闖振蕾 王玉君 余紅波 曲昌發(fā) 崔亞利

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

131I標(biāo)記槲皮素對未分化型甲狀腺癌的輻射增敏作用

闖振蕾 王玉君 余紅波 曲昌發(fā) 崔亞利

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

目的 探討131I標(biāo)記槲皮素對未分化型甲狀腺癌的輻射增敏作用。方法 利用細(xì)胞生長抑制實驗觀察131I-槲皮素對裸鼠種植甲狀腺癌的治療效果,應(yīng)用免疫熒光顯微鏡觀察γ-H2AX變化。結(jié)果 三種藥物對DRO增殖的抑制強(qiáng)弱順序為131I-QU> QU>131I且抑制作用與藥物劑量及作用時間均呈依賴關(guān)系。與對照組相比，注射藥物后治療組腫瘤體積被明顯抑制，從第3天開始，治療組與對照組腫瘤體積有顯著性差異(P<0.05)，第28天的抑瘤率約為66.51%。免疫熒光顯微鏡測試顯示槲皮素會影響γ-H2AX集落形成。結(jié)論 體外和體內(nèi)的研究表明131I標(biāo)記槲皮素能增強(qiáng)131I的內(nèi)放療敏感性，細(xì)胞用槲皮素預(yù)處理后顯著增加了γ-H2AX的持續(xù)時間。

131I;槲皮素；未分化甲狀腺癌；輻射增敏；γ-H2AX

天然產(chǎn)物的抗氧化和免疫增強(qiáng)作用經(jīng)常被認(rèn)為是正常組織的放射防護(hù)劑,與此同時,一些天然產(chǎn)物抗病毒和抗腫瘤效果可能作為一類獨特的放療增敏成分存在于腫瘤組織中。作為類次生代謝產(chǎn)品的植物黃酮類化合物已被證明具有諸多功能，如增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、保護(hù)心血管和許多其他藥理作用〔1〕。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物,其廣泛分布在蔬菜和水果中,如蘋果、堅果、漿果、洋蔥、菜花、白菜等。研究表明,槲皮素可以減少紫外線輻射誘導(dǎo)皮膚損傷,增加在X射線輻照后小鼠的白細(xì)胞水平和人放射治療后外周血中的淋巴細(xì)胞。此外抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)的活性在組合組高于單獨照射組〔2〕；放射治療誘導(dǎo)毛細(xì)血管擴(kuò)張后槲皮素可以導(dǎo)致肝小葉的瘀血發(fā)生逆轉(zhuǎn)。這些研究表明,槲皮素與輻射可以扭轉(zhuǎn)輻照的免疫毒性。由于槲皮素在細(xì)胞中表現(xiàn)出的多功能，我們假設(shè)槲皮素聯(lián)合內(nèi)放射治療可以提高腫瘤的放療敏感性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞生長抑制實驗 采用CCK-8方法檢驗不同藥物作用下未分化甲狀腺癌細(xì)胞DRO存活情況，并同時研究藥物劑量、作用時間細(xì)胞存活的影響。在細(xì)胞水平上研究131I-QU、131I、QU對分化細(xì)胞增殖的抑制情況。其中131I的劑量分別為5、10、20、30、40 μCi，QU的濃度分別為14、28、56、84、112 μmol/L，藥物作用時間分別為24、48、72 h。

1.2131I-槲皮素對甲狀腺癌的治療效果 將未分化型甲狀腺癌組織碎片接種在裸鼠的右側(cè)皮下，當(dāng)腫瘤達(dá)到100～150 mg(100～150 mm3)時候開始治療，每組8只小鼠，觀察瘤內(nèi)注射131I-QU及同等量的PBS(pH7.4，0.01 mol/L)0～28 d后，治療組及對照組裸鼠腫瘤的體積變化。

1.3 免疫熒光顯微鏡 把呈指數(shù)增長的未分化型甲狀腺癌細(xì)胞放置在22 cm2的蓋玻片上，(加入槲皮素或無槲皮素)131I的劑量40 μCi，QU的濃度分別為112 μmol/L，在0、2、8、12、24 h收集細(xì)胞并進(jìn)行免疫熒光檢查，通過曲線和直方圖表達(dá)細(xì)胞計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行SNK-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 藥物對DRO增殖的影響 藥物對DRO增殖的抑制強(qiáng)弱順序為131I-QU> QU>131I，抑制作用與藥物劑量呈依賴關(guān)系，見圖1。當(dāng)QU濃度為112 μmol/L、131I劑量為40 μCi、作用時間為72 h時，131I-QU對細(xì)胞增殖的抑制率達(dá)到(86.87±7.15)%，QU及131I對細(xì)胞的抑制率分別為(58.43±5.08)%、(18.86±6.29)%。與相同劑量的131I相比，131I-QU對細(xì)胞的抑制作用約提高5倍。

