趙振鹿 叢濤 楊駒 張超 袁碩龍 趙立東 喬月華

新生兒高膽紅素血癥是新生兒時期最常見的病理生理狀態(tài)，當血清膽紅素濃度達到一定水平時，可以引起聽覺障礙、神經(jīng)行為異常、智能發(fā)育遲緩等，甚至引發(fā)高膽紅素腦病，危及生命。研究發(fā)現(xiàn)，高膽紅素血癥是引起新生兒聽力損失的高危因素之一，高膽紅素血癥既可以引起中樞聽覺系統(tǒng)損傷，也可以引起周圍聽覺系統(tǒng)損傷。本實驗通過建立高膽紅素血癥新生豚鼠動物模型，觀察其聽性腦干反應的特征，探討高膽紅素血癥對聽覺系統(tǒng)損傷的部位，比較不同程度的高膽紅素血癥對聽覺系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用出生3天的健康豚鼠73只，純白紅目，由北京金牧陽實驗動物技術有限公司提供，體重60～80 g，雌雄不限，耳廓反射靈敏，無強噪聲暴露及耳毒性藥物使用史，ABR測試正常，電耳鏡檢查，排除患有中耳炎的動物。本研究使用的動物及動物實驗操作均經(jīng)解放軍總醫(yī)院動物實驗倫理審查委員會批準，符合委員會的規(guī)章制度。

1.2 實驗材料

膽紅素（Sigma公司），NaOH（天津市永大化學試劑有限公司），HCL（北京化工廠），PH試紙（上海三愛思試劑有限公司），PBS（北京天悅東方基因技術有限公司），0.9%生理鹽水（石家莊四藥有限公司），測聽設備（美國TDT公司TDTⅢ設備）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 通過隨機數(shù)的方法將全部動物隨機分為3組：對照組（C）10只，低劑量組（T1）40只，高劑量組（T2）23只。

1.3.2 ABR測試 清醒豚鼠，動物保定器固定（根據(jù)解放軍耳鼻咽喉科研究所電生理研究室研制的嚙齒類動物保定器改裝）。記錄電極經(jīng)豚鼠顱頂兩耳廓前緣連線中點，穿過皮膚插入顱骨與硬腦膜之間，參考電極刺入給聲耳垂皮下，地線刺入對側耳垂皮下，每根電極電阻不超過2 Ω。開放聲揚聲器放置距外耳道口0.5 cm處，避免接觸耳廓。采用美國TDT公司TDTⅢ設備和SigGen RP系統(tǒng)軟件。刺激聲為click聲，強度范圍100～10 dB SPL連續(xù)給聲，間隔10 dB SPL逐漸衰減，接近閾值時，聲音衰減5 dB SPL。濾波帶寬300～3000 Hz，刺激頻率一般為10～20次/s，信號采集放大50000倍，觀察窗為10 s，疊加1024次。記錄刺激聲強100 dB SPL時各波潛伏期、波間期及Ⅱ波反應閾。Ⅱ波的分化較其他波形更好，波幅較大，更適合做閾值判斷。給藥前及給藥后1 h、4 h、8 h后分別進行ABR動態(tài)監(jiān)測，給藥1 h后ABR無異常的豚鼠繼續(xù)測給藥后2 h。

1.3.3 動物模型的建立 膽紅素溶液配制：準確稱取膽紅素粉末40.0 mg，加入0.5 ml 0.5 mol/L NaOH溶液和3 ml蒸餾水，搖勻至完全溶解，逐滴加入1 mol/L HCL調其PH至8.4，蒸餾水定容至4 ml，0.22 μm濾器過濾得無菌10 mg/ml膽紅素溶液。C組腹腔注射生理鹽水1 ml；T1組按體重腹腔注射膽紅素溶液75 μg/g；T2組按體重腹腔注射膽紅素溶液100 μg/g。給藥后1 h、4 h、8 h后分別進行ABR動態(tài)監(jiān)測，ABR異常者判定造模成功，給藥1 h后ABR無異常的豚鼠繼續(xù)測給藥后2 h。

1.3.4 取血測血清總膽紅素的量 取造模成功的豚鼠T1組10只，T2組10只，對照組10只，給藥8 h后心臟取血，離心取上清，送解放軍總醫(yī)院生化科測其血清總膽紅素的量。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)應用SPSS 16.0軟件處理，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，假設檢驗水準α=0.05，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物模型鑒定

