嚴(yán)秋萍 - 鄔應(yīng)龍 - 李月娥 - 蔣 艷 郭玉春 - 秦 濤

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

膠原蛋白是動(dòng)物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有支撐器官、保護(hù)機(jī)體的作用[1]。膠原蛋白右旋三股超螺旋結(jié)構(gòu)使其具有較強(qiáng)的拉伸強(qiáng)度[2]，其功能具有多樣性和復(fù)雜性[3]。膠原蛋白主要分布在動(dòng)物的骨、軟骨和皮膚等組織中[4]，從水產(chǎn)動(dòng)物中提取的膠原蛋白比陸生動(dòng)物性膠原蛋白更安全，具有廣闊的開發(fā)前景[5]，可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品及生物制品的生產(chǎn)中[6-8]。齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)屬鯉形目，鯉科，裂腹魚亞科，裂腹魚屬，裂腹魚亞屬，主要分布于長(zhǎng)江上游、大渡河、青衣江和漢江的上游，是產(chǎn)區(qū)名貴的經(jīng)濟(jì)魚類[9]。齊口裂腹魚肉質(zhì)細(xì)嫩，肉色雪白，味道鮮美，頗受大眾消費(fèi)者的喜愛[10]。但目前對(duì)其魚骨的應(yīng)用還鮮有報(bào)道，如不加以有效的利用將會(huì)造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。

研究[11]發(fā)現(xiàn)，一定濃度的酸液可破壞蛋白質(zhì)分子之間的氫鍵，引起膠原纖維膨脹、溶解，使膠原蛋白從原料中釋放出來，常用來提取膠原蛋白的酸有檸檬酸、鹽酸、乙酸、乳酸等。劉娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)以濃度為0.54 mol/L的乙酸為提取劑，在溫度36.4 ℃，液料比51∶1 (mL/g)條件下提取齊口裂腹魚皮中的膠原蛋白36 h，提取率可達(dá)67.26%。吳緹等[13]分別用檸檬酸與乙酸作為提取劑提取斑點(diǎn)叉尾鮰魚骨膠原蛋白，結(jié)果顯示2種方法提取的膠原蛋白提取率無顯著差異，但乙酸提取的膠原蛋白具有刺鼻的酸味。王林等[14]采用超聲波輔助提取深海紅魚膠原蛋白，結(jié)果表明膠原蛋白的提取時(shí)間縮短了30 h。

目前，中國(guó)對(duì)冷水魚膠原蛋白提取方法的研究較少，主要是借鑒陸生動(dòng)物膠原蛋白的提取方法[15]，如酸法提取和酶法提取，提取效率低且受環(huán)境因素影響較大。超聲提取技術(shù)是通過機(jī)械破碎和空化作用促進(jìn)浸提物向提取劑中擴(kuò)散，具有能耗低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)[16]。本試驗(yàn)擬采用超聲波輔助的方法以檸檬酸作為提取劑，探討齊口裂腹魚骨膠原蛋白的提取方法，并對(duì)純化的魚骨膠原蛋白特性進(jìn)行分析，為魚骨膠原蛋白的提取和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

齊口裂腹魚：購(gòu)買于雅安市天全縣齊口裂腹魚養(yǎng)殖場(chǎng)，體重為(80.58±3.06) g，取其脊椎骨作為試驗(yàn)材料，放入保鮮袋，-20 ℃凍藏貯存，備用。

1.2 試劑及儀器

L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：含量≥99%，美國(guó)Sigma公司；

濃鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、高氯酸、對(duì)二氨基苯甲醛、氯胺T、氫氧化鈉、尿素、硫脲、EDTA(乙二胺四乙酸)、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tris堿、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等：分析純；

pH計(jì)：PHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠；

搖床：TS-2000A型，海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；

紫外-可見分光光度計(jì)：UV-2102PCS型，上海尤尼柯儀器有限公司；

垂直電泳儀：Mini-PROTEAN Tetra System型，美國(guó)Bio-Rad公司；

凝膠成像儀：GelDoc2000型，美國(guó)Bio-Rad公司；

高速氨基酸分析儀：835-50型，日本日立公司；

烏氏黏度計(jì)：227型，內(nèi)徑0.5～0.6 mm，上海申誼玻璃制品有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取羥脯氨酸0.1 g，用0.001 mol/L的鹽酸溶解，配制成1 g/L羥脯氨酸貯存液，將貯存液稀釋成不同濃度的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液；取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，以0.001 mol/L的鹽酸作空白液，向標(biāo)準(zhǔn)液和空白液中加2 mL氯胺T溶液，室溫靜置20 min；加入2 mL 高氯酸，混勻后室溫靜置5 min，再加入2 mL顯色液60 ℃水浴15 min；流水冷卻后，以空白液調(diào)零，560 nm下測(cè)定吸光值[17]。以羥脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=0.007 5x-0.000 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。

