趙光隆， 張薄博， 許贛榮

降脂紅曲產(chǎn)品中Monacolin K檢測方法的比較

趙光隆， 張薄博， 許贛榮*

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

為準(zhǔn)確測定降脂紅曲類產(chǎn)品中Monacolin K（MK）的質(zhì)量濃度。作者對中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（2007）、保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003版）、臺灣食品中MK檢驗方法（2012）以及其它方法進行比較。確定朱華等的檢測方法較優(yōu)，MK在質(zhì)量濃度10~400 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，加標(biāo)回收率為96.3%，方法精密度RSD=1.6%。該方法簡單、快捷，能夠比較準(zhǔn)確地反映紅曲類產(chǎn)品中不同構(gòu)型MK質(zhì)量濃度，具有很高的實用價值。

降脂紅曲；莫納可林K；檢測方法

降脂紅曲是經(jīng)過紅曲菌發(fā)酵，富含降血脂活性物質(zhì)Monacolin K（以下簡稱MK）的紅曲產(chǎn)品。自從1979年，日本遠(yuǎn)藤章[1]從紅色紅曲菌（Monascus ruber）的培養(yǎng)液中獲得一種膽固醇合成抑制劑，并命名為Monacolin K（中文名，莫納可林K），后被證實與降血脂藥物洛伐他汀 （lovastatin）為同一種物質(zhì)。它能有效抑制膽固醇合成過程中關(guān)鍵酶HMGCoA（3-羥基-3-甲基-戊二?；?輔酶A還原酶）的活性[2]。

MK有兩種分子構(gòu)型：C24H38O6（酸式構(gòu)型）、C24H36O5（內(nèi)酯式構(gòu)型），結(jié)構(gòu)式見圖1。微生物發(fā)酵法得到的都是酸式結(jié)構(gòu)的MK，它可以直接溶于體液并發(fā)揮生理作用；但它比內(nèi)酯式的穩(wěn)定性差，內(nèi)酯式的MK要在體內(nèi)先轉(zhuǎn)化成酸式的才能被吸收并發(fā)揮作用[3]。

圖1 MK分子結(jié)構(gòu)Fig.1 MK molecular structure

紅曲菌和土曲霉都可發(fā)酵產(chǎn)生降脂活性成分MK。微生物發(fā)酵法合成的MK是酸式結(jié)構(gòu)。但為了保證洛伐他汀的穩(wěn)定性，在土曲霉生產(chǎn)洛伐他汀的提取純化過程中將其轉(zhuǎn)化成內(nèi)酯式結(jié)構(gòu)。降脂紅曲產(chǎn)品一般是通過固態(tài)發(fā)酵來生產(chǎn)的，無需復(fù)雜的后處理就可直接服用，故產(chǎn)品中保留了大量的酸式MK，但在生產(chǎn)過程中，由于烘干貯存等過程，酸式MK會自然轉(zhuǎn)變成內(nèi)酯式結(jié)構(gòu)[4]。一般情況下固態(tài)發(fā)酵的降脂紅曲產(chǎn)品中酸式MK和內(nèi)酯式MK共存。

目前國內(nèi)市場上有多種類型的降脂紅曲產(chǎn)品：中成藥、中藥飲片、保健食品。對這些產(chǎn)品中MK的測定，也是依據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)采用不同的方法來檢測。這些標(biāo)準(zhǔn)分別是：中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（2007）[5]（以下簡稱輕工方法）、保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范 （2003版）[6]（以下簡稱保健食品方法）、臺灣食品中MK之檢驗方法（2012）[7]（以下簡稱臺灣方法）。此外朱華等在2005年報道過的一種方法[8]（以下簡稱朱華等的方法）。

從檢測技術(shù)的角度來看，仔細(xì)考察上述4種檢測MK的方法，發(fā)現(xiàn)有相同之處，也有不同之處。保健食品方法中MK的檢測方法參考美國藥典[9]中洛伐他丁的檢測方法，只測定內(nèi)酯式MK。即使降脂紅曲產(chǎn)品中含有酸式結(jié)構(gòu)的MK，用此法也無法得出酸式結(jié)構(gòu)MK的含量。還有一個值得注意的問題是，不同的方法采用的萃取溶劑種類不同，或者樣品萃取時間有長有短。顯然，依據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)，就有不同的方法檢測MK，這就很可能出現(xiàn)一個問題，即按照不同的方法檢測同一個產(chǎn)品，可能會得到不同的檢測數(shù)據(jù)。

