徐 平，尹 亮，石延茂，任 艷，王效華，李雙鈴，袁 美

(山東省花生研究所/農(nóng)業(yè)部花生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100)

花生是我國重要的油料作物、經(jīng)濟(jì)作物和出口創(chuàng)匯作物。我國花生總產(chǎn)量的55%用于榨油，占我國國產(chǎn)植物油總量的26%左右[1]。當(dāng)前我國花生品種的含油量為45%～55%，平均含油量50.57%[2-3]。據(jù)測算，花生榨油原料中含油量每提高1個(gè)百分點(diǎn)相當(dāng)于產(chǎn)量提高2個(gè)百分點(diǎn)，加工企業(yè)的效益則可提高7個(gè)百分點(diǎn)以上。因此，提高花生含油量，對(duì)增加油脂加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，保障國家油脂安全具有重要意義[4]。傳統(tǒng)的花生育種時(shí)間長、效率低，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來可大大縮短育種年限的分子標(biāo)記輔助選擇育種方法已受到越來越多育種者的青睞。栽培花生種(ArachishypogaeaL.，AABB，2n=4×=40)為異源四倍體，可能由二倍體野生種雜交演化而來，基因組高度保守[5-6]。然而，由于單一雜交及多倍化，花生育種過程中高頻使用少數(shù)骨干親本，使得生產(chǎn)上應(yīng)用的花生品種間遺傳背景狹窄，遺傳多樣性降低，導(dǎo)致在花生栽培品種間開發(fā)有效穩(wěn)定的分子標(biāo)記難度增大。所以在花生栽培品種之間開發(fā)穩(wěn)定的、含油量相關(guān)的分子標(biāo)記對(duì)于高油花生的育種和種質(zhì)資源的鑒定具有重要意義。

花生含油量是較為復(fù)雜的數(shù)量性狀，受環(huán)境影響大。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為花生含油量性狀同時(shí)受到加性和非加性效應(yīng)的控制[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來花生含油量性狀的分子標(biāo)記研究取得了一定的進(jìn)展，開發(fā)了一系列與花生含油量相關(guān)的SSR標(biāo)記。Sarvamangala等利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)花生的含油量進(jìn)行了QTL定位，開發(fā)了與花生含油量相關(guān)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記[8-10]。InDel(Insertion-Deletion)標(biāo)記是指在近緣種或同一物種不同個(gè)體之間基因組同一位點(diǎn)的序列發(fā)生不同大小核苷酸片段的插入或缺失[11]。相較于SSR標(biāo)記，InDel標(biāo)記有更豐富的多態(tài)性，更高的特異性以及檢測方便快捷的特點(diǎn)[12]，并已經(jīng)在水稻、玉米、結(jié)球甘藍(lán)、黃瓜、番茄、辣椒等物種中開始應(yīng)用[15-20]。在花生上，已有與抗病性和莢果性狀相關(guān)的InDel標(biāo)記的報(bào)道。Liu等[21]率先利用EST數(shù)據(jù)開發(fā)了48個(gè)花生的InDel標(biāo)記，其中16個(gè)標(biāo)記在118份材料中表現(xiàn)多態(tài)性，5個(gè)與晚斑病和番茄斑萎病毒病顯著關(guān)聯(lián)；Meng等[22]利用這48個(gè)InDel標(biāo)記評(píng)估了54個(gè)花生品種的遺傳多樣性與5個(gè)莢果性狀的相關(guān)性。但是，目前尚未見與含油量相關(guān)的InDel標(biāo)記的報(bào)道。本試驗(yàn)在對(duì)49個(gè)花生栽培品種的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析獲得了61 942個(gè)InDel位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)29個(gè)InDel位點(diǎn)與花生含油量相關(guān)。基于這些位點(diǎn)，通過設(shè)計(jì)引物及比較測序，以及在171個(gè)花生品種組成的自然群體中的擴(kuò)增驗(yàn)證，旨在開發(fā)用于分子標(biāo)記輔助高含油量育種與種質(zhì)評(píng)價(jià)的InDel標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

171個(gè)花生栽培品種，2016年均種植于山東省花生研究所試驗(yàn)基地(青島萊西)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

在花生苗期取健康植株上的無病蟲害幼嫩葉片100 mg，保存于-80℃冰箱?；蚪MDNA提取使用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-2，北京天根生化科技有限公司)，具體操作步驟參照試劑盒說明。