1.3.2 齊口裂腹魚魚骨的預(yù)處理 魚骨充分剁碎后，用其質(zhì)量10倍的0.1 mol/L NaOH溶液浸泡4 h[18]，再用2.5% NaCl浸泡4 h[19]，去除非膠原蛋白成分及防止內(nèi)源性蛋白酶對(duì)膠原蛋白的影響；魚骨用蒸餾水反復(fù)洗滌瀝干，用其質(zhì)量5倍的0.5 mol/L EDTA溶液(pH 7.4)于4 ℃下浸泡5 d，每天更換1次EDTA溶液以脫去鈣質(zhì)；用蒸餾水反復(fù)洗滌后瀝干[20]，加入其質(zhì)量20倍的10%異丙醇溶液于4 ℃下浸泡1 d 以去除脂肪；用蒸餾水沖洗魚骨至中性，瀝干，貯存于-20 ℃ 冰箱中備用。

1.3.3 膠原蛋白提取得率的計(jì)算 取膠原蛋白提取液1 mL，加入3 mL 6 mol/L的鹽酸，105 ℃條件下水解5 h；水解液用超純水分次轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶定容，取1 mL溶液于試管中，按1.3.1羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法測(cè)定吸光值，按式(1)計(jì)算膠原蛋白提取得率[21-22]。

(1)

式中：

c——膠原蛋白提取得率，%；

m1——羥脯氨酸的質(zhì)量，g；

m2——魚骨總質(zhì)量，g。

1.3.4 魚骨膠原蛋白的提取方法優(yōu)化

(1) 液料比對(duì)膠原蛋白提取得率的影響：選取25∶1，50∶1，75∶1，100∶1，125∶1 (mL/g)的液料比，0.5 mol/L檸檬酸為提取劑，超聲波功率300 W，超聲波預(yù)處理時(shí)間20 min，提取溫度30 ℃，提取時(shí)間48 h，以膠原蛋白提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定料液比。

(2) 超聲波預(yù)處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取得率的影響：選取0，10，20，30，40 min的超聲波預(yù)處理時(shí)間，0.5 mol/L檸檬酸為提取劑，超聲波功率300 W，液料比75∶1 (mL/g)，提取溫度30 ℃，提取時(shí)間48 h，以膠原蛋白提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定超聲波預(yù)處理時(shí)間。

(3) 提取溫度對(duì)膠原蛋白提取得率的影響：選取20，25，30，35，40 ℃的提取溫度，0.5 mol/L檸檬酸為提取劑，超聲波功率300 W，液料比75∶1 (mL/g)，超聲波預(yù)處理時(shí)間20 min，提取時(shí)間48 h，以膠原蛋白提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定提取溫度。

(4) 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取得率的影響：選取24，36，48，60，72 h的提取時(shí)間，0.5 mol/L檸檬酸為提取劑，超聲波功率300 W，液料比75∶1 (mL/g)，超聲波預(yù)處理時(shí)間20 min，提取溫度30 ℃，以膠原蛋白提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定提取時(shí)間。

(5) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上以液料比、超聲波預(yù)處理時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間作為影響因素，各取3個(gè)水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究齊口裂腹魚骨膠原蛋白提取最優(yōu)條件并對(duì)該條件進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 魚骨膠原蛋白的純化方法 魚骨膠原蛋白提取液過濾后向?yàn)V液中加入NaCl至最終濃度為0.9 mol/L鹽析過夜；于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，收集沉淀，用10倍體積的0.5 mol/L檸檬酸溶解沉淀，重復(fù)鹽析和溶解[23]；將魚骨膠原蛋白溶液轉(zhuǎn)入透析袋于超純水中透析3 d，每天更換超純水2～3次；將透析袋中的膠原蛋白溶液真空冷凍干燥后得到魚骨膠原蛋白成品。

