梁 娟，潘 見(jiàn)， 葛 梅， 徐金鳳

響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓菠蘿汁?；詈蜏p敏工藝

梁 娟，潘 見(jiàn)*， 葛 梅， 徐金鳳

（合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009）

為了同時(shí)實(shí)現(xiàn)菠蘿汁的?；詈蜏p敏，分別考察了壓力、加壓溫度、pH和NaCl添加量4因素對(duì)菠蘿汁纖溶活性和致敏性的影響。并在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化該工藝。結(jié)果表明這4個(gè)因素對(duì)纖溶活性和致敏性的影響的不同，通過(guò)工藝優(yōu)化可以實(shí)現(xiàn)菠蘿汁的?；詈蜏p敏，其最優(yōu)工藝條件參數(shù)為壓力425 MPa，加壓溫度50℃，pH 3.22，鹽添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.55%。在該條件下，菠蘿汁的纖溶活性保留88.34%，致敏性降至33.71%。說(shuō)明該方法能夠較好的實(shí)現(xiàn)菠蘿汁的保活和減敏。

超高壓，菠蘿汁，纖溶活性，致敏性，響應(yīng)面法

菠蘿（Ananas comosus L.Merr）屬于鳳梨科多年生植物，是熱帶和亞熱帶地區(qū)的主要水果品種，中國(guó)菠蘿主要分布于海南、廣東、廣西、福建、云南5個(gè)省區(qū)，產(chǎn)量居世界第四位[1]。菠蘿在市場(chǎng)上的主要消費(fèi)形式為新鮮菠蘿、菠蘿罐頭和菠蘿汁[2]。其中菠蘿汁為最重要的菠蘿加工制品，以其明亮的色澤、特殊的香氣以及豐富的營(yíng)養(yǎng)成分受到消費(fèi)者的廣泛喜愛(ài)，成為果汁市場(chǎng)上僅次于橙汁的大宗果汁[3]。

菠蘿中除含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，還含有一種蛋白水解酶菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶（bromelain，EC 3.4.22.3）是存在于菠蘿植株中的多種相似但卻截然不同的半胱氨酸蛋白酶的混合物。其中成熟的菠蘿果中菠蘿蛋白酶的含量和活性最高[4]。菠蘿蛋白酶具有抗血小板聚集、溶解纖維蛋白、抗炎等功能等，被廣泛應(yīng)用于食品和藥品行業(yè)[5-6]，菠蘿蛋白酶的這些功能活性均與其纖溶活性有關(guān)[7]。此外，菠蘿蛋白酶還是水果中的一種常見(jiàn)過(guò)敏原，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料報(bào)道了很多關(guān)于菠蘿過(guò)敏的案例[8]。

為了延長(zhǎng)菠蘿汁的貨架期，殺菌工藝是菠蘿汁加工的主要工序，目前市場(chǎng)上菠蘿汁的主要?dú)⒕绞綖閭鹘y(tǒng)的熱殺菌，如高溫瞬時(shí)殺菌和巴氏殺菌[9]。熱殺菌不僅會(huì)破壞菠蘿汁的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)，也會(huì)滅活菠蘿汁中菠蘿蛋白酶，使得菠蘿汁喪失其功能性[10-11]。超高壓殺菌作為最有可能代替熱殺菌的新型殺菌方式，可以避免熱殺菌帶來(lái)的上述問(wèn)題，最大程度的保留其風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)和菠蘿蛋白酶的活性[12-13]，但是超高壓菠蘿汁同時(shí)保留了菠蘿蛋白酶的致敏性。為了盡量降低超高壓菠蘿汁對(duì)易致敏人群的影響，實(shí)現(xiàn)在保留菠蘿汁纖溶活性的同時(shí)，盡量降低致敏性至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 菠蘿：市售；牛纖維蛋白原和凝血酶（酶活力62 U/mg）：Sigma公司產(chǎn)品；尿激酶（酶活力1 240 U/支）：中國(guó)食品藥品檢定研究院產(chǎn)品；致敏者血清：安徽醫(yī)科大學(xué)提供；羊抗人IgE：美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；ELISA盒：美國(guó)Costa公司產(chǎn)品；超濾離心管：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 1升超高壓釜：包頭科發(fā)科技有限公司產(chǎn)品；超高壓系統(tǒng)：上海大隆超高壓設(shè)備廠產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)3K15：德國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品；低溫冰箱TSE320：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；Epoch微孔板分光光度計(jì)：美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品；DZ-400/2S真空包裝機(jī)：浙江金華市包裝機(jī)械有限公司產(chǎn)品；SHP-250恒溫培養(yǎng)箱；上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試樣的處理 選擇新鮮的8成熟的菠蘿，去皮去目，將果肉破碎成小塊榨汁，用6層紗布過(guò)濾，除去纖維和其他雜質(zhì)。然后4 000 r/min于4℃離心30 min去除大分子雜質(zhì)。保留上清液，棄去沉淀。