因此，作者對同一批降脂紅曲產(chǎn)品，按照上述4種不同的方法進行了測定，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)對不同的檢測方法展開討論和比較，從而為建立更為科學(xué)、規(guī)范的降脂紅曲活性成分MK的檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters液相色譜儀：色譜柱：Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm；5 μm）；Waters公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

洛伐他丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國食品藥品檢定研究院提供。

2 檢測方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

取MK內(nèi)酯型標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，精確稱量，以乙腈溶解并定容至10 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)原液，于-20℃避光保存。

2.1.1 MK內(nèi)酯型標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 取一定量標(biāo)準(zhǔn)原液以乙腈稀釋至5.0～400.0 μg/mL，MK內(nèi)酯型標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 MK酸型標(biāo)準(zhǔn)溶液 取標(biāo)準(zhǔn)原液1 mL于0.1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，旋渦混合均均，于50℃超音波水浴振蕩反應(yīng)1 h，冷卻至室溫后，以乙腈定容至10 mL，繼以乙腈稀釋至5～418 μg/mL，供作MK酸型標(biāo)準(zhǔn)溶液。內(nèi)酯式MK相對分子質(zhì)量為404.55，酸式MK相對分子質(zhì)量為422.57，故經(jīng)過換算得此時的酸式MK的濃度。y為檢測峰面積，x為對應(yīng)MK質(zhì)量濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酸式：y=74 175x-77 348，R2=0.999 8，準(zhǔn)確檢測下限10.4 μg/mL

內(nèi)酯式：y=75 873-87 703，R2=0.999 1，準(zhǔn)確檢測下限10.0 μg/mL

從原理上推測，用內(nèi)酯式公式足以代表酸式的計算。

2.2 各標(biāo)準(zhǔn)中的檢測方法

2.2.1 中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（2007）中的檢測方法 提取條件：將紅曲米粉碎（40目，粉狀）并充分混合均勻。準(zhǔn)確稱取400.0~600.0 mg試樣于50 mL容量瓶中，加入30 mL 75%乙醇（體積分?jǐn)?shù)），搖勻，室溫下超聲50 min。加75%乙醇至接近刻度，再超聲10 min，之后冷卻至室溫，用75%乙醇定容至50 mL。以3 500 r/min的旋轉(zhuǎn)速度離心10 min。取上清液經(jīng)0.45 μm過濾，濾液待用[5]。

色譜條件：色譜柱：EclipseXDB-C18（5 μm，4.6 mm×250mm）；流動相：V（甲醇）∶V（水）∶V（磷酸）= 385∶115∶0.14（體積分?jǐn)?shù)）；流量：1.0 mL/min；紫外檢測波長238 nm；進樣量：20 uL；柱溫：25℃[5]。

2.2.2 保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范 （2003版）的檢測方法 提取條件：將片劑、膠囊或紅曲發(fā)酵產(chǎn)物試樣粉碎并混合均勻，根據(jù)樣品中洛伐他汀含量準(zhǔn)確稱取一定量試樣于50 mL試管中，加入10.0 mL pH=3磷酸水溶液。超聲提取10 min后再加人10.0 mL三氯甲烷，置于渦旋混勻器3 min。靜置后去掉上層水相，將三氯甲烷層以3 000 r/min離心3 min。準(zhǔn)確吸取上清液1.0~5.0 mL試管中，將試管置于50℃左右水浴中使用真空泵減壓干燥至揮去全部溶劑。向試管中加入流動相并定容至5.0 mL，徹底混勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后待進樣[6]。色譜條件：同輕工方法。

2.2.3 臺灣MK之檢測方法（2012） 提取條件：檢體均質(zhì)混勻后稱取0.2 g，精確稱定，置于25 mL定量瓶中，加入甲醇約25 mL，旋渦混合均勻后，于室溫超聲波水浴中震蕩萃取30 min，冷卻至室溫后，以甲醇定容。以3 000 r/m離心10 min，取上層液，以濾膜過濾，供作檢液[7]。