1.3.6 魚骨膠原蛋白特性分析

(1) 紫外光譜掃描：精確稱取骨膠原蛋白成品0.005 g溶于5 mL 0.5 mol/L的檸檬酸中，振蕩使其全部溶解，樣品經(jīng)4 ℃離心(10 000 r/min，5 min)后取上清液在波長(zhǎng)200～400 nm進(jìn)行紫外光譜掃描[24]。

(2) SDS-PAGE電泳及純度測(cè)定：聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度8%，濃縮膠濃度4%，上樣量10 μL。采用恒壓電泳跑膠，樣品在濃縮膠時(shí)電壓保持在80 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后保持電壓120 V，在樣品快接近分離膠底部時(shí)，終止電泳[25]。電泳結(jié)束后將凝膠放入含1 g/L考馬斯亮藍(lán)R-250、45%甲醇和10%冰醋酸的染色液中染色2～3 h，用10%甲醇和10%冰醋酸脫色，中途更換脫色液，直至條帶清晰。

精確稱取0.005 g樣品溶于5 mL 6 mol/L鹽酸中，在105 ℃條件下水解24 h，在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除鹽酸，用超純水定容至50 mL。吸取1 mL樣液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法測(cè)定吸光值，根據(jù)待測(cè)樣品羥脯氨酸濃度按式(2)計(jì)算膠原蛋白純度。

(2)

式中：

w——膠原蛋白純度，%；

C——羥脯氨酸質(zhì)量濃度，μg/mL；

m——樣品質(zhì)量，mg；

V——樣品總體積，mL；

F——換算系數(shù)11.1。

(3) 氨基酸組成測(cè)定：根據(jù)Li等[26]的測(cè)定方法修改如下：取齊口裂腹魚骨膠原蛋白樣品0.005 g在110 ℃條件下經(jīng)5 mL 6 mol/L鹽酸水解24 h后，用氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸組成的分析。

(4) 熱變性溫度測(cè)定：根據(jù)劉慶慧等[27]和鐘朝輝等[28]的測(cè)定方法修改如下：取適量齊口裂腹魚骨膠原蛋白溶于10 mL 0.5 mol/L檸檬酸，采用烏氏黏度儀測(cè)定樣品在毛細(xì)管中的流出時(shí)間t，每個(gè)溫度重復(fù)測(cè)定3次，以0.5 mol/L檸檬酸作為空白液，測(cè)定值為t0(控制t/t0在1.2～2.0為宜)。在15～40 ℃內(nèi)測(cè)定膠原蛋白溶液的分?jǐn)?shù)黏度，每個(gè)溫度水平恒溫30 min后測(cè)定。根據(jù)樣品的流出時(shí)間及空白液流出時(shí)間計(jì)算樣品的分?jǐn)?shù)黏度，并以溫度為橫坐標(biāo)、分?jǐn)?shù)黏度為縱坐標(biāo)制圖，以分?jǐn)?shù)黏度變化一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度為膠原蛋白熱變性溫度。計(jì)算公式：

ηr=t/t0，

(3)

ηsp=ηr-1，

(4)

(5)

式中：

ηr——相對(duì)黏度；

ηsp——增比黏度；

η0——分?jǐn)?shù)黏度；

t——樣品流出時(shí)間，s；

t0——檸檬酸流出時(shí)間，s；

T——測(cè)定溫度，℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白提取條件的選擇

2.1.1 液料比對(duì)膠原蛋白提取得率的影響 由圖1可知，液料比在較低范圍內(nèi)，魚骨不能充分浸泡使得提取效果較差，隨著液料比的提高魚骨與提取劑充分接觸，檸檬酸通過破壞蛋白質(zhì)分子之間的氫鍵，膠原蛋白從原料魚骨中釋放使得提取得率顯著升高(P<0.05)，液料比為75∶1 (mL/g)時(shí)膠原蛋白提取得率最高。隨著液料比的繼續(xù)增加，魚骨中膠原蛋白基本釋放完全，提取得率趨于平穩(wěn)(P>0.05)。液料比的繼續(xù)增加會(huì)降低膠原蛋白在提取液中的濃度，增大膠原蛋白分離純化的難度，遵循經(jīng)濟(jì)方便的原則確定最佳液料比為75∶1 (mL/g)。

圖1 液料比對(duì)膠原蛋白提取得率的影響Figure 1 Effect of liquid-solid ratio on collagen extraction yield