1.2.2 InDel引物的設(shè)計(jì)和合成

利用下載的花生二倍體野生種序列(https://www.peanutbase.org/download)和29個(gè)花生含油量相關(guān)的InDel位點(diǎn)信息，提取InDel位點(diǎn)兩端各500 bp序列，使用primer3軟件設(shè)計(jì)了29對(duì)引物，由北京華大基因有限公司(青島)合成(表1)。

1.2.3 PCR反應(yīng)及DNA片段分析

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系： 2μL 50 ng/μL DNA，0.4μL dNTPs，2μL PCR buffer 溶液，1.6μL MgCl2溶液，0.2μL Taq酶，11.8μL ddH2O和2μL InDel引物，總體積為20μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃變性4 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次；25℃保存。PCR產(chǎn)物使用QIAxcel DNA High Resolution Kit(1200)(No.929002，QIAGEN INC)在QIAxcel Advanced system，全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)(凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司)上進(jìn)行分析。

1.2.4 PCR產(chǎn)物目的片段的回收、T載體連接及測序

分別對(duì)花生栽培品種Peanut 16、Peanut 20和Peanut 21進(jìn)行多態(tài)性引物的PCR擴(kuò)增。目的片段的回收、純化使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，具體操作步驟參照回收試劑盒說明。將回收的目的片段與pMD18-T載體(寶生物工程(大連)有限公司)連接后，使用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化科技有限公司)，熱激后加入200μL 無抗LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩1 h，取培養(yǎng)的菌液 200μL 平鋪于LB 固體培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素)上，將培養(yǎng)皿倒置放于37℃恒溫箱培養(yǎng) 16～20 h。每個(gè)差異片段挑選12個(gè)單克隆菌落，每個(gè)單克隆菌落在300μL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)中培養(yǎng)4 h(37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速300 r/min)。根據(jù)插入片段的大小，使用 M13引物(M13-47F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；M13-48R：5'-CACAGGAAACAGCTATGACCAT-3')進(jìn)行陽性克隆的篩選。其反應(yīng)體系為：2μL菌液，0.4μL dNTPs，2μL PCR buffer溶液，1.6 μL MgCl2，0.2 μL Taq酶，11.8 μL ddH2O和2 μL M13-47F/M13-48R通用引物，總體積 20 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃變性 4 min；94℃變性 30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)30次；25℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠(含核酸染料1×Super GelRed(10 000×)，US Everbright INC生產(chǎn))電泳，在凝膠成像儀中檢測其擴(kuò)增片段大小與原來差異片段大小相當(dāng)即說明該單克隆為陽性，將每個(gè)差異片段的3個(gè)單克隆送華大基因有限公司(青島)測序。使用Lasergene軟件進(jìn)行去載體序列和序列比對(duì)。

表1 InDel引物序列及其在染色體上的信息

1.2.5 粗脂肪含量測定及分子標(biāo)記分析

171個(gè)花生栽培品種的粗脂肪含量測定按GB/T 14488.1-1993分析。7個(gè)含油量存在差異的品種用于引物多態(tài)性的初步篩選，171個(gè)豐富變異的花生品種用于多態(tài)性引物的進(jìn)一步PCR擴(kuò)增以及片段多態(tài)性分析。利用DPS 9.05軟件[23]計(jì)算花生栽培品種的含油量和分子標(biāo)記的二列相關(guān)系數(shù)，進(jìn)而使用繪圖軟件Origin8 繪制不同標(biāo)記類型對(duì)應(yīng)含油量變異箱型圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性InDel分子標(biāo)記的開發(fā)

隨機(jī)選取7個(gè)花生品種(Peanut 90、Peanut 91、Peanut 92、Peanut 93、Peanut 94、Peanut 95、Peanut 97)進(jìn)行29對(duì)引物的多態(tài)性分析，結(jié)果顯示在本研究設(shè)計(jì)的29對(duì)引物中，僅有1對(duì)引物(ID14-3)在不同品種中表現(xiàn)出多態(tài)性(圖1)。引物ID14-3在7個(gè)品種中可擴(kuò)增出2個(gè)片段大小不同的條帶，分別記為a條帶和b條帶(分別命名為ID14-3a，ID14-3b)，片段大小在250～300 bp之間。分別對(duì)a條帶和b條帶進(jìn)行克隆測序，a條帶大小為278 bp，b條帶大小為272 bp。對(duì)這兩條序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明b條帶相較于a條帶有多個(gè)位點(diǎn)的變異，從而造成了b條帶比a條帶小6 bp (圖2)。

