132960.1)

圖4 鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建CXIP4基因系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig. 4 Consensus Neighbor-Joining (NJ) tree for CXIP4 gene

2.3 組織表達(dá)及脅迫表達(dá)

用熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測CXIP4基因組織表達(dá)和脅迫表達(dá)。結(jié)果顯示CXIP4基因在花生葉片中表達(dá)量最高，是根中的4倍(圖5)。在青枯菌脅迫條件下該基因在0.5 h表達(dá)量突增到起始值的3.4倍，在3 h和6 h表達(dá)量又趨于下降，而后在12 h時又有所上升，在48 h表達(dá)量達(dá)到起始值的1.7倍，未恢復(fù)到初始水平 (圖6)。

2.4 過表達(dá)載體及反義表達(dá)載體構(gòu)建

以cDNA為模板，分別用過表達(dá)引物oeF/oeR及反義表達(dá)引物iF/iR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化并與酶切后的pCAMBIA2300載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后篩選陽性菌落(圖7左)，并提取構(gòu)建好的過表達(dá)載體質(zhì)粒和反義表達(dá)載體質(zhì)粒(圖7右)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105。

圖5 CXIP4基因組織表達(dá)分析 圖6 CXIP4基因青枯菌脅迫表達(dá)情況 Fig. 5 The expression level of CXIP4 gene Fig. 6 The expression profile of CXIP4 gene mRNA transcripts in roots, stems and leaves in R. solanacearum treated roots

圖7 PCR鑒定大腸桿菌陽性菌落(左)以及重組質(zhì)粒提取(右) Fig. 7 The identification of positive E.coli clonies (left) and the extraction of recombinants (right)注：左：M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker)；泳道1: CXIP4基因過表達(dá)載體插入片段；泳道2: CXIP4基因反義表達(dá)載體插入片段。右：M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker)；泳道1: 過表達(dá)載體質(zhì)粒；泳道2: 反義表達(dá)載體質(zhì)粒。Notes: Left: M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker); Lane 1: the inserts of CXIP4 overexpression vector; Lane 2: the inserts of CXIP4 antisense expression vector. Right: M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker); Lane 1: the extraction of an overexpression vector recombinants in E. coli; Lane 2: the extraction of an antisense expression vector recombinants in E. coli.

圖8 PCR鑒定農(nóng)桿菌陽性菌落 圖9 PCR鑒定原核表達(dá)的陽性菌落Fig. 8 The identification of Agrobacterium positive clonies Fig. 9 The identification of prokaryotic 注：M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker)； expression vector positive clonies 泳道1: CXIP4基因過表達(dá)載體插入片段； 注：M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker)；泳道2: CXIP4基因反義表達(dá)載體插入片段 泳道1-2: CXIP4基因原核表達(dá)載體插入片段Notes: M: Marker (Trans 2K Plus II DNA Maker); Notes: M: Marker (Trans 2K Plus II Lane 1: the inserts of an overexpression vector DNA Maker); Lane 1-2: the inserts in Agrobacterium; Lane 2: the inserts of an of CXIP4 prokaryotic expression vector.antisense expression vector in Agrobacterium.

2.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用設(shè)計好的原核表達(dá)引物pF和pR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行產(chǎn)物純化，將載體pEASY-Blunt E1 Expression Vector與PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行連接實驗，轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞后篩菌，得到的陽性單菌落PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測，分析得到目的條帶如圖9所示。

3 討 論

CAX在維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的動態(tài)平衡中起至關(guān)重要的作用[8]。在擬南芥中CXIP4能夠激活CAX1的反向離子轉(zhuǎn)運活性[2, 12]。研究表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與植物生長、發(fā)育以及生物脅迫和非生物脅迫下的抗性有相關(guān)性[13-16]。本研究中CXIP4基因是使用Genefishing技術(shù)分離得到的花生青枯病抗性相關(guān)基因，推測其可能通過對CAX的激活作用調(diào)節(jié)Ca2+濃度，改變植物體內(nèi)的信號，從而調(diào)節(jié)植株抗病能力。本研究得到的CXIP4氨基酸序列在豆科植物中具有高度保守性，并利用qRT-PCR分析了其在花生品種“日花1號”植株中的組織表達(dá)和青枯菌脅迫條件下的表達(dá)變化規(guī)律，結(jié)果顯示，CXIP4基因在花生葉片中表達(dá)量最高，在青枯菌脅迫條件下該基因在0.5 h表達(dá)量突增到起始值的3.4倍，并構(gòu)建該基因過表達(dá)載體、反義干擾載體以及原核表達(dá)載體，這為后續(xù)研究該基因在花生Ca2+轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)以及其在花生抗青枯病中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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