2.1.2 超聲波預(yù)處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取得率的影響 由圖2可知，隨超聲波預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，齊口裂腹魚膠原蛋白提取得率不斷增大，經(jīng)超聲波預(yù)處理的魚骨膠原蛋白提取得率顯著高于未處理組(P<0.05)，說明超聲波輔助可提高魚骨膠原蛋白提取得率。當(dāng)超聲波預(yù)處理時(shí)間超過20 min后，膠原蛋白提取得率呈下降趨勢(shì)(P>0.05)，可能是超聲波具有的機(jī)械剪切作用和空化效應(yīng)使提取液中膠原蛋白發(fā)生部分分解。故確定超聲波預(yù)處理時(shí)間為20 min。

2.1.3 提取溫度對(duì)膠原蛋白提取得率的影響 由圖3可知，提取溫度對(duì)齊口裂腹魚膠原蛋白提取得率的影響較大，隨著提取溫度的上升膠原蛋白提取得率顯著升高(P<0.05)，溫度為30 ℃時(shí)膠原蛋白提取得率最高。當(dāng)提取溫度超過35 ℃ 時(shí)，提取得率顯著下降(P<0.05)，可能是膠原蛋白穩(wěn)定性較差，提取溫度過高導(dǎo)致膠原蛋白轉(zhuǎn)化為明膠等物質(zhì)或者是破壞其結(jié)構(gòu)使其分解[29]。故選擇30 ℃為最佳提取溫度。

圖2 超聲波預(yù)處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取得率影響Figure 2 Effect of ultrasonic pretreatment time on collagen extraction yield

圖3 提取溫度對(duì)膠原蛋白提取得率的影響Figure 3 Effect of extraction temperature on collagen extraction yield

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取得率的影響 膠原蛋白從原料骨中釋放是一個(gè)緩慢的過程，由圖4可知，提取時(shí)間為24 h魚骨中膠原蛋白提取得率較低，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)膠原蛋白提取得率呈上升趨勢(shì)，提取時(shí)間為48 h膠原蛋白提取得率達(dá)到最大值。由于膠原蛋白長(zhǎng)時(shí)間處于酸性環(huán)境中會(huì)發(fā)生部分變性，導(dǎo)致提取液中膠原蛋白含量減少，提取得率呈下降趨勢(shì)(P>0.05)。為提高提取效率、縮短周期，故確定最佳提取時(shí)間為48 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取得率的影響Figure 4 Effect of extraction time on collagen extraction yield

2.1.5 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用L9(34) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定膠原蛋白的最優(yōu)提取參數(shù)。正交試驗(yàn)因素及水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，根據(jù)極差分析各因素對(duì)膠原蛋白提取得率的影響次序?yàn)椋篈>C>B>D，最優(yōu)組合為A2B2C2D3，結(jié)合膠原蛋白的提取得率及單因素的結(jié)果，考慮實(shí)際操作的方便及經(jīng)濟(jì)原則[30]，修正齊口裂腹魚骨膠原蛋白提取方法為A2B2C2D2，即提取溫度30 ℃、超聲波預(yù)處理時(shí)間20 min、提取時(shí)間48 h、液料比75∶1 (mL/g)，在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果顯示，膠原蛋白的提取得率為6.91%，優(yōu)于正交試驗(yàn)中最大值，因此，此條件可用于齊口裂腹魚骨膠原蛋白的提取。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 膠原蛋白特性分析

2.2.1 紫外光譜掃描 膠原蛋白與大多數(shù)蛋白質(zhì)的區(qū)別在于幾乎不含色氨酸，因此，在280 nm處不會(huì)有紫外吸收峰的出現(xiàn)，可作為一種鑒定膠原蛋白純度的方法。由圖5可知，齊口裂腹魚骨膠原蛋白溶液在紫外光譜220～232 nm范圍內(nèi)有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，在257，275，280 nm處有較弱的吸收峰，表明苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在膠原蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中含量較低，其紫外吸收峰特性與黃石溪[31]酸法提取的草魚骨膠原蛋白紫外掃描220～230 nm內(nèi)有一個(gè)尖銳的吸收峰的結(jié)果相似，說明在該試驗(yàn)條件下提取的魚骨膠原蛋白純度較高，且符合I型膠原蛋白的紫外吸收特征。膠原蛋白在紫外光譜200～220 nm范圍內(nèi)有微弱的峰，可能是由于膠原蛋白溶液中檸檬酸的影響。