2.2 InDel分子標(biāo)記與含油量的相關(guān)性分析

表2表明，171個(gè)花生品種平均含油量47.52%，Peanut 20含油量最高，達(dá)54.20%，Peanut 125含油量最低，為42.20%。利用ID14-3引物擴(kuò)增檢測了171份品種結(jié)果顯示，63個(gè)花生品種可擴(kuò)增檢測到ID14-3a標(biāo)記，108個(gè)花生品種可擴(kuò)增檢測到ID14-3b標(biāo)記。含ID14-3a標(biāo)記的63個(gè)花生品種平均含油量46.26%，含ID14-3b標(biāo)記的108個(gè)花生栽培品種平均含油量48.33%(圖3)。將ID14-3a標(biāo)記賦值為1，ID14-3b標(biāo)記賦值為2，利用DPS 9.05計(jì)算的二列相關(guān)系數(shù)ρ=0.51431(p=0.00000)，相關(guān)性極顯著，因此推測ID14-3b標(biāo)記與花生栽培品種的高含油量相關(guān)。

圖1 分子標(biāo)記ID14-3在7個(gè)花生栽培種中的多態(tài)性分析Fig.1 Amplification pattern of ID14-3 primer among 7 peanut varieties

圖2 不同花生品種ID14-3引物擴(kuò)增序列的比對(duì)分析Fig.2 Alignment of sequences amplified by ID14-3 primer among different varieties 注： 框中標(biāo)出的是序列插入/缺失位置。 Note: Rectangle show the position of Insertion/deletion. 表2 花生品種的含油量及其ID14-3標(biāo)記的帶型 Table 2 Oil content of peanut varieties and their pattern amplified by ID14-3 primer

品種編號(hào)SerialNo.含油量(%)Oilcontent帶型Band品種編號(hào)SerialNo.含油量(%)Oilcontent帶型Band品種編號(hào)SerialNo.含油量(%)Oilcontent帶型BandPeanut151.85bPeanut5849.53bPeanut11544.81aPeanut244.16aPeanut5948.26bPeanut11649.62bPeanut350.61bPeanut6045.58bPeanut11746.83bPeanut447.72bPeanut6146.51aPeanut11848.09aPeanut549.34aPeanut6246.20bPeanut11945.46bPeanut647.82aPeanut6344.90aPeanut12047.13bPeanut745.48aPeanut6447.27bPeanut12145.54bPeanut848.67bPeanut6547.68aPeanut12243.92aPeanut948.27bPeanut6651.48bPeanut12347.23bPeanut1042.65bPeanut6746.08bPeanut12452.32bPeanut1148.94bPeanut6842.46aPeanut12542.20aPeanut1242.77bPeanut6946.65bPeanut12643.09aPeanut1348.28bPeanut7042.42aPeanut12745.25aPeanut1449.67bPeanut7146.68bPeanut12846.12bPeanut1547.51bPeanut7244.50aPeanut12947.85bPeanut1649.66bPeanut7349.91bPeanut13047.92bPeanut1745.37bPeanut7448.26aPeanut13145.61bPeanut1851.81bPeanut7544.80aPeanut13250.38bPeanut1949.56aPeanut7645.72aPeanut13345.95bPeanut2054.20aPeanut7743.57aPeanut13444.19bPeanut2151.46bPeanut7850.22bPeanut13545.53bPeanut2250.20bPeanut7953.54bPeanut13647.46bPeanut2346.85aPeanut8050.70bPeanut13745.56bPeanut2445.26bPeanut8145.23bPeanut13848.35bPeanut2544.04bPeanut8247.94aPeanut13946.34aPeanut2647.61bPeanut8345.02bPeanut14046.47aPeanut2752.03bPeanut8449.08bPeanut14143.03aPeanut2848.79bPeanut8546.28aPeanut14246.45aPeanut2952.59bPeanut8647.25aPeanut14350.97bPeanut3050.68bPeanut8752.01bPeanut14448.61bPeanut3146.15bPeanut8852.49bPeanut14546.63aPeanut3248.50aPeanut8949.32bPeanut14648.66bPeanut3343.44bPeanut9050.94aPeanut14749.78bPeanut3447.03bPeanut9146.66bPeanut14845.99aPeanut3550.97bPeanut9246.72aPeanut14947.95bPeanut3648.94bPeanut9349.04bPeanut15045.84bPeanut3748.44aPeanut9449.36aPeanut15148.22bPeanut3846.77bPeanut9551.51bPeanut15247.24aPeanut3948.04bPeanut9648.22aPeanut15344.24aPeanut4047.80aPeanut9746.96bPeanut15446.88bPeanut4143.88aPeanut9850.28bPeanut15547.74aPeanut4247.73aPeanut9949.93bPeanut15648.70aPeanut4351.12bPeanut10047.29bPeanut15745.28aPeanut4449.56bPeanut10148.49aPeanut15847.39bPeanut4549.15bPeanut10247.34bPeanut15950.19bPeanut4647.32bPeanut10348.77bPeanut16047.67bPeanut4744.34aPeanut10449.01bPeanut16150.36bPeanut4850.25bPeanut10545.36aPeanut16247.28aPeanut4944.19aPeanut10647.87aPeanut16347.96bPeanut5043.40aPeanut10747.05bPeanut16444.46aPeanut5149.53bPeanut10846.96aPeanut16547.00bPeanut5247.64aPeanut10946.40bPeanut16644.86aPeanut5342.56aPeanut11049.50bPeanut16746.32aPeanut5446.81bPeanut11152.28bPeanut16849.08bPeanut5548.89aPeanut11248.20bPeanut16947.48bPeanut5643.05aPeanut11348.02bPeanut17050.28bPeanut5750.89bPeanut11444.29aPeanut17147.32a