2.1.1 動物行為學觀察 T1、T2組分別有10只豚鼠給藥1～2 h后出現(xiàn)明顯行為異常，表現(xiàn)為運動減少、反應遲鈍、平衡差，8 h癥狀最明顯，T1組較T2組程度較輕，T1組另有4只豚鼠給藥4 h后出現(xiàn)行為異常，其余豚鼠觀察8 h后均無明顯行為異常。

2.1.2 血清總膽紅素量的測定 T1、T2組給藥后1～2 h ABR異常的10只豚鼠及C組10只豚鼠，給藥8 h后T2組血清TSB高于T1組高于C組（T2＞T1＞C）差異有統(tǒng)計學意義，見圖1。

圖1 3組給藥8小時后血清TSB水平比較

2.2 對照組腹腔注射生理鹽水后ABR變化

C組10只豚鼠腹腔注射生理鹽水1 h、4 h、8 h后，ABR波Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ潛伏期，Ⅰ-Ⅱ、Ⅰ-Ⅲ、Ⅰ-Ⅳ、Ⅱ-Ⅲ、Ⅱ-Ⅳ、Ⅲ-Ⅳ波間期及閾值較給藥前無明顯變化（P＞0.05），見圖2，3。

圖2 C組給藥后各時間點ABR變化情況

圖3 C組給藥后各時間點與給藥前（B0）ABR變化情況

2.3 T1組腹腔注射膽紅素溶液后ABR變化

T1組40只豚鼠給藥后，14只ABR各波潛伏期、波間期延長。其中3只豚鼠給藥1 h后ABR各波潛伏期及波間期延長，7只豚鼠給藥2 h后ABR各波潛伏期及波間期延長，統(tǒng)計時都是按2 h統(tǒng)計。以上10只豚鼠監(jiān)測8 h后，除2 h Ⅲ～Ⅳ波間期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）外，其余時間點各波潛伏期、波間期延長差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且給藥4 h后ABR各波潛伏期、波間期延長達最大值，但閾值無明顯升高（P＞0.05）見圖4，5。另外4只ABR異常的豚鼠，給藥4 h后ABR各波潛伏期及波間期開始延長，24 h后恢復正常見圖6，7。余下26只豚鼠監(jiān)測8 h后ABR均未見明顯異常（P＞0.05）。

圖4 TI組給藥1～2 h后ABR異常的10只豚鼠各時間點ABR變化情況

圖5 T1組給藥1～2 h后ABR異常的10只豚鼠各時間點與給藥前（B1）ABR變化情況

圖6 T1組給藥24 h后ABR恢復正常的4只豚鼠各時間點ABR變化情況

圖7 T1組給藥24 h后ABR恢復正常的4只豚鼠各時間點與給藥前（B1）ABR變化情況

2.4 T2組腹腔注射膽紅素溶液后ABR變化

T2組23只豚鼠給藥后，10只豚鼠ABR各波潛伏期、波間期延長，閾值升高，除給藥2 h閾值升高差異無統(tǒng)計學意義外（P＞0.05），其余差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中4只豚鼠給藥1 h后各波潛伏期及波間期延長，6只豚鼠給藥2 h后各波潛伏期及波間期延長。統(tǒng)計時都是按2 h統(tǒng)計。給藥4小時后ABR各波潛伏期、波間期延長達最大值，但閾值從1～8 h逐漸升高見圖8，9。余下豚鼠監(jiān)測8 h后，ABR均未見異常（P＞0.05）。

圖8 T2組給藥后ABR異常的10只豚鼠各時間點ABR變化情況

圖9 T2組給藥后ABR異常的10只豚鼠各時間點與給藥前（B2）ABR變化情況

2.5 不同劑量的膽紅素對聽覺系統(tǒng)功能的影響

T1組、T2組給藥后1～2 h ABR異常的10只豚鼠給藥前ABR各波潛伏期、波間期及閾值無明顯差異（P＞0.05）。給藥后除2 h Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ波間期和閾值差異無統(tǒng)計學意義外（P＞0.05），其余時間點T2組較T1組ABR各波潛伏期及波間期延長程度大且閾值升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)見圖10，11。