圖5 齊口裂腹魚骨膠原蛋白的紫外吸收光譜Figure 5 UV absorption spectra of collagen in the Schizothorax prenanti bone

2.2.2 SDS-PAGE電泳 在SDS-PAGE電泳中膠原蛋白的電泳遷移率只取決于相對(duì)分子量大小，因此，此方法可用于膠原蛋白樣品的分子組成及分子質(zhì)量分析(結(jié)果見圖6)。齊口裂腹魚骨膠原蛋白由兩條α鏈(α1鏈和α2鏈)和一條β鏈組成，β鏈的分子量約為200 kDa，α1鏈與α2鏈分子量在110～130 kDa，而且α1鏈的條帶比α2鏈的要深，說明α1鏈在膠原蛋白中的含量高于α2鏈。同時(shí)，圖譜上幾乎不含其他的雜帶，說明提取的齊口裂腹魚骨膠原蛋白純度較高，通過測(cè)定樣品的吸光值按回歸方程計(jì)算得膠原蛋白純度為89.74%。

圖6 齊口裂腹魚骨膠原蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Figure 6 SDS-PAGE analysis of collagen in the Schizothorax prenanti bone

SDS-PAGE電泳結(jié)果與陳申如等[32]對(duì)淡水魚魚骨膠原蛋白特性研究中β肽鏈分子量約為200 kDa，α1肽鏈分子量約為130 kDa，且α2肽鏈含量相對(duì)較低的結(jié)果相似。此外，葉韜等[33]研究發(fā)現(xiàn)羅非魚骨膠原蛋白中α1鏈的相對(duì)分子質(zhì)量約為120 kDa，α2鏈的相對(duì)分子質(zhì)量在100～120 kDa，β鏈的相對(duì)分子質(zhì)量略大于200 kDa，α1鏈的含量最高，其次是α2鏈，而β鏈含量最低。經(jīng)純度分析，膠原蛋白樣品純度為89.74%，符合SDS-PAGE電泳中條帶單一的結(jié)果。

2.2.3 氨基酸組成 由表3可知，齊口裂腹魚骨膠原蛋白中各種氨基酸含量相對(duì)豐富，其中甘氨酸含量最高，占總氨基酸含量的31.21%；亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)含量較多，占總氨基酸含量的20.66%；其次是丙氨酸和谷氨酸，分別占總氨基酸含量的10.18%和7.31%；組氨酸和酪氨酸含量較少，不含色氨酸，只有極少量的半胱氨酸。氨基酸分析結(jié)果符合膠原蛋白的氨基酸組成特征，與紫外掃描圖譜結(jié)果分析一致，說明采用超聲波輔助提取可保持膠原蛋白的完整性。

2.2.4 熱變性溫度 由圖7可知，溫度為25 ℃時(shí)分?jǐn)?shù)黏度值呈下降的趨勢(shì)，說明膠原蛋白開始發(fā)生部分變性，當(dāng)溫度為31.4 ℃時(shí)，分?jǐn)?shù)黏度值為最大值的一半，此溫度即為齊口裂腹魚骨膠原蛋白熱變性溫度，與鯉魚骨膠原蛋白熱變性溫度30 ℃接近[34]。同時(shí)也說明正交試驗(yàn)中膠原蛋白最佳提取溫度確定為30 ℃是合理的。

表3 齊口裂腹魚骨膠原蛋白氨基酸組成

圖7 齊口裂腹魚骨膠原蛋白熱變性溫度曲線Figure 7 Temperature curve of thermal denaturation of collagen in the Schizothorax prenanti bone

