尹興忠 趙冬梅 田國忠 王長山 趙春紅 李 麗 歐葉濤

(佳木斯大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

生長激素釋放肽對慢性心衰大鼠心肌細胞c-fos表達的影響

尹興忠 趙冬梅1田國忠 王長山 趙春紅 李 麗 歐葉濤

(佳木斯大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 研究慢性心衰大鼠心肌細胞c-fos表達的變化及生長激素釋放肽(GHRP)對其表達的影響。方法 Wistar老年大鼠90只隨機分為治療組、模型組和對照組，每組30只。通過電鏡、免疫組化觀察心衰大鼠心肌組織形態(tài)學變化、RT-PCR法檢查各組大鼠心肌細胞中c-fos mRNA表達水平。結果 電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)治療組大鼠心肌較模型組明顯改善，但略差于對照組。免疫組織化學方法、RT-PCR檢測結果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠心肌中c-fos mRNA光密度值明顯高于對照組(P<0.01)；治療組大鼠心肌c-fos mRNA光密度值較模型組明顯降低(P<0.01)，但略高于對照組(P<0.05)。結論 GHRP可降低慢性心衰大鼠心肌細胞c-fos含量而保護和改善心衰大鼠心功能。

生長激素釋放肽；慢性心衰；c-fos

c-fos基因在心肌細胞缺血、缺氧、血流動力超負荷等快速誘導表達，導致心肌的蛋白比例改變從而導致心肌細胞損傷，導致心肌細胞重塑的各種細胞外信號通過多條信號轉導途徑引起細胞應答，c-fos是一個通用的轉錄因子。生長激素釋放肽(GHRP)可以調節(jié)心肌細胞Ca2+轉運和興奮-收縮耦聯(lián)的過程，促使心肌纖維的活動接近于正常，同時還可以促進心肌細胞生長并具有抗心肌細胞凋亡的作用〔1，2〕。本研究探討GHRP對心衰后大鼠心肌細胞中c-fos表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及設備 ①試劑：免疫組化試劑(武漢博士德生物工程有限公司)；RT-pCR試劑(大連寶生物有限公司)。②藥品：水合氯醛、無水甲醇、乙醇、無水乙醇、乙醚、Tris堿等為本生物化學實驗室提供。③實驗動物：老年Wistar大鼠，體重(200±30)g，90只，佳木斯大學實驗動物中心提供(動物質量合格證號：黑動字第99102001)。④設備：小動物呼吸機、梯度PCR儀(Whatman公司生產(chǎn))、心電圖機：ECG-6511。

1.2 方法 (1)模型制備〔3，4〕：隨機分為治療組、模型組和對照組，采用結扎大鼠冠狀動脈前降支法造成心肌梗死后形成慢性心衰模型。實驗用成年、健康Wistar大鼠90只。(2)取材：連續(xù)給藥4 w后，檢查大鼠各組的心功能，取材前禁食12 h，取材后立即液氮冷凍，-80℃保存；取部分左心室心肌，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。(3) 心肌 RT-PCR 檢測：①總RNA提?。喝⌒募〗M織50 mg液氮中研磨成粉末加入含1 ml Trizol的EP管中，稱重充分混勻室溫靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心5 min，吸取上清液至新EP管中加入200 μl氯仿用力振蕩15 s混勻，室溫靜置5 min ，12 000 r/min 4℃離心15 min ，吸取上清液500 μl至新EP管中，加入500 μl異丙醇充分混勻室溫靜置10 min 12 000 r/min 4℃離心，5 min棄上清向沉淀中緩慢加入1 ml 75%乙醇清洗，12 000 r/min 4℃離心5 min棄上清保留沉淀室溫干燥5～10 min，溶解于30 μl DEPC處理水中10 μl用于RNA純度等檢測，20 μl置于液氮中凍存。②反轉錄合成 cDNA：在NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫中檢索，得到大鼠c-fos和β-actin的完整cDNA序列，各基因上下游引物應用Primer Premier 5.0軟件設計，然后在BLAST數(shù)據(jù)庫中進行同源性對比，最終得到特異的引物序列。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1 電鏡下觀察變化 對照組可見，肌原纖維排列整齊、緊密，肌節(jié)，Z線及M線清晰，線粒體正常，膜完整。模型組心肌細胞的超微結構可見肌原纖維溶解，嵴變疏短、Z線及M線模糊不清線粒體腫脹，破裂，線粒體膜不完整，有空泡樣改變，治療組與模型組比較，心肌結構顯著改觀，肌纖維各帶較為鮮明，線粒體排列較規(guī)則，呈圓形、橢圓形或長桿狀，嵴膜方向較規(guī)則。見圖1。

2.2 免疫組化法觀察各組大鼠心肌細胞c-fos表達的變化 模型組大鼠心肌細胞中 c-fos明顯高于對照組c-fos(P<0.01)；治療組大鼠心肌細胞中c-fos較模型組明顯降低(P<0.01)，見圖2，表1。