用于纖溶活性檢測(cè)的樣品，取離心的上清液分裝在無(wú)菌PE瓶中，PE瓶用密封袋密封，密封袋中充滿(mǎn)水以排除空氣。然后置于1 L的高壓容器中加壓。用于致敏性測(cè)定的樣品，取離心后的菠蘿汁緩慢加入硫酸銨粉末提取致敏蛋白，變加邊攪拌，直至加到飽和度為40%停止，繼續(xù)攪拌2 h后，放入離心管中6 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀用雙蒸水復(fù)溶，然后用超濾離心管脫鹽和定量復(fù)溶，最后調(diào)節(jié)pH和添加不同含量的NaCl。所有提取和分離步驟均在4℃條件下進(jìn)行，處理好的所有樣品于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 纖溶活性測(cè)定 參考Astrup T[14]等采用的纖維素平板法測(cè)定菠蘿汁的纖溶活性，并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)情況適當(dāng)改變了凝血酶和纖維蛋白原的比例。以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品，以尿激酶活力單位數(shù)C（U/mL）的對(duì)數(shù)lg C為橫坐標(biāo)，裂解圈的面積A（mm2）的對(duì)數(shù)值lg A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定樣品時(shí)取待測(cè)樣品10 μL點(diǎn)樣于纖維蛋白平板樣孔中，按上述方法進(jìn)行操作，測(cè)定裂解圈的直徑后取平均值，根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品的纖溶活性。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

1.2.3 致敏性測(cè)定 采用間接酶聯(lián)免疫法。包被：每孔包被100 μL抗原稀釋液，4℃放置過(guò)夜或者37℃保溫2 h。用200 μL PBST洗滌液洗滌3次，每次5 min。封閉：每孔加入封閉液200 μL，37℃孵育2 h，倒出封閉液。加一抗：每孔加入100 μL致敏者血清（1∶200），37℃孵育1 h，洗滌3次，每次5 min。加酶標(biāo)二抗：每孔加入100 μL辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗人IgE（1∶2 000），37℃孵育1 h。洗滌5次，每次5 min。顯色：取出酶標(biāo)板，每孔加入底物液TBS200 μL，置于室溫黑暗處放置15 min。終止：取出酶標(biāo)板，向每孔中加入終止液50 μL。用酶標(biāo)儀在450 nm的吸光度下檢測(cè)。

1.2.4 不同影響因素的選擇 實(shí)驗(yàn)所用菠蘿汁的天然pH值為pH 3.65，超高壓處理保壓時(shí)間均設(shè)為20 min，單因素實(shí)驗(yàn)選取不同壓力（100、200、300、400、500 MPa）、加壓溫度（10、20、30、40、50、60、70℃）、pH （2.70、3.20、3.70、4.20、4.70）、鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8）4個(gè)因素?？疾炱鋵?duì)菠蘿汁纖溶活性和致敏性的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定 3次，以未經(jīng)超高壓處理菠蘿汁的致敏性和纖溶活性作為參照，相對(duì)值定義為100%。

1.2.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，采用 Design-Expert8.0軟件中的 Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in the response surface analysis

