張 濱 黃旭明 張明興 石藝華 陳碧珊

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510600)

大鼠脊髓損傷后自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3表達(dá)的變化

張 濱 黃旭明 張明興 石藝華 陳碧珊

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510600)

目的 探討大鼠脊髓損傷(SCI)后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達(dá)變化對(duì)自噬發(fā)生的影響。方法 構(gòu)建大鼠脊髓橫斷損傷模型，分別于損傷后0、4、12 h及1、3、5、7 d通過BBB評(píng)分評(píng)定SCI大鼠的行為學(xué)變化，同時(shí)經(jīng)Western印跡檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達(dá)；并通過腹腔注射自噬抑制劑3-MA和自噬促進(jìn)劑Rapamycin于SCI小鼠模型，分別于上述時(shí)間點(diǎn)通過Western印跡進(jìn)行Beclin1、LC3的檢測(cè)，初步探討自噬抑制劑和自噬促進(jìn)劑在SCI后對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化的作用。結(jié)果 隨著大鼠SCI時(shí)間的延長，運(yùn)動(dòng)逐漸消失，SCI后3 d大鼠出現(xiàn)無運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象，之后隨著大鼠SCI時(shí)間的延長行為逐漸恢復(fù)；自噬相關(guān)蛋白Beclin1和 LC3的表達(dá)量隨著SCI時(shí)間的延長逐漸升高，于3 d左右表達(dá)量顯著升高(P<0.01)達(dá)到峰值；隨后其表達(dá)量隨SCI時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；Rapamycin作用大鼠后Beclin1和LC3的表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著增高，于3 d達(dá)到極顯著水平(P<0.001)；3-MA作用大鼠后Beclin1和LC3的表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.001)。結(jié)論 Rapamycin能夠促進(jìn)SCI后自噬相關(guān)蛋白Beclin1和 LC3的表達(dá)，最終引發(fā)自噬的發(fā)生，而3-MA能夠抑制Beclin1和 LC3的表達(dá)，阻止SCI后自噬現(xiàn)象的發(fā)生。

脊髓損傷；自噬；Beclin1；LC3；Rapamycin；3-MA

脊髓損傷(SCI)包括原發(fā)性SCI和繼發(fā)性SCI，繼發(fā)性SCI除了加重SCI外，神經(jīng)元水腫、變性和壞死現(xiàn)象也明顯加重〔1〕。繼發(fā)性SCI主要是由于神經(jīng)元的凋亡及膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖，這一系列病理變化嚴(yán)重阻礙了軸突的再生，進(jìn)而影響神經(jīng)功能的恢復(fù)〔2〕。自噬作為生物進(jìn)程中的一種動(dòng)態(tài)現(xiàn)象，像LC3和Beclin1這些單純自噬體表達(dá)的增多，并不能對(duì)自噬完全發(fā)生作很好的解釋。不管是自噬體的融合機(jī)制被破壞還是相關(guān)溶酶體的失活都可以引發(fā)機(jī)體內(nèi)自噬體的異常升高，但自噬活性卻尚未激活〔3〕。完整自噬流的發(fā)生還需要對(duì)自噬底物像p62進(jìn)行檢測(cè)，理論上其表達(dá)量的高低與自噬現(xiàn)象的發(fā)生密切相關(guān)，隨自噬的增強(qiáng)而呈下降趨勢(shì)。只有當(dāng)自噬底物的減少與自噬體的增多同時(shí)發(fā)生時(shí)才能證實(shí)自噬的發(fā)生。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上通過構(gòu)建大鼠脊髓橫斷損傷模型，初步探討自噬抑制劑和自噬促進(jìn)劑在SCI后對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3表達(dá)變化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠(廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)84只，體重(230±18)g，隨機(jī)分成對(duì)照組(0 h)和實(shí)驗(yàn)組(SCI組)，實(shí)驗(yàn)組依照SCI后的時(shí)間依次劃分為損傷后4、12 h及1、3、5、7 d組，每組12只。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中室溫飼養(yǎng)，大鼠自由進(jìn)食和飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備 參照文獻(xiàn)制備大鼠SCI模型〔3〕，采用復(fù)合麻醉方法：復(fù)合麻醉劑(即水合氯醛 4.25 g，硫酸鎂2.12 g，戊巴比妥鈉 886 mg，無水乙醇 33.8 ml，雙蒸水定容至100 ml)3 ml/kg ，以T8棘突為中心，切取背部正中切口，暴露 T6～T10棘突及椎板，通過使用手術(shù)鉗除去 T8～T10棘突及全椎板，以脊髓為中心對(duì)直徑約 5 mm的圓形區(qū)進(jìn)行暴露，采用10 g沖擊棒，使圓形薄銅墊片(直徑 3.5 mm)擊于脊髓背側(cè)，打擊致 T8脊髓急性挫傷。對(duì)照組僅行椎板和棘突切除，不損傷脊髓，無行為學(xué)及后肢運(yùn)動(dòng)障礙。