圖1 藥物對DRO增殖的抑制作用

2.2 兩組腫瘤體積比較 在28 d的觀察期內(nèi)，對照組腫瘤體積不斷增大，第28天時，腫瘤體積為(907.65±189.21)mm3。與對照組相比，注射藥物后治療組腫瘤體積明顯被抑制，且從第3天開始，治療組與對照組腫瘤體積差異顯著(P<0.05)，治療組第28天的抑瘤率約為66.51%。瘤內(nèi)注射131I-QU后的第7天，治療組腫瘤體積達(dá)到最小〔(34.93±13.29)mm3〕，隨后治療組腫瘤體積開始逐漸增大。見圖2。

2.3 免疫熒光顯微鏡結(jié)果 為了驗證槲皮素誘導(dǎo)的放療增敏機(jī)制，本文測試了槲皮素是否會影響γ-H2AX集落形成。H組蛋白的磷酸化變體H2AX是DNA鏈斷裂和DNA修復(fù)能力的象征。時間進(jìn)程的實驗表明，在缺乏槲皮素組別中，照射40 μCi的12 h內(nèi)放療誘導(dǎo)的γ-H2AX焦點回到了照射之前的水平。當(dāng)這些細(xì)胞用槲皮素預(yù)處理后則顯著增加了γ-H2AX的持續(xù)時間。見圖3。

圖2 兩組腫瘤體積比較

圖3 免疫熒光顯微鏡結(jié)果

3 討 論

如何克服腫瘤的放療抵抗性一直是腫瘤放療學(xué)首要面臨的挑戰(zhàn)和難題，其中包括開發(fā)特異性的放療增敏劑。分子靶向放療增敏可以有效抑制DNA損傷。對于放療增敏的最理想情況就是找到特異性的腫瘤細(xì)胞并且最大限度保護(hù)周圍正常組織。

本實驗表明：QU進(jìn)入細(xì)胞后能嵌入到DNA雙鏈上，通過共價或非共價鍵作用與DNA磷酸基團(tuán)結(jié)合。由于未分化型甲狀腺癌細(xì)胞DRO不能攝取131I，因此131I及131I+QU主要通過內(nèi)照射抑制癌細(xì)胞的生長。與131I相比，131I-QU能被癌細(xì)胞攝取，并嵌入到DNA雙鏈中，這將大大增加藥物對細(xì)胞核及DNA的損傷，并加速細(xì)胞的碎裂。槲皮素的放射線增敏效應(yīng)進(jìn)一步證明在人類腫瘤異種移植模型體內(nèi),槲皮素可增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔3,4〕。

本實驗采用的是131I標(biāo)記QU，也可用發(fā)射俄歇電子的125I、124I、123I等標(biāo)記QU，俄歇電子能量低(多為20～50 eV)，傳能線密度LET高(與α粒子相當(dāng))。俄歇電子在組織內(nèi)的射程約為1～10 nm，僅相當(dāng)于6個堿基對的距離，若與QU結(jié)合嵌入到癌細(xì)胞DNA中將對DNA造成更大的損傷，同時對周圍正常組織具有更小的生物毒性。其原因可能是1 mCi的131I-QU不足以完全抑制腫瘤的生長或131I-QU在腫瘤內(nèi)的滯留時間不夠長。鑒于此，要完全抑制≤50 mm3的腫瘤的生長，需增加131I-QU單次給藥的劑量或采用多次給藥的治療手段。另外，也可延長藥物在腫瘤內(nèi)的滯留時間以達(dá)到更好的治療效果。在機(jī)制研究中，我們發(fā)現(xiàn)槲皮素可延長γ-H2AX的集落形成表明槲皮素可能干擾DNA修復(fù)過程,同以往實驗結(jié)果相同〔5〕。

1 Formica JV,Regelson W.Review of the biology of Quercetin and related bioflavonoids〔J〕.Food Chem Toxicol,1995;33:1061-80.

2 Cui Y,Lin C.Quercetin enhances immune function of irradiated rats〔J〕.Chin J Radiat Med Radiat Protect,2008;4:354-7.

3 Xavier CP,Lima CF,Rohde M,etal.Quercetin enhances 5-fluorouracil-induced apoptosis in MSI colorectal cancer cells through p53 modulation〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol,2011；68(6)：1449-57.

4 Staedler D,Idrizi E,Kenzaoui BH,etal.Drug combinations with quercetin:doxorubicin plus quercetin in human breast cancer cells〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol,2011;68(5):1161-72.

5 Lin CH,Yu Y,Zhao HG,etal.Combination of quercetin with radiotherapy enhances tumor radiosensitivity in vitro and in vivo〔J〕.Radiother Oncol,2012;104：395-400.

〔2016-09-14修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學(xué)基金資助項目(81271526)

崔亞利(1968-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤核醫(yī)學(xué)研究。

闖振蕾(1990-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤核醫(yī)學(xué)研究。

R736.1

A

1005-9202(2017)05-1052-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.005