2.3 RT-PCR法檢測c-fos mRNA在心肌組織的表達 模型組大鼠心肌細胞中c-fos mRNA明顯高于對照組(P<0.01)；治療組大鼠心肌細胞中c-fos mRNA較模型組明顯降低(P<0.01)，但高于對照組(P<0.05)，見圖3，表1。

圖1 各組心肌組織超微結構比較(×80 000)

圖2 各組心肌組織c-fos表達(DAB,×200)

Marker;1.模型組;2.治療組;3.對照組 圖3 各組心肌組織c-fos mRNA表達表1 GHRP對心衰大鼠心肌c-fos、c-fos mRNA表達的 影響

組別c-fosc-fosmRNA對照組1.90±0.089466±49模型組4.18±0.721)521±951)治療組2.87±0.0472)3)485±382)3)

與對照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.01

3 討 論

多種原因可以導致心臟的功能失常，從而使心臟輸出量相對或絕對下降，以至不能適應機體代謝需要的生理過程，而使機體表現(xiàn)出一系列臨床癥狀的總稱，這樣的病理過程可不斷地發(fā)展，這個過程是心肌重塑與內(nèi)分系統(tǒng)興奮性增強形成相互促進的惡性循環(huán)，所以難以臨床治療改善慢性心衰，這也是多數(shù)心臟疾病死亡的主要原因〔5〕。

c-fos是構成核轉錄激活因子的主要部分屬于早期即刻基因中的一類分別位于14q21-31〔6〕分子量均為62 000 D左右，多因素(生長因子、佛波脂、神經(jīng)遞質、氧張力變化炎癥因子、白細胞介素等)刺激細胞多表達c-fos，表達增加的c-fos通過對下游基因表達的調控引起體內(nèi)細胞的一系列形態(tài)結構和功能代謝變化。c-fos基因是原癌基因，在維持細胞的生理功能、分化和生長方面起著十分重要的作用，是生物體內(nèi)一種非常重要的基因。缺血缺氧時心肌細胞中c-fos基因大量表達，表達增加的c-fos基因調控下游基因。在正常條件下c-fos 參與細胞的增殖、生長、分化的過程〔7〕，在生長、分化和增殖現(xiàn)象很少的細胞中c-fos 表達量很少甚至不表達，所以在成熟正常細胞中其很少有表達〔8，9〕，未成熟細胞由于未分化成熟所以在生長分化和增殖的過程中細胞中會有c-fos持續(xù)表達，GHRP對心衰大鼠心肌中c-fos表達及含量變化的實驗研究甚少。本文顯示GHRP通過抑制心肌組織中C-fos的表達，從而改善心肌功能，減緩心臟衰竭發(fā)展的進程。

1 李春陵，顧廣富，羅建華，等.益氣溫陽活血方含藥血清對大鼠肥大心肌細胞原癌基因 c-fos、c-myc 表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(17)：4897-9.

2 丁 帆，程秀麗，郝 維，等.hexarelin 的細胞保護作用研究〔J〕.醫(yī)學研究雜志，2012;41(10)：21-3.

3 魏 罡，田國忠，李梅秀，等.心力衰竭大鼠外周血生長分化因子-15及其心肌組織中mRNA表達水平〔J〕.醫(yī)學研究雜志，2012；41(11)：57-6.

4 趙 勇，鐘震亞，田國忠，等.生長激素釋放肽對心衰大鼠心肌組織中IL-6的影響〔J〕.解剖學研究，2007；29(3)：186-94.

5 張?zhí)飳?，周美啟，吳生兵，?不同干預方法對心肌缺血c-fos 基因表達的影響〔J〕.世界中西醫(yī)結合雜志，2013；8(6)：630-2.

6 Chen HB，Wang L，Jiang JF.Re-analysis of expression profiles for revea-ling new potential candidate genes of heart failure〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013；17(7)：903-11.

7 李瑩潔，柏樹令.慢性壓力負荷所致心肌肥厚及心衰大鼠左心室肌ERK的動態(tài)變化〔J〕.中國老年學雜志，2004;24(6)：544-6.

8 馮 佳，田國忠.生長激素釋放肽對心衰大鼠植物神經(jīng)重構的影響〔J〕.神經(jīng)解剖學雜志,2009；25(4)：453-6.

9 徐繼杰，劉 斌，方 卓，等.從慢性心力衰竭學說的發(fā)展認識和掌握其現(xiàn)代藥物治療觀點〔J〕.中國老年學雜志，2006;26(2)：285-7.

〔2015-12-12修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

黑龍江省教育廳項目(No.12541801)

田國忠(1966-)，男，教授，博士，主要從事心衰的發(fā)病機制及生物學治療研究。

尹興忠(1979-)，男，碩士，講師，主要從事心衰機制及其生物學治療研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)05-1069-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.013

1 佳木斯大學附屬第一醫(yī)院兒二科