梁會(huì)朋 韓書(shū)芝 平 芬

(河北省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

被動(dòng)吸煙對(duì)大鼠血清和肺組織中白細(xì)胞介素17表達(dá)的影響

梁會(huì)朋1韓書(shū)芝 平 芬

(河北省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

目的 觀察被動(dòng)吸煙和戒煙對(duì)大鼠被動(dòng)吸煙模型血清和肺組織中白細(xì)胞介素(IL)-17變化的影響。方法 選擇健康雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、被動(dòng)吸煙4 w、8 w、12 w組和戒煙組。HE染色觀察肺組織的病理改變，采用ELISA方法檢測(cè)血清中IL-17含量，免疫組織化學(xué)染色方法觀察肺組織中IL-17的表達(dá)。結(jié)果 被動(dòng)吸煙可導(dǎo)致肺組織炎癥反應(yīng)和肺氣腫改變；被動(dòng)吸煙組和戒煙組大鼠血清IL-17含量較正常對(duì)照組升高，肺組織中 IL-17表達(dá)增強(qiáng)；隨著被動(dòng)吸煙時(shí)間的延長(zhǎng)，血清中IL-17含量逐漸增加，肺組織中IL-17表達(dá)逐漸增加；戒煙組較被動(dòng)吸煙12 w組血清IL-17含量降低，肺組織中IL-17表達(dá)減少。結(jié)論 被動(dòng)吸煙可引起肺部炎癥，導(dǎo)致血清及肺組織IL-17表達(dá)增加，IL-17可能參與了吸煙相關(guān)性肺損傷的發(fā)生。

被動(dòng)吸煙；戒煙；肺損傷；白細(xì)胞介素17

香煙燃燒產(chǎn)生的煙霧是由氣體和懸浮顆粒組成的氣溶膠，包含大量氧化劑和多種有毒物質(zhì)，如尼古丁、焦油、苯并芘等，這些有毒物質(zhì)進(jìn)入氣道，引起呼吸道黏膜損傷，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。白細(xì)胞介素(IL)-17是近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞因子，主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，是一種促炎性細(xì)胞因子，也是炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)子，因其在誘導(dǎo)炎癥方面具有強(qiáng)大的作用而備受重視。本研究通過(guò)建立被動(dòng)吸煙大鼠模型，檢測(cè)其血清和肺組織IL-17的表達(dá)，探討IL-17在被動(dòng)吸煙導(dǎo)致肺損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠50只，體重150 g左右，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。將動(dòng)物隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、被動(dòng)吸煙4 w、8 w、12 w組和戒煙組(戒煙組即被動(dòng)吸煙8 w后戒煙8 w組)，每組10只。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。將各被動(dòng)吸煙組大鼠置于自制70 cm×60 cm×40 cm熏煙箱〔1〕內(nèi)，每次燃燒15支香煙(鉆石牌香煙，焦油量：11 mg，煙氣煙堿量1.0 mg)，持續(xù)1 h；每天2次，2次間隔時(shí)間>6 h，每周7 d。戒煙組大鼠接受被動(dòng)吸煙8 w后開(kāi)始戒煙，同正常對(duì)照組置于無(wú)煙環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HE染色 各實(shí)驗(yàn)組大鼠分別在規(guī)定的日期，禁食12 h，采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，留取右肺下葉組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片(片厚約3～4 μm)，用于HE染色，觀察肺組織病理變化。

1.2.2 IL-17免疫組織化學(xué)染色 每只大鼠肺組織標(biāo)本取一張切片，用于IL-17免疫組織化學(xué)染色(IL-17抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素染色二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2.3 血清IL-17測(cè)定 取大鼠腹主動(dòng)脈血4～8 ml，靜置1 h，離心取上清，用于IL-17 ELISA檢測(cè)(試劑盒購(gòu)于BlueGene公司)，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織病理改變 正常對(duì)照組大鼠氣道和肺組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯病理改變。各被動(dòng)吸煙組和戒煙組大鼠肺組織出現(xiàn)不同程度的損傷，隨著被動(dòng)吸煙持續(xù)時(shí)間的增加，肺損傷的程度逐漸加重。被動(dòng)吸煙4 w組可見(jiàn)到氣道黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死、脫落；氣道壁和肺組織可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。被動(dòng)吸煙8 w組除了上述改變外，氣道黏膜上皮細(xì)胞受損程度加重，杯狀細(xì)胞增生，黏液分泌增多，氣道平滑肌增生肥大，肺泡壁擴(kuò)張、變薄，充氣增多。被動(dòng)吸煙12 w組可見(jiàn)肺泡壁進(jìn)一步變薄，部分?jǐn)嗔讶诤?，呈現(xiàn)顯著肺大泡、肺氣腫改變；肺組織可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主。戒煙組仍可觀察到炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肺氣腫表現(xiàn)，但與被動(dòng)吸煙12 w組比較，損傷減輕。見(jiàn)圖1。

2.2 肺組織IL-17的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色顯示，正常對(duì)照組大鼠氣道上皮細(xì)胞可見(jiàn)有少量IL-17表達(dá)；各被動(dòng)吸煙組大鼠氣道上皮細(xì)胞IL-17表達(dá)增強(qiáng)，在肺泡上皮細(xì)胞也可見(jiàn)IL-17表達(dá)，且隨著被動(dòng)吸煙持續(xù)時(shí)間的增加，氣道上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞IL-17表達(dá)逐漸增強(qiáng)，顏色加深；被動(dòng)吸煙12 w組表達(dá)最明顯，呈棕褐色，幾乎充滿整個(gè)上皮細(xì)胞。戒煙組大鼠氣道上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞仍可見(jiàn)IL-17明顯表達(dá)，但較被動(dòng)吸煙12 w組表達(dá)減弱。見(jiàn)圖2。