2 結(jié)果與討論

2.1 不同因素對(duì)纖溶活性和致敏性的影響

2.1.1 壓力的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，菠蘿汁原樣的纖溶活性為（247.88±13.21）U/mL，致敏原質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（0.955±0.043）mg/mL。從圖1可以看出，菠蘿汁的纖溶活性和致敏性均隨著壓力的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，并在300 MPa時(shí)達(dá)到最大值，分別為174.49%和111.26%。壓力對(duì)菠蘿汁纖溶活性和致敏性影響均極顯著（p<0.01）。當(dāng)壓力大于300 MPa時(shí)，兩者開(kāi)始不同程度的下降，說(shuō)明高于300 MPa的壓力時(shí)，可以考慮菠蘿汁的?；詈蜏p敏。

菠蘿汁中與纖溶活性和致敏性相關(guān)的蛋白均是菠蘿蛋白酶[15-16]。造成這兩者在300 MPa時(shí)達(dá)到最大值的原因可能是：首先在高壓條件下（比如0~ 300 MPa），細(xì)胞膜被破壞，有利于酶與底物的接觸，增加菠蘿蛋白酶的反應(yīng)速度的增加。其次，高壓處理使得更多的巰基暴露在細(xì)胞表面[17]。而菠蘿蛋白酶屬于半胱氨酸巰基蛋白酶，巰基的增加必然導(dǎo)致酶活力的增加。最后，認(rèn)為菠蘿蛋白酶活性的變化可能是因?yàn)槠涠?jí)結(jié)構(gòu)受壓力的影響發(fā)生變化。α-螺旋對(duì)菠蘿蛋白酶穩(wěn)定性至關(guān)重要，隨著α-螺旋含量的增加，菠蘿蛋白酶的活性增加。隨著α-螺旋含量降低，菠蘿蛋白酶活性降低。在較低壓力下二級(jí)結(jié)構(gòu)的 α-螺旋和β-折疊不易被破壞，甚至還會(huì)變得更加穩(wěn)定，但是在較高壓力（高于300~700 MPa）下，二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不可逆變性[18]。

圖1 壓力對(duì)菠蘿汁纖溶活性和致敏性的影響Fig.1 Effect of high pressure on fibrinolytic activity and allergenicity of pineapple juice

2.1.2 加壓溫度的影響 從圖2可以看出，10~50℃溫度范圍內(nèi)，菠蘿汁的相對(duì)纖溶活性隨著溫度的升高而升高，在50℃時(shí)達(dá)到最大值，這文獻(xiàn)報(bào)到的菠蘿蛋白酶的最適宜酶活溫度在50℃附近相符合[19]。溫度大于50℃時(shí)纖溶活性開(kāi)始快速下降，70℃時(shí)幾乎完全失活。這主要是因?yàn)楫?dāng)溫度升高到70℃，酶蛋白的氫鍵、疏水作用、離子鍵和靜電相互作用會(huì)弱化，三維構(gòu)象受到破壞。當(dāng)溫度大于最適宜溫度后，酶熱失活顯著增強(qiáng)，酶活力大幅降低。而菠蘿汁的致敏性在20~30℃附近達(dá)到最大值，高于30℃或者低于20℃時(shí)致敏性呈下降趨勢(shì)。致敏性隨溫度的變化趨勢(shì)不同于纖溶活性，由于果菠蘿蛋白酶是一組半胱氨酸復(fù)合酶，該組酶在結(jié)構(gòu)上既相似又不同。影響菠蘿汁致敏性的抗原表位和影響酪蛋白水解活性和致敏性的活性位點(diǎn)各不相同，所以?xún)烧呤軠囟鹊挠绊懸脖憩F(xiàn)出不同的變化。因此選擇合適的溫度范圍有可能一定程度的實(shí)現(xiàn)菠蘿汁的?；詈蜏p敏。