圖10 T1、T2組給藥1～2 h后ABR異常的豚鼠給藥前及給藥后ABR變化情況

圖11 T1、T2組給藥1～2 h后ABR異常的10只豚鼠給藥前及給藥后各時間點ABR變化情況

3 討論

目前建立高膽紅素血癥動物模型有以下幾種方法：腹腔或靜脈注射膽紅素溶液[1，2]、直接從動物延髓注射膽紅素溶液[3]、腹腔注射鹽酸苯肼誘發(fā)溶血[4]、利用基因缺陷的動物（Gunn大鼠）[5]等。本實驗采用的是陳舜年腹腔注射膽紅素溶液的方法誘發(fā)高膽紅素血癥，此方法簡便易行，監(jiān)測的是清醒狀態(tài)下新生3天的豚鼠急性期（8 h內）ABR的變化。新生3天的豚鼠ABR波Ⅴ引出率不高，未做統(tǒng)計，結果與宋鵬研究相似[6]。清醒狀態(tài)下進行監(jiān)測，一是消除了麻醉藥對ABR潛伏期及波間期的影響，二是避免了腹腔注射膽紅素后，再給麻醉藥引起的動物死亡。實驗組部分豚鼠給藥后ABR未見明顯異常，可能與豚鼠個體差異有關。

3.1 高膽紅素血癥可以同時損傷外周聽覺系統(tǒng)和低位腦干聽覺系統(tǒng)

聽性腦干反應(ABR)或腦干聽覺誘發(fā)電位(BAEP)可以反映耳蝸、耳蝸后神經(jīng)和腦干聽覺通路的功能，且不受受試者狀態(tài)的影響。通常認為ABR的波Ⅰ來源于耳蝸，波Ⅱ來源于耳蝸核，波Ⅲ來源于上橄欖核，波Ⅳ來源于外側丘系，波Ⅴ來源于下丘，各波潛伏期及波間期的異常通常對應著相應部位的損傷。最早使用ABR等電生理檢查研究聽覺通路損害部位的是Chisin R等人，他們檢測了13例因新生兒期高膽紅素血癥致聽力損失的患者，結果發(fā)現(xiàn)11例ABR未引出，另2例只有在高強度刺激下才能記錄到反應[7]。張紅和丁輝等研究發(fā)現(xiàn)膽紅素增高引起ABR的異常，主要表現(xiàn)為Ⅰ波潛伏期長，指出膽紅素首先侵犯的是周圍聽覺系統(tǒng)[8，9]。Shapiro SM和Ahlfors等利用先天性基因缺陷的Gunn大鼠建立高膽紅素血癥動物模型，對生后18天的Gunn大鼠進行BAEPs檢測，發(fā)現(xiàn)其Ⅰ～Ⅱ、Ⅰ～Ⅲ波間期延長，指出病變部位在聽神經(jīng)和腦干[10，11]。梁勇等研究則發(fā)現(xiàn)膽紅素增高引起ABR的異常，主要表現(xiàn)為Ⅲ波、Ⅴ波、Ⅰ～Ⅲ波間期長，由此指出膽紅素首先侵犯的是中樞聽覺系統(tǒng)[12]。

通常認為ABR各波均為突觸后電位，膽紅素是親脂性物質，神經(jīng)突觸膜上約有20%的神經(jīng)節(jié)苷脂和神經(jīng)鞘磷脂，膽紅素與這兩種物質結合形成靜電復合物，導致神經(jīng)突觸膜靜息電位和動作電位下降，ABR各波潛伏期及波間期延長。國內外其他高膽紅素血癥動物模型研究，大多是給藥8 h后進行ABR測定，發(fā)現(xiàn)ABR各波潛伏期、波間期延長，但之前ABR的變化情況并沒有描述。本實驗動物腹腔注射膽紅素溶液后1 h開始檢測，發(fā)現(xiàn)給藥1～2 h后，ABR各波潛伏期、波間期同時延長，表明膽紅素可以同時引起外周和低位腦干聽覺系統(tǒng)損傷。此次研究與前人研究結果差異可能與造模的方式不同、膽紅素試劑批次不同、動物年齡大小不同有關。