2.3 血清IL-17含量 正常對(duì)照組大鼠血清中IL-17含量〔(98.99±12.26)pg/ml〕與被動(dòng)吸煙組大鼠血清IL-17含量比較顯著升高(P<0.01)。隨著被動(dòng)吸煙時(shí)間的延長(zhǎng)(4 w、8 w、12 w)，血清中IL-17含量逐漸升高〔(118.29±15.71)、(148.99±17.01)、(175.70±15.40)pg/ml，P<0.01〕。戒煙組血清中IL-17含量〔(151.31±20.61)pg/ml〕較正常對(duì)照組升高(P<0.01)。戒煙組與被動(dòng)吸煙8 w組比較IL-17含量輕度增加(P>0.05)。戒煙組與被動(dòng)吸煙12 w組比較，血清中IL-17含量下降(P<0.05)。

圖1 肺組織病理改變(HE，×100)

圖2 肺組織IL-17免疫組化表達(dá)(DAB，×200)

3 討 論

香煙煙霧中含有數(shù)千種化學(xué)物質(zhì)，如尼古丁、焦油、一氧化碳、自由基、鎘、汞、鉛、砷以及甲醛、苯并芘等，大部分有毒物質(zhì)隨香煙煙霧被吸入肺部，對(duì)肺組織造成嚴(yán)重危害。研究證實(shí)被動(dòng)吸煙使支氣管炎、慢性支氣管炎、呼吸困難發(fā)生的危險(xiǎn)性增高；被動(dòng)吸煙還能夠引起肺功能下降，且具有劑量依賴性〔2〕。給予多次被動(dòng)吸煙后小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子如巨噬細(xì)胞趨化因子(MCP-1)、粒單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-8水平明顯升高。GM-CSF、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β隨吸煙時(shí)間延長(zhǎng)和吸煙劑量增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與吸煙具有量效關(guān)系〔3〕，提示炎癥反應(yīng)參與了吸煙導(dǎo)致的肺臟損傷。IL-17是新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生。IL-17與其受體結(jié)合，主要通過(guò)NF-κB-DNA途徑和有絲分裂原激活激酶(MAPK)途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用〔4〕。IL-17能誘導(dǎo)IL-8、 IL-6 、TNF-α等多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。而IL-8、IL-6 、TNF-α在吸煙導(dǎo)致肺損傷的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用〔5〕。 IL-17還可通過(guò)促進(jìn)C-X-C趨化因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化和募集，促進(jìn)氣道炎癥反應(yīng)，參與肺損傷〔6，7〕。本實(shí)驗(yàn)提示IL-17可能參與了被動(dòng)吸煙導(dǎo)致肺損傷的發(fā)病機(jī)制。

有研究顯示吸煙COPD患者的IL-17 mRNA的表達(dá)明顯高于吸煙肺功能正常者和非吸煙者，IL-17 mRNA與一秒率FEV1%呈負(fù)相關(guān)〔8〕。對(duì)吸煙小鼠注射IL-17抗體發(fā)現(xiàn)：抗體處理組小鼠肺泡灌洗液中總細(xì)胞計(jì)數(shù)較吸煙組降低，中性粒細(xì)胞比例較單純吸煙組明顯下降，氣道炎癥減輕。肺組織中的IL-17水平較單純吸煙組顯著降低〔9，10〕，說(shuō)明IL-17抗體與IL-17結(jié)合后降低了IL-17導(dǎo)致的氣道和肺臟的炎性反應(yīng)，減輕了肺損傷程度。

有研究顯示吸煙的COPD患者戒煙后12 h血中一氧化碳(CO)的含量就會(huì)恢復(fù)正常，2 w至3個(gè)月肺功能得到改善，1～9個(gè)月咳嗽及呼吸短促的發(fā)生減少、氣道纖毛恢復(fù)正常功能〔11〕。Godtfredsen等〔12〕認(rèn)為戒煙可以減輕呼吸道癥狀，減輕肺部炎癥，延緩肺功能下降速度。本研究進(jìn)一步證實(shí)IL-17參與了被動(dòng)吸煙導(dǎo)致的肺損傷。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)戒煙后炎癥反應(yīng)仍在持續(xù)，但較持續(xù)被動(dòng)吸煙組炎癥反應(yīng)程度降低，說(shuō)明戒煙能緩解煙草煙霧引起的炎癥反應(yīng)。吳卓等〔13,14〕分別對(duì)不同吸煙時(shí)間造成的肺部炎癥、肺氣腫、COPD大鼠模型進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：無(wú)論是在早期肺部炎癥階段開(kāi)始戒煙，還是在肺氣腫、COPD形成后開(kāi)始戒煙，戒煙早期肺部的炎癥較正常不吸煙組明顯升高，與戒煙前比較，炎癥反應(yīng)仍可見(jiàn)加重；但隨著戒煙時(shí)間的延長(zhǎng)，可見(jiàn)到肺部的炎癥反應(yīng)指標(biāo)的降低和肺功能改善，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

綜上，吸煙可導(dǎo)致肺損傷，戒煙雖不能使肺損傷逆轉(zhuǎn)，但可延緩肺損傷進(jìn)一步發(fā)展的速度。吸煙導(dǎo)致肺損傷的機(jī)制十分復(fù)雜，有待繼續(xù)深入研究。

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〔2015-07-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目(20130107)

韓書(shū)芝(1965-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

梁會(huì)朋(1985-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

R563.9

A

1005-9202(2017)04-0834-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.021

1 河北省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科