2.1.3 pH的影響 從圖3可以看出，pH對(duì)纖溶活性和致敏性的影響趨勢(shì)不同，在pH 3.70附近，菠蘿汁的致敏性最高，增加或者降低pH均會(huì)導(dǎo)致致敏性的降低。而菠蘿汁的最大纖溶活性在pH 4.20，之后隨著pH的增加纖溶活性下降。當(dāng)pH增加到5.00，纖溶活性和致敏性分別保留約67%和64%。當(dāng)pH低于3.70時(shí)，纖溶活性和致敏性均快速下降，pH 2.70時(shí)，兩者均較低至40%以下。這與低pH值時(shí)菠蘿蛋白酶的構(gòu)象被破壞有關(guān)，低pH能夠介導(dǎo)菠蘿蛋白酶的解折疊，從而導(dǎo)致其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[20]。Basir Ahmad&Rizwan Hasan Khan[21]選擇pH 0.8~3.0區(qū)域研究酸性介導(dǎo)的菠蘿蛋白酶的解折疊，發(fā)現(xiàn)菠蘿蛋白酶在該區(qū)域范圍內(nèi)菠蘿蛋白酶解折疊的程度較大，其中二級(jí)結(jié)構(gòu)最大喪失80%以上。事實(shí)上為pH對(duì)酶活性的影響時(shí)復(fù)雜的，既影響酶分子與底物分子的活性基團(tuán)的解離狀態(tài)，也會(huì)使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生變化。

圖2 加壓溫度對(duì)菠蘿汁纖溶活性和致敏性的影響Fig.2 Effect of temperature on fibrinolytic activity and allergenicity of pineapple juice

圖3 pH對(duì)菠蘿汁纖溶活性和致敏性的影響Fig.3 Effectof pH on fibrinolytic activity and allergenicity of pineapple juice

2.1.4 鹽添加量的影響 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0~0.4%時(shí)，菠蘿汁的纖溶活性有小幅度的增加，隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，纖溶活性開(kāi)始下降。這和薛力荔等[22]研究發(fā)現(xiàn)的向菠蘿蛋白酶酶液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0~ 0.2%的NaCl，發(fā)現(xiàn)隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶活力略有升高相似，該研究還發(fā)現(xiàn)且隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，雖然酶活力總體上是下降的，但是酶活隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加的趨勢(shì)明顯。當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.4%時(shí)，菠蘿汁的致敏性基本不變，當(dāng)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.4%時(shí)，隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，致敏性下降，但下降的速度明顯小于纖溶活性的下降速度。在實(shí)驗(yàn)的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，壓力對(duì)纖溶活性的影響極顯著（p<0.01），對(duì)致敏性的影響顯著（p< 0.05），因此鹽添加量對(duì)纖溶活性和致敏性的影響趨勢(shì)相同，但對(duì)纖溶活性的影響程度大于對(duì)致敏性的影響程度。

圖4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菠蘿汁纖溶活性和致敏性的影響Fig.4 Effect of the content of NaCl on fibrinolytic activity and allergenicity of pineapple juice

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立和方差分析 運(yùn)用Design expert 8.0軟件對(duì)表2進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸和方差分析，擬合所得相對(duì)纖溶活性（Y1）和相對(duì)致敏性（Y2）的多元二次回歸方程分別為：Y1=137.03-9.98A+ 8.21B+5.85C-3.89D-7.67AB-9.16AC+5.55AD-1.18BC-0.44BD+1.15CD-27.50A2-1.39B2-23.95C2-18.15D2；Y2=+104.33-4.94A-5.50B-2.93C-1.25D-7.69AB+5.74AC-0.56AD+9.11BC-6.50BD-1.60CD-8.23A2-12.63B2-22.67C2-9.98D2。

方差分析結(jié)果顯示纖溶活性和致敏性模型極顯著 （P<0.000 1）；擬合程度較好 （失擬項(xiàng)分別為0.177 4和0.950 0）；穩(wěn)定性高（C.V.%分別為4.63和5.66）。纖溶活性和致敏性模型的矯正系數(shù)分別為R2（Adj）=0.942 4和R2（Adj）=0.897 8，說(shuō)明建立的模型分別能解釋約94.24%和89.78%響應(yīng)值的變化。壓力和溫度、壓力和pH之間的交互作用對(duì)纖溶活性的影響極顯著（p<0.01），壓力和鹽添加量之間的交互作用對(duì)纖溶活性的影響顯著（p<0.05）。壓力和溫度、溫度和pH之間的交互作用對(duì)致敏性的影響極顯著（p<0.01），壓力和pH、溫度和鹽添加量之間的交互作用對(duì)致敏性的影響顯著（p<0.05）。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