3.2 隨著血清膽紅素量的增加，聽力損傷逐漸加重

高膽紅素血癥引起的病理損傷主要是由血清中未結合膽紅素（UCB）引起，由于UCB測定比較困難，故血清總膽紅素（TSB）仍是評估病損的重要指標。趙賽等對兩組新生兒進行腦干聽覺誘發(fā)電位檢查，發(fā)現(xiàn)高膽紅素血癥新生兒腦干聽覺誘發(fā)電位檢查異常率較對照組高，且與膽紅素濃度呈正相關[13]。姜蘇敏等分析膽紅素水平、黃疸出現(xiàn)時間與ABR反應閾的相關性，發(fā)現(xiàn)當血清膽紅素＜342 μmol/L時，黃疸出現(xiàn)時間≤18小時組出現(xiàn)聽力損失的比例高于黃疸出現(xiàn)時間＞48小時組；而血清膽紅素≥342 μmol/L時，兩組聽力損失比例無明顯差異，由此指出黃疸出現(xiàn)越早聽力損失的可能性越大[14]。De VL等研究發(fā)現(xiàn)，血清膽紅素的濃度和暴露時間均與聽力損失有關，并指出膽紅素水平＞1768 μmol/L可能是重要危險因素[15]。Sheyholeslami K等認為聽力損失主要發(fā)生在血清膽紅素水平中度增高時(TSB＞1768 μmol/L)[16]。但Newman TB和董淑蘭等研究發(fā)現(xiàn)較安全的血清膽紅素水平也可以引起聽覺系統(tǒng)異常[17，18]。也有研究發(fā)現(xiàn)，高膽紅素血癥患兒聽力損失與膽紅素的量無直接關系。Newman等進行了一項包括12個研究中心共41324例出生低體重患兒的前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)感音神經(jīng)性聽力損失與膽紅素水平?jīng)]有直接相關性[19]。Jiang ZD等研究也發(fā)現(xiàn)，高膽紅素血癥患兒聽力損失與膽紅素的量無關[20]。

本實驗設定了低劑量75 μg/g(T1)和高劑量100 μg/g(T2)兩組動物，發(fā)現(xiàn)低劑量組給藥后ABR各波潛伏期、波間期延長，但閾值無明顯升高。低劑量組中有4只豚鼠給藥4 h后ABR各波潛伏期、波間期開始延長，24 h后恢復正常，提示低劑量的膽紅素引起的聽覺系統(tǒng)損傷有恢復的可能。研究還發(fā)現(xiàn)，高劑量組較低劑量組ABR各波潛伏期、波間期延長程度大，且閾值升高，高劑量組血清膽紅素的水平也高于低劑量組，說明血清膽紅素水平越高，聽覺系統(tǒng)損傷越重。T1、T2組給藥4 h后ABR各波潛伏期、波間期延長達最大值，與陳舜年造模時發(fā)現(xiàn)給藥4 h后血清膽紅素達峰值相符，也說明了表明血清膽紅素水平越高，聽覺系統(tǒng)損傷越重。之前研究報道高膽紅素血癥患兒聽力損失與膽紅素的量無直接關系，可能是因為膽紅素的安全劑量范圍比較小，稍高濃度的膽紅素即可引起嚴重的病理損害。這或許可以給我們提示，臨床上并不能依據(jù)ABR閾值或血清TSB的量來判定新生兒高膽紅素血癥聽覺系統(tǒng)損害的嚴重程度，ABR各波潛伏期、波間期的變化更敏感，更適用于早期發(fā)現(xiàn)高膽紅素血癥引起的病理損害。所以對于血清膽紅素高的新生兒，我們應該早期進行ABR監(jiān)測，以便早發(fā)現(xiàn)，及時干預，從而降低高膽紅素血癥的致殘、致死率，減輕家庭和社會的負擔。

4 結論

高膽紅素血癥可以同時損傷外周和低位腦干聽覺系統(tǒng)；低劑量的膽紅素引起的聽覺系統(tǒng)損傷部分可以恢復；隨著膽紅素量的增加，聽力損失逐漸加重；ABR各波潛伏期、波間期的變化較ABR閾值和血清TSB水平更敏感，更適用于早期發(fā)現(xiàn)高膽紅素血癥引起的聽覺系統(tǒng)損傷。

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