宋建新，歐陽紅梅，甸自金，聞 艷，蔣雅先，湯一菲，撒亞蓮

(云南省第一人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.血液科；3.臨床基礎醫(yī)學研究所，昆明 650032)

腫瘤相關巨噬細胞在骨髓增生異常綜合征患者中的表達研究*

宋建新1，歐陽紅梅1，甸自金1，聞 艷2，蔣雅先1，湯一菲1，撒亞蓮3△

(云南省第一人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.血液科；3.臨床基礎醫(yī)學研究所，昆明 650032)

目的 探討CD68 (M1型+M2型)非惡性免疫性血液病患者、CD163 (M2型) 陽性巨噬細胞在骨髓增生異常綜合征(MDS)患者骨髓中的表達。方法 采用免疫組織化學染色法檢測20例非惡性免疫性血液病患者，25例低危MDS患者，17例高危MDS患者骨髓組織中CD68、CD163的表達。結果 CD68和CD163的表達陽性細胞數在MDS低危組分別為30.78±5.77和8.50±2.48，在對照組中為12.59±2.59 和2.74±0.77，其差異在兩組間有統計學意義(P<0.05)；高危組CD68表達陽性細胞數為61.26±4.21，高于對照組及低危組(P<0.05)；高危組CD163表達陽性細胞數為49.59±4.88，高于對照組和低危組，組間差異有統計學意義(P<0.05)；MDS病情進展與CD163浸潤密度具有相關性(r=0.648，P<0.05)。結論 巨噬細胞在MDS患者骨髓中具有較高的浸潤密度，且逐漸向M2型巨噬細胞極化，同時與MDS的病程進展具有相關性。

骨髓增生異常綜合征；骨髓；巨噬細胞；CD68；CD163

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastie syndrome，MDS)是一組起源于造血干細胞，以骨髓病態(tài)造血，外周血一系或多系血細胞減少和高風險轉化為急性白血病為特征的高度異質性疾病[1-2]。目前MDS的發(fā)病機制及其疾病進展的機制依舊不明。巨噬細胞(macrophages)是一類廣泛分布于體內、動態(tài)的、具有遷移性的異質細胞群體，是機體免疫系統的重要組成部分[3]。在不同微環(huán)境作用下，巨噬細胞可極化為具有不同分子特征和功能特征的M1型或M2型，其對腫瘤發(fā)生、發(fā)展起著截然相反的作用[4]。M1型巨噬細胞具有抗原提呈和吞噬腫瘤細胞等細胞毒性效應，而M2型巨噬細胞參與腫瘤細胞的惡性增殖、抵抗凋亡，以及侵襲和轉移，故又被稱為腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)。已有研究表明，CD68是人源巨噬細胞的泛標志物(M1型+M2型)，CD163是識別M2型的標志物[3-4]。既往對巨噬細胞與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后關系的研究主要集中于實體瘤、淋巴瘤等方面[5-6]，而在MDS中的研究鮮見報道。本文采用免疫組織化學的方法檢測MDS患者骨髓組織中巨噬細胞表面的分子標志CD68、CD163來明確其在MDS發(fā)生、發(fā)展中的變化，探討巨噬細胞在MDS發(fā)病中的作用，為闡明MDS發(fā)病機制提供重要信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料 42例病例均來自本院血液科門診及住院的初診MDS患者，其中男29例，女13例，年齡51～83歲，中位年齡67歲。根據WHO(2008)分型標準，其中難治性貧血(RA)8例，難治性貧血伴有環(huán)狀鐵粒幼細胞(RARS)8例，難治性血細胞減少伴有多系發(fā)育異常(RCMD)6例，難治性血細胞減少伴有多系發(fā)育異常和環(huán)形鐵粒幼細胞(RCMD-RS)3例，難治性貧血伴有原始細胞過多難治性貧血伴有原始細胞過多(RAEB)-Ⅰ 8例，RAEB-Ⅱ9例。根據國際預后積分系統(IPSS)，低危8例，中危-1 17例，中危-2 8例，高危9例。將低危和中危-1定義為低危組(n=25)，將中危-2和高危定義為高危組(n=17)。同時，選擇非惡性免疫性血液病患者20例作為對照組，年齡、性別相匹配。本研究獲本倫理委員會批準，并征得所有受試者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人CD68、CD163抗體，SP免疫組織化學試劑盒購自Abcam公司。

1.2.2 試驗方法 常規(guī)骨髓穿刺取骨髓組織，置于10% 甲醛固定液中交本院病理科進行脫水，石蠟包埋處理。

1.2.3 免疫組織化學檢測CD68、CD163在骨髓組織中的表達 取骨髓活檢組織的石蠟塊，切3～4 μm厚的切片；采用SP免疫組織化學染色檢測CD68、CD163的表達。染色步驟為：二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫滅活內源性過氧化酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，進行抗原微爐熱修復，正常山羊血清封閉，滴加一抗， 4 ℃孵育過夜；PBS清洗3次，滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS清洗3次；滴加二氨基聯苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下控制顯色時間在10～15 min，自來水沖洗，蘇木素復染胞核，脫水透明，中性樹膠封片。對照組用PBS替代一抗，其余步驟相同。

1.2.4 免疫組織化學染色結果判定 免疫組織化學染色結果由2位病理醫(yī)師各自獨立判斷，結果相同者為最終檢驗結果，若有異議，由上級醫(yī)師進行最終判斷。在細胞膜或細胞質有黃褐色或棕黃染色沉著物為陽性。巨噬細胞體積較大，形態(tài)多樣，呈類圓形或不規(guī)則形，偶見有多核細胞。在低倍鏡(100倍)下選取5個染色較好的視野，后在高倍鏡下(400倍)計數陽性細胞個數。