表3 纖溶活性回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the regression model of fibrinolytic activity

2.2.2 響應(yīng)曲面工藝優(yōu)化及驗(yàn)證 經(jīng)軟件對(duì)模型進(jìn)行分析優(yōu)化，并考慮實(shí)際操作的方便，得菠蘿汁保活減敏的為壓力最佳工藝：壓力425 MPa，加壓溫度50℃，pH 3.22和鹽添加量0.55%，此工藝條件下理論上纖溶活性保留89.76%，致敏性降低至原來(lái)的34.65%。對(duì)理論優(yōu)化組合條件進(jìn)行驗(yàn)證，得到相對(duì)纖溶活性和相對(duì)致敏性的實(shí)際值為（88.34±3.27）%和（33.71±1.65）%。與預(yù)測(cè)值接近，表明該模型能很好地預(yù)測(cè)超高壓多元協(xié)同技術(shù)對(duì)菠蘿汁對(duì)保活減敏作用。

表4 致敏性回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the regression model of allergenicity

3 結(jié)語(yǔ)

研究了壓力、加壓溫度、pH和鹽添加量對(duì)菠蘿汁纖溶活性和致敏性的影響，結(jié)果表明雖然纖溶活性和致敏性均和是由菠蘿蛋白酶引起的，這4個(gè)因素對(duì)纖溶活性和致敏性的影響的趨勢(shì)和顯著性均不同。通過(guò)單因素和響應(yīng)面分析，優(yōu)化了同時(shí)實(shí)現(xiàn)菠蘿汁保活和減敏的工藝。結(jié)果表明最優(yōu)工藝條件參數(shù)為壓力425 MPa，加壓溫度50℃，pH 3.22，鹽添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.55%。在該條件下，菠蘿汁的纖溶活性保留88.34%，致敏性則降低至33.71%。說(shuō)明該方法能夠較好的實(shí)現(xiàn)菠蘿汁的?；詈蜏p敏。

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會(huì)議消息

Optimization of High-Pressure Processing to Retain Fibrinolytic Activity and Reduce Allergenicity of Pineapple Juice by Response Surface Methodology

LIANG Juan， PAN Jian*， GE Mei， XU Jinfeng
（Engineering Research Centre of Bio-Process，Ministry of Education，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

In order to simultaneously preserve fibrinolytic activity and reduce allergenicity of pineapple juice，effects of pressure，temperature，pH and added amount of NaCl were investigated. Based on single factor experiments，Box-Behnken experimental design and response surface methodology were used to optimize the processing.The optimal parameters were obtained to be pressure of 425 MPa，temperature of 50℃，pH 3.22 and NaCl of 0.55%.With these conditions，the remaining fibrinolytic activity of pineapple juice was 88.34%and the allergenicity was decreased to 33.71%.The results indicated that this processing could effectively retain fibrinolytic activity and reduce allergenicity of pineapple juice.

ultra-high pressure，pineapple juice，fibrinolytic activity，allergenicity，response surface methodology

TS 255

A

1673—1689（2017）01—0015—07

2015-03-24

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA100801-05）；安徽中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2016zr007）。

梁 娟（1983—），女，安徽宿州人，工學(xué)博士，主要從事食品加工研究。E-mail：liangjuan1875@126.com

*通信作者：潘 見(jiàn)（1955—），男，安徽金寨人，工學(xué)博士，教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工和食品物流安全研究。

E-mail：hfut20022013@sina.com

梁 娟，潘 見(jiàn)，葛 梅，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓菠蘿汁?；詈蜏p敏工藝[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（01）：15-21.