研究表明，膠原蛋白的熱變性溫度與亞氨基酸的含量正相關(guān)，主要是由于亞氨基酸中的吡咯環(huán)與羥脯氨酸的羥基所形成的氫鍵增強(qiáng)了膠原蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[35]，與上述齊口裂腹魚骨膠原蛋白氨基酸分析結(jié)果一致；相關(guān)研究還表明：魚類膠原蛋白的熱變性溫度與其生活環(huán)境的水溫也存在一定的相關(guān)性，大致與其最高水溫相等[36]，吳青等[37]研究發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚幼魚在水溫30 ℃時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)呼吸頻率加快，不攝食現(xiàn)象，生存的臨界溫度上限為33.5 ℃，與齊口裂腹魚骨膠原蛋白變性溫度31.4 ℃接近。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，齊口裂腹魚骨中的膠原蛋白最優(yōu)提取條件為：提取溫度30 ℃、超聲波預(yù)處理時(shí)間20 min、提取時(shí)間48 h、液料比75∶1(mL/g)，膠原蛋白提取得率可達(dá)6.91%。齊口裂腹魚骨膠原蛋白為I型膠原蛋白，采用超聲波技術(shù)與檸檬酸結(jié)合應(yīng)用于齊口裂腹魚骨膠原蛋白提取可提高產(chǎn)品得率，保持膠原蛋白的完整性且純度較高，但提取時(shí)間較長(zhǎng)。如何將超聲波技術(shù)與其他提取方法結(jié)合最大限度縮短提取時(shí)間并提高產(chǎn)品得率和純度，還有待研究。近年來，水產(chǎn)膠原蛋白的相關(guān)研究越來越多，同時(shí)水產(chǎn)動(dòng)物原料的低脂高蛋白的特性非常適用于膠原產(chǎn)品的制備[38]，從宗教信仰，節(jié)約資源，保護(hù)環(huán)境方面考慮，魚骨膠原蛋白的進(jìn)一步研究一定具有重要的科學(xué)意義和市場(chǎng)價(jià)值。

[1] LIU Da-song, LI Liang, REGENSTEIN J M, et al. Extraction and characterisation of pepsin-solubilised collagen from fins, scales, skins, bones and swim bladders of bighead carp (Hypophthalmichthys nobilis)[J]. Food Chemistry, 2012, 133(4): 1 441-1 448.

[2] LI Zhong-rui, WANG Bin, CHI Chang-feng, et al. Isolation and characterization of acid soluble collagens and pepsin soluble collagens from the skin and bone of Spanish mackerel (Scomberomorous niphonius)[J]. Food Hydrocolloids, 2013, 31(1): 103-113.

[3] 高晶晶. 鱈魚膠原蛋白在食品加工中的應(yīng)用[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊, 2014(20): 79-80.

[4] YAN Ming-yan, LI Ba-fang, ZHAO Xue, et al. Characterization of acid-soluble collagen from the skin of walleye pollock (Theragra chalcogramma)[J]. Food Chemistry, 2008, 107(4): 1 581-1 586.

[5] 戴麗瓊, 梁樹華, 盧福燊. 魚膠原蛋白的開發(fā)和應(yīng)用[J]. 企業(yè)科技與發(fā)展, 2014(7): 30-31.

[6] 趙玲, 李亞, 劉淇, 等. 鱈魚骨膠原蛋白肽的抗氧化活性[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013(4): 425-429.

[7] LI H, LIU B L, GAO L Z, et al. Studies on bullfrog skin collagen[J]. Food Chemistry, 2004, 84(1): 65-69.

[8] 陳麗麗, 趙利, 劉華, 等. 有機(jī)酸提取鮰魚皮膠原蛋白的工藝研究[J]. 食品與機(jī)械, 2010, 26(5): 118-121.

[9] 張金平, 劉遠(yuǎn)高, 馮德品, 等. 神農(nóng)架齊口裂腹魚繁殖生物學(xué)特征與人工繁殖技術(shù)[J]. 淡水漁業(yè), 2015(3): 52-56.

[10] 范林君, 李志瓊, 杜宗君. 特色經(jīng)濟(jì)魚類“齊口裂腹魚”[J]. 農(nóng)村百事通, 2006(14): 44-45.

[11] WANG Li-hong, JIANG Xiao-ting, TAN Feng-tian, et al. Optimization of conditions for extraction of acid-soluble collagen from grass carp (Ctenopharyngodon idella) by response surface methodology[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2008, 9(4): 604-607.

[12] 劉娟, 蘇聯(lián)解, 張婞, 等. 乙酸提取齊口裂腹魚皮膠原蛋白工藝優(yōu)化[J]. 食品科技, 2015(7): 257-262.

[13] 吳緹, 陳舜勝. 斑點(diǎn)叉尾鮰魚骨制取膠原蛋白和骨粉的試驗(yàn)研究[J]. 南方水產(chǎn), 2009(3): 36-40.

[14] 王林, 梁秋芳, 王振斌, 等. 深海紅魚膠原蛋白的超聲波輔助提取及其理化特性[J]. 食品研究與開發(fā), 2014(9): 18-22.