色譜條件：色譜柱：EclipseXDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：V（乙腈）∶V（0.1%磷酸溶液）=65∶35；流量：1.5 mL/min；紫外檢測波長238 nm；進樣量：10 μL；柱溫：25℃[7]。

2.2.4 朱華等的檢測方法 提取條件：乙醇提取法：精確稱取0.5 g樣品于50 mL標(biāo)準(zhǔn)比色管中，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至50 mL，55℃水浴浸提1 h，其間每隔20 min震蕩搖勻一次。浸提結(jié)束取出冷卻至室溫，取上清液微濾待測[8]。

色譜條件：色譜柱：EclipseXDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：V（乙腈）∶V（0.1%磷酸溶液）=55∶45；流量：1 mL/min；紫外檢測波長238 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃[8]。

3 結(jié)果與討論

3.1 內(nèi)酯式MK加標(biāo)回收率實驗

為了探究4種方法中不同的提取條件對樣品提取效果如何，作者進行了加標(biāo)回收實驗，稱取同一批紅曲粉3份，分別加入3個梯度的內(nèi)酯式MK，進行加樣內(nèi)酯式MK回收實驗，統(tǒng)一采用本實驗色譜條件檢測，結(jié)果如表1所示，4種標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法中，保健食品方法回收率最低且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較大無法滿足檢測準(zhǔn)確性的要求。臺灣方法中提取時間較短，回收率偏低。輕工方法與朱華等的方法樣品提取回收率都比較高，回收率≥95.0%，均滿足樣品檢測準(zhǔn)確性要求，樣品檢測穩(wěn)定性朱華等的方法RSD=1.6%優(yōu)于輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

3.2 流動相的比較實驗

流動相作為液相檢測中非常重要的的因素，不同的流動相成分以及不同成分的比例對樣品的出峰時間和峰形有直接影響，直接影響到樣品檢測的準(zhǔn)確性。實驗對不同檢測方法中的流動相對標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果較好進行比較。輕工方法和保健食品方法：V（甲醇）∶V（水）∶V（磷酸）=385∶115∶0.14流動相，從標(biāo)準(zhǔn)品圖譜（圖2）來看，酸式MK Rt=11.638，內(nèi)酯式MK Rt=13.296，色譜峰相鄰，從混合標(biāo)樣來看，兩峰剛好分開，但是在實際樣品檢測中，由于樣品成分復(fù)雜和外界條件干擾等因素峰形會發(fā)生前沿或拖尾現(xiàn)象，使得兩峰無法完全分開。臺灣方法：V（乙腈）∶V（0.1%磷酸溶液）=65∶35，標(biāo)準(zhǔn)樣品圖譜 （圖3），酸式MK Rt=4.345，內(nèi)酯式MK Rt=7.605，流動相中乙腈含量過高導(dǎo)致MK的保留時間比較短，在實際樣品檢測中會與樣品中的雜質(zhì)和溶劑峰混雜在一起，影響含量的準(zhǔn)確測定。朱華等的方法：V（乙腈）∶V（0.1%磷酸溶液）=55∶45，從圖譜來看（圖4），降低流動相中乙腈的含量，延長了MK的出峰時間，有效的避免了雜質(zhì)和溶劑峰的干擾且峰形良好，分離效果較好。

表1 內(nèi)酯式MK回收率實驗比較Table 1 Compares the lactone type MK recovery experiment

圖2 輕工和保健食品方法混合標(biāo)樣圖譜Fig.2 Light Industry and Health food industry method HPLC analysis

