王 娟，李春娟，閆彩霞，趙小波，單世華

(山東省花生研究所，山東 青島 266100)

花生(ArachishypogaeaL.)是我國重要的經(jīng)濟作物和油料作物，我國的花生產(chǎn)量占世界花生總產(chǎn)的40%以上，居世界第一位[1]。栽培種花生基因組(AABB)龐大而復雜[2]，導致對花生基因組的測序和分析非常困難。為解決類似難題，科學家們基于只對非重復或低重復基因組區(qū)域進行測序來降低測序基因組復雜程度的簡化基因組測序(Reduced-Representation Genome Sequencing, RRGS)，開發(fā)了一系列低成本、高通量的基因型鑒定方法。其中，基于測序的基因分型(Genotyping by Sequencing，GBS)方法是通過獲取全基因組范圍內(nèi)呈現(xiàn)特異性酶切位點附近的小片段DNA標簽，以獲得整個基因組的序列特征，從而進行全基因組水平的生物信息學分析[3]。隨著測序技術(shù)的不斷改進，雙酶切GBS(Double digest Genotyping-by Sequencing, ddGBS)測序能夠降低基因組復雜程度，使得全基因組水平的基因分型更加簡便、可靠、實用[4]。

因此，ddGBS能夠為進一步揭示花生種質(zhì)資源中的新基因，以及確定影響花生生長發(fā)育的關(guān)鍵基因構(gòu)建理論基礎(chǔ)。作為GBS測序的第一步，對限制性內(nèi)切酶組合的選擇決定了酶切位點附近的小片段DNA分布，對于后續(xù)基因信息的識別有重要的影響。本研究對三組常用的酶切組合進行比較[5-6]，選取了最佳酶切組合，并且通過統(tǒng)計分析進一步確認該酶切組合的合理性。

1 材料與方法

1.1 花生全基因組序列的獲取

本研究所用參考基因組序列來自花生數(shù)據(jù)庫(https://www.peanutbase.org/)。其中，Arachisduranensis的基因組(A基因組)大小為1.08G，A.ipaensis的基因組 (B基因組)大小為1.35G。

1.2 三個候選酶切組合的比較及統(tǒng)計分析

根據(jù)文獻報道，選取三組常用的限制性內(nèi)切酶組合(SacI和MseI；PstI和MspI；EcoRI和NIaIII)。其中，SacI的識別位點為GAGCT^C，MseI的識別位點為T^TAA，PstI的識別位點是CTGCA^G和G^ACGTC，MspI的識別位點為C^CGG，EcoRI的識別位點為G^AATTC，NIaIII的識別位點是CATG。選擇依據(jù)：① 酶切片段在各染色體上分布較均勻；② 酶切片段在全基因組上覆蓋度較高。通過電子酶切統(tǒng)計結(jié)果，初步選定酶切組合[7]。

通過R軟件包(https://www.r-project.org/)和Excel軟件統(tǒng)計候選酶切組合得到酶切片段長度。通過R軟件包統(tǒng)計該酶切組合在全基因組和各個染色體上的分布、數(shù)目和長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶切組合的選取

針對群體分析的研究目的，測序深度選擇在5～10X左右。依次使用三組常用的限制性內(nèi)切酶組合(SacI和MseI；PstI和MspI；EcoRI和NIaIII)對已公布的花生野生二倍體基因組A(Arachisduranensis)和基因組B(A.ipaensis)序列進行電子酶切。結(jié)果顯示，EcoRI和NIaIII酶切組合得到的酶切片段覆蓋全基因組比例最大，A基因組上占3.10%，B基因組上占3.53%；PstI和MspI得到的酶切片段覆蓋全基因組范圍最小，A基因組上占0.88%，B基因組上占1.19%。因此，EcoRI和NIaIII酶切組合成為候選酶切組合，相應(yīng)測序量在403～806 M之間(表1)。

2.2 酶切片段的相關(guān)統(tǒng)計

EcoRI和NIaIII酶切組合所產(chǎn)生酶切片段長度如下(圖1)。基因組A和B上，大小在1～10kb片段所占比例最大，>40kb以上的片段占比例最小。高通量測序通常選取大小在300～500 bp酶切片段，本研究中，實際統(tǒng)計的有效長度在386～390 bp之間，片段數(shù)目在B05染色體上最多，達到27568個，A01染色體上最少，有7888個。有效Tags總數(shù)與染色體長度相關(guān)，所占染色體的比例穩(wěn)定，除A08染色體為0.15外，均為0.14(表2)。

在花生全基因組范圍內(nèi)，有效tags總數(shù)為412662個，花生各個染色體上的分布位置見圖2，酶切片段分布較均勻，有效覆蓋度2.46%(表3)，能夠達到GBS測序所需的覆蓋范圍(1%～3%)，因此，酶切所得到DNA片段的覆蓋范圍對于后續(xù)的分析也比較合理。

圖1 酶切片段長度柱形統(tǒng)計圖 Fig.1 The bar chart of the enzyme fragment length

表2 酶切片段在每條染色體上的分布情況

圖2 酶切片段分布(左)以及有效酶切片段的分布(右) Fig.2 The distribution of restriction fragments (left) and the effective of restriction fragments (right)

表3 酶切片段在全基因組上的分布情況

3 討論與結(jié)論

GBS是一種性價比較高的簡化基因組測序方法。GBS測序首先需要選擇最佳的酶切組合來保證后續(xù)測序和分析的正常進行。根據(jù)參考文獻信息，研究選取了三組常用的限制性內(nèi)切酶組合(SacI和MseI；PstI和MspI；EcoRI和NIaIII)，并分別對已公布的花生野生二倍體基因組A(Arachisduranensis)和基因組B(Arachisipaensis)序列進行電子酶切和相關(guān)統(tǒng)計。

通過對酶切片段覆蓋范圍，數(shù)目以及長度統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行分析和對比，表明EcoRI和NIaIII是相對比較理想的限制性內(nèi)切酶組合，因此本研究為群體遺傳資源在全基因組水平的挖掘奠定了基礎(chǔ)。

[1] 萬書波. 中國花生品質(zhì)區(qū)劃[M]. 北京：科學出版社，2012.

[2] 禹山林.中國花生品種及其系譜[M]. 上海：上海科學技術(shù)出版社, 2008.

[3] Davey J W, Hohenlohe P A, Etter P D, et al. Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation sequencing [J]. Nature Reviews Genetics, 2011, 12(7): 499-510.

[4] Elshire R J, Glaubitz J C, Sun Q, et al. A robust, simple genotyping-by-sequencing (GBS) approach for high diversity species [J]. PloS ONE, 2011, 6: e19379. DOI:10.1371/journal.pone.0019379.

[5] Shirasawa K, Hirakawa H, and Isobe S. Analytical workflow of double-digest restriction site-associated DNA sequencing based on empirical and in silico optimization in tomato [J]. DNA Research, 2016, 23:145-153.

[6] Zhou X, Xia Y, Ren X, et al. Construction of a SNP-based genetic linkage map in cultivated peanut based on large scale marker development using next-generation double-digest restriction-site-associated DNA sequencing (ddRADseq) [J]. BMC Genomics, 2014, 15(1):351.

[7] Bertioli D J, Cannon S B, Froenicke L, et al. The genome sequences ofArachisduranensisandArachisipaensis, the diploid ancestors of cultivated peanut [J]. Nature Genetics, 2016, 48(4):118-120.