圖3 InDel標(biāo)記ID14-3b(A)和ID14-3a(B)對(duì)應(yīng)花生品種的含油量差異箱型圖Fig. 3 Box plot for oil content of peanut varieties with InDel marker ID14-3b (A) and ID14-3a (B)

3 討 論

花生栽培品種之間基因組序列高度保守使得用于分子標(biāo)記輔助育種的標(biāo)記開發(fā)難度大大增加。本課題組前期利用轉(zhuǎn)錄組測序的海量數(shù)據(jù)獲得的61942個(gè)InDel位點(diǎn)，以及2年2點(diǎn)共4個(gè)環(huán)境測定的含油量數(shù)據(jù)，經(jīng)關(guān)聯(lián)分析獲得29個(gè)InDel位點(diǎn)與含油量顯著相關(guān)(Wang等，待發(fā)表)。其中ID14-3位點(diǎn)在171個(gè)品種組成的自然群體中的分析顯示，含ID14-3b標(biāo)記的品種平均含油量比含ID14-3a標(biāo)記的平均含油量高2個(gè)百分點(diǎn)，相關(guān)性分析顯示標(biāo)記與含油量極顯著，因此推測ID14-3是與控制花生含油量相關(guān)的基因位點(diǎn)。

根據(jù)與花生含油量相關(guān)的29個(gè)InDel位點(diǎn)均設(shè)計(jì)了引物，對(duì)7個(gè)栽培品種進(jìn)行篩選，最終僅有1個(gè)引物的擴(kuò)增表現(xiàn)穩(wěn)定的多態(tài)性，這可能與初篩的7個(gè)品種的基因型有關(guān)。此外，本研究所用的171個(gè)花生栽培品種不包含轉(zhuǎn)錄組分析用的49個(gè)栽培品種(Wang等，待發(fā)表)，但是依然可以檢測到ID14-3所在位點(diǎn)的多態(tài)性，表明該引物具有通用性，可用于花生含油量的分子標(biāo)記輔助育種、遺傳多樣性和遺傳圖譜的構(gòu)建等研究。

引物ID14-3是根據(jù)花生野生種B04染色體上127 849 985 bp位置的InDel位點(diǎn)設(shè)計(jì)而來。Wang等[24]對(duì)花生脂肪酸進(jìn)行QTL定位，確定花生的B04染色體上存在2個(gè)與花生脂肪酸含量相關(guān)的QTL簇，其中一個(gè)QTL簇中的分子標(biāo)記IPAHM108-2恰好位于ID14-3所在的InDel位點(diǎn)附近，進(jìn)一步證明本研究開發(fā)的ID14-3a和ID14-3b標(biāo)記與花生含油量相關(guān)，可為今后花生含油量的分子標(biāo)記輔助育種和精細(xì)定位等提供標(biāo)記基礎(chǔ)。

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