圖3 臺灣方法混合標(biāo)樣圖譜Fig.3 Taiwan method HPLC analysis

圖4 朱華等方法混合標(biāo)樣圖譜Fig.4 Zhu Hua et al.applied method HPLC analysis

3.3 樣品檢測實驗

稱取同一批降脂紅曲粉3份，分別用4種標(biāo)準(zhǔn)中的方法進行檢測，結(jié)果表明：輕工方法紅曲粉中MK同時以酸式和內(nèi)酯式的2種形式存在，提取相對比較徹底，液相檢測兩峰略有重疊，基本滿足樣品檢測的要求。保健食品方法的萃取方法中用pH= 3的磷酸水溶液提取過程中要將部分酸式MK轉(zhuǎn)化成內(nèi)酯式，這導(dǎo)致酸式含量減少，并且提取不夠徹底，過程步驟復(fù)雜，隨機誤差偏大；臺灣方法的萃取時間較短，無法將MK萃取完全，導(dǎo)致MK總含量偏低，并且出峰時間過早，尤其酸式MK的檢測峰與雜質(zhì)峰發(fā)生重疊，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；朱華等的方法萃取效率最高，液相檢測峰型和出峰時間都比較理想，能夠比較準(zhǔn)確的反應(yīng)其出紅曲粉中的存在形態(tài)和含量。

4 結(jié)語

通過比較輕工方法、保健食品方法、臺灣方法以及朱華等的檢測MK的方法，發(fā)現(xiàn)，采用不同的方法（主要是目標(biāo)物的萃取條件和色譜條件），對同一樣品會得到不同的檢測結(jié)果。輕工方法中的提取條件比較符合樣品檢測要求，但在該方法的色譜條件中，酸式和內(nèi)酯式MK兩峰易出現(xiàn)重疊，導(dǎo)致檢測誤差；保健食品方法中的樣品提取過程中，需要將部分酸式MK轉(zhuǎn)化成內(nèi)酯式，導(dǎo)致檢測結(jié)果中酸式比例偏低，且操作過程步驟復(fù)雜，且該法只用內(nèi)酯式的MK表示含量，對同時含有酸式和內(nèi)酯式MK的紅曲產(chǎn)品有失公允；臺灣方法中的樣品提取時間較短，會導(dǎo)致MK提取不夠徹底，并且HPLC出峰過早，易使雜質(zhì)峰重疊；朱華等的檢測方法中樣品提取和色譜條件比較符合樣品檢測的要求，過程簡便快捷，具有較高的實用價值。

表2 不同提取方法結(jié)果比較Table 2 Compares the results of different extraction methods

作者研究的HPLC檢測方法只采用了一種柱子對不同方法所獲得的提取液進行檢測，難免對其它方法中涉及到HPLC的有關(guān)條件無法完全模擬或滿足，因此也不能完全否認(rèn)這些方法。

[1]AKIRA Endo.MK，a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascusspesies[J].J Antibiotics，1979，32：852-854.

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[6]中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[S].GB 16740-2003.

[7]臺灣地區(qū)“行政院”衛(wèi)生署.食品中MK之檢驗方法[S].1011900494-2012.

[8]ZHU Hua，XU Ganrong，CHEN Yun.HPLC analysis of acid form and lactone form Monacolin K[J].Journal of Wuxi University of Light Industry，2003，22（3）：46-52.

[9]United States Pharmacopeial Convention United States Pharmacopeial Convention.Lovastatin and Lovastatin tablets[M].USP35，US，2012.2850-2851.

Compare of Monacolin K Detection Method in Lipid-Lowering Monascus Products

ZHAO Guanglong， ZHANG Bobo， XU Ganrong*
（School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To accurately examine the amounts of Monacolin K （MK）in lipid-reducing Monascus products，in this paper we compared to the light industry standard of the People's Republic of China（2007），the health care food inspection and evaluation specification（2003），Taiwan food inspection method of MK （2012）and Zhu Hua et al.applied method.The results show that Zhu Hua et al. applied method was superior.MK linearity was good within 10～400 μg/mL，and addition recovery rate was 96.3%，RSD=1.6%.This method was simple，quick and accurate to examine the amounts of MK，with very great practical value.

lipid-lowering monascus，MK，detection method

R 927.11

A

1673—1689（2017）01—0046—05

2015-03-20

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2011BAD23B02）。

*通信作者：許贛榮（1957—）男，江蘇無錫人，工學(xué)博士，教授，主要從事功能性紅曲及微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然色素研究。

E-mail：grxu123@126.com

趙光隆，張薄博，許贛榮.降脂紅曲產(chǎn)品中Monacolin K檢測方法的比較[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（01）：46-50.