2 結 果

2.1CD68和CD163在骨髓組織中的表達CD68在對照組、低危組和高危組中的陽性細胞數分別為12.59±2.59、30.78±5.77和61.26±4.21。低危組高于對照組(t=13.22，P<0.05)，高危組高于低危組(t=18.63，P<0.05)。CD163在對照組、低危組和高危組中的陽性細胞數分別為2.74±0.77、8.50±2.48、49.59±4.88。經統計學分析，CD163在低危組患者表達高于對照組(t=9.98,P<0.05)，高危組CD163表達明顯高于對照組和低危組(t=42.38、35.94，P<0.05)，見圖1。

A：CD68在對照組中的表達；B：CD163在對照組中的表達；C：CD68在低危組的表達；D：CD163在低危組的表達；E：CD68在高危組的表達；F：CD163在高危組的表達。

圖1CD68與CD163在3組中的表達(×400)

2.2CD68和CD163表達的相關性 在對照組中CD163表達明顯低于CD68的表達(P<0.05)；在低危組中，CD163浸潤密度有所增加，但仍明顯低于CD68(P<0.05)；高危組中CD68與CD163表達均明顯增高，但二者相比差異無統計學意義(P>0.05)，而CD163增高與CD68均呈明顯正相關(r=0.824，P<0.05)。

2.3MDS與病情進展的相關性 對高危組和低危組CD163進行相關性分析，結果顯示，患者的病情進展與CD163浸潤密度具有相關性(r=0.648，P<0.05)。

3 討 論

巨噬細胞分布在機體的各種組織中，發(fā)揮吞噬、趨化、分泌活性物質的作用，同時參與和調節(jié)免疫應答；其既參與維持機體內環(huán)境的平衡狀態(tài)，又對疾病的形成起到促進作用[3]。巨噬細胞作為骨髓微環(huán)境的一個重要成員，在某些特定的細胞因子作用下可活化為TAMs，參與惡性腫瘤細胞的生存、增殖、浸潤、轉移，并與預后不良相關[3-6]。但目前對于MDS患者骨髓巨噬細胞的表達及其與病情進展的關系并不清楚。CD68相對分子質量約為110×103，是巨噬細胞的泛標記物(M1型+M2型)；CD68及其配體參與細胞周期的調節(jié)，并可直接作用于腫瘤細胞，影響其凋亡及對藥物的反應性。CD163是M2型巨噬細胞的標記物，在炎癥環(huán)境中通過與配體結合促進單核細胞黏附、游出，并誘導炎性介質白細胞介素(IL)-10等細胞因子的釋放參與腫瘤細胞免疫逃逸[3,7]。

M1型巨噬細胞通過提呈抗原，分泌促炎癥細胞因子和趨化因子，參與Th1型免疫應答，發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。M2型巨噬細胞抗原提呈能力較弱，分泌IL-10、轉化生長因子β(TGF-β)等參與誘導Th2型免疫應答，抑制免疫，促進腫瘤生長、侵襲和轉移的過程[3-7]。本文通過免疫組織化學檢測MDS患者骨髓組織中巨噬細胞的數量隨病情發(fā)展而增多，低危組CD68、CD163巨噬細胞數量明顯高于對照組，高危組明顯高于低危組。而在對照組中CD163表達明顯低于CD68(P<0.05)；低危組中，CD163浸潤密度有所增加，但仍明顯低于CD68(P<0.05)，提示在對照組和MDS低危組骨髓微環(huán)境中，主要是以M1型巨噬細胞為主。由于M1型巨噬細胞可分泌包括腫瘤壞死因子(TNF)在內的多種炎性因子，這在一定程度上也解釋了早期MDS骨髓細胞凋亡程度較為嚴重[9]。高危組中CD68與CD163表達均明顯增高，CD68高于CD163，但二者相比差異無統計學意義(P>0.05)，同時CD163增高與CD68均呈明顯正相關，說明在MDS高危組中，是以M2型巨噬細胞在數量和功能上占優(yōu)勢。由此可見，MDS患者骨髓組織中巨噬細胞數量隨著病情發(fā)生、發(fā)展而增加，并向M2型巨噬細胞極化，提示M2型巨噬細胞是MDS病情向不良方向發(fā)展的一個預警指標。

MDS患者骨髓微環(huán)境中M2型巨噬細胞的增多，可能是在MDS細胞來源的趨化因子、細胞因子的作用下[2-4]，將外周血單核細胞大量招募進入骨髓后分化為巨噬細胞；在IL-10、IL-4等因子刺激下，極化為M2型巨噬細胞即TAMs；而TAMs本身也能分泌大量的CCL2、IL-10、TGF-β和血管內皮生長因子(VEGF)，通過正向反饋促進巨噬細胞的招募與極化[10-12]；因此，推測骨髓中巨噬細胞與MDS細胞間相互作用，形成一個惡性擴增環(huán)。但鑒于MDS發(fā)病的多因素性和巨噬細胞調節(jié)機制的復雜性，對于MDS患者骨髓中的巨噬細胞還有待進一步研究。

總之，MDS患者骨髓巨噬細胞的大量募集并逐漸向M2型極化，改變了骨髓微環(huán)境，使其更適合培育細胞惡性生物學行為，有利于腫瘤細胞的生存和增殖分化，推動MDS的發(fā)生、發(fā)展。

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?驗交流·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.025

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學聯合專項應用基礎研究項目資助(2014FZ070)。

宋建新(1964-)，副主任技師，大專，主要從事細胞形態(tài)學診斷和流式細胞術應用方面研究?！?/p>

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1671-8348(2017)02-0228-03

2016-07-10

2016-11-25)