[15] 李杰, 閆鳴艷, 劉均洪, 等. 魚膠原蛋白的研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2015(10): 3 941-3 946.

[16] 陸晨, 鄒雨虹, 張士康, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取茶渣蛋白質(zhì)的工藝條件[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2012(3): 319-325.

[17] 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 9695.23—2008 肉與肉制品.羥脯氨酸含量測(cè)定[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008: 1-4.

[18] MINH Thuy L T, OKAZAKI E, OSAKO K. Isolation and characterization of acid-soluble collagen from the scales of marine fishes from Japan and Vietnam[J]. Food Chemistry, 2014, 149: 264-270.

[19] 周愛梅, 張培麗, 劉欣, 等. 淡水魚皮膠原蛋白提取優(yōu)化工藝研究(Ⅱ)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2007(1): 113-117.

[20] 陳申如, 蔡揚(yáng)鵬, 周瓊, 等. 鯊魚魚皮、魚骨膠原蛋白的純化及其特性的初步研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2006(1): 173-178.

[21] 張敏. 酸法和酶法提取齊口裂腹魚皮膠原蛋白及鑒定性質(zhì)研究[D]. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014: 12-13.

[22] 程波, 吳潔, 張玉蓉, 等. 酶法提取人工養(yǎng)殖鱘魚皮中膠原蛋白的工藝研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2009(3): 1-4.

[23] 鐘朝輝, 李春美, 梁晉鄂, 等. 魚鱗膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(7): 162-166.

[24] 郝淑賢, 林婉玲, 李來好, 等. 不同提取方法對(duì)羅非魚皮膠原蛋白理化特性的影響[J]. 食品科學(xué), 2014(15): 59-62.

[25] 瞿朝霞, 劉焱, 羅燦, 等. 草魚魚鱗、魚皮和魚骨酸溶性膠原蛋白特性對(duì)比研究[J]. 中國(guó)釀造, 2014(5): 116-119.

[26] LI Xiao-dong, NIU Zhi-xia, ZHANG Bai-ling. Various meth-ods available for the determination of hydrolyzed degree of whey protein[J]. China Dairy Industry, 2006, 34(10): 59-62.

[27] 鐘朝輝, 李春美, 竇宏亮, 等. 草魚魚鱗酶溶性膠原蛋白粘度特性及變性溫度研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006(6): 64-68.

[28] 劉慶慧, 王彩理, 劉叢力. 魚鱗膠原蛋白研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2000, 21(3): 57-61.

[29] 王哲平, 劉淇, 曹榮, 等. 溫度對(duì)刺參膠原蛋白結(jié)構(gòu)和分子量變化的影響[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2011(6): 80-84.

[30] 梅鑫東, 曾江南, 蔣柏泉. 酶法提取魚鱗膠原蛋白的工藝優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械, 2014, 30(6): 156-159.

[31] 黃石溪. 草魚不同部位膠原蛋白的提取及特性研究[D]. 長(zhǎng)沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013: 35-36.

[32] 陳申如, 蔡揚(yáng)鵬, 周瓊, 等. 魚骨膠原蛋白的純化及其特性的初步研究[J]. 食品科學(xué), 2006(11): 177-181.

[33] 葉韜, 林琳, 張曉霞, 等. 羅非魚骨膠原蛋白質(zhì)的提取及其性質(zhì)[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2015(3): 302-310.

[34] 張俊杰, 段蕊, 劉佳梅, 等. 鯉魚魚皮和魚骨酶溶性膠原蛋白性質(zhì)異同的分析[J]. 食品科學(xué), 2008(12): 128-131.

[35] PATI F, ADHIKARI B, DHARA S. Isolation and characterization of fish scale collagen of higher thermal stability[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(10): 3 737-3 742.

[36] 陸劍鋒, 萬(wàn)全, 殷章敏, 等. 中華鱉裙邊膠原蛋白的提取及其特征[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2010(6): 981-988.

[37] 吳青, 蔡禮明, 陸建平, 等. 齊口裂腹魚幼魚對(duì)水溫和溶解氧的耐受力研究[J]. 四川畜牧獸醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2001(3): 20-22.

[38] 焦道龍, 陸劍鋒, 張偉偉, 等. 水產(chǎn)動(dòng)物膠原蛋白的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J]. 食品科學(xué), 2009(17): 334-338.