1.3 行為學(xué)功能測(cè)試 所有大鼠通過BBB(Basso，Beattie，Bresnahan)進(jìn)行評(píng)分，自由活動(dòng)4 min后通過觀察記錄不同組別大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)情況。評(píng)分采用雙盲法，第一部分為0～7分，主要對(duì)恢復(fù)早期的后肢關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)狀況進(jìn)行評(píng)估；第二部分為8～13分，主要對(duì)恢復(fù)中期的步態(tài)及其協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行評(píng)估；第三部分為14～21分，主要對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)爪子的精細(xì)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行評(píng)估，最后取其平均值為BBB評(píng)分值。

1.4 Western印跡檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的表達(dá) 分別取對(duì)照組及SCI后4 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d的大鼠6只稱重。采用頸部處死的方式，快速暴露損傷部位的脊髓，在無菌條件下取出小塊損傷的脊髓并置于液氮中保存。隨后以100 g/L加入蛋白裂解液，冰浴勻漿。13 000 r min 4℃離心15 min，取上清，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量。

分別取對(duì)照組和SCI組蛋白樣品各40 μg，加入4×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液(含10%β-巰基乙醇)，沸水中煮沸5 min，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，隨后進(jìn)行電轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后的聚偏氟乙稀(PVDF)膜用含10%脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TBST)緩沖液室溫包被2 h，然后用抗PISTLRE抗體(1∶200)室溫孵育1 h后4℃過夜，TBST漂洗，轉(zhuǎn)入辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗免IgG(1∶2 000)中，室溫孵育2 h，TBST漂洗5次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光，顯影，定影。最后通過圖像分析儀進(jìn)行比較分析。每組重復(fù)3次，取OD值的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 Western印跡檢測(cè)Rapamycin和3-MA作用SCI大鼠后自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的表達(dá) 以2.5 mg/kg濃度的3-MA和0.5 mg/kg濃度的Rapamycin分別作用于SCI大鼠，對(duì)0、4、12 h、1、3、5、7 d 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組織樣分別提取蛋白，Western印跡進(jìn)行自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的檢測(cè)。方法同1.4。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)評(píng)分 對(duì)照組大鼠活動(dòng)正常，步態(tài)協(xié)調(diào)，足趾能夠持續(xù)抓地，尾巴持續(xù)翹起，動(dòng)物軀體能夠維持穩(wěn)定，BBB評(píng)分為23分。SCI 3 d后，大鼠無運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象，后側(cè)肢體癱瘓，BBB評(píng)分為0.9分；隨著大鼠SCI后時(shí)間的不斷延長，其所配的運(yùn)動(dòng)功能出現(xiàn)恢復(fù)跡象。見圖1。

2.2 自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的檢測(cè) SCI后，自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1 的表達(dá)量與對(duì)照組相比出現(xiàn)升高的趨勢(shì)，隨著損傷時(shí)間的不斷延長，其表達(dá)量也呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。SCI后3 d表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；之后，其表達(dá)量隨SCI時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。見圖2。

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01 圖1 大鼠SCI后的BBS評(píng)分

圖2 Rapamycin和3-MA對(duì)自噬相關(guān)蛋白L3的檢測(cè)

2.3 自噬促進(jìn)劑Rapamycin和自噬抑制劑3-MA對(duì)Beclin 1和LC3的影響 見圖3。Rapamycin作用于SCI大鼠后，隨著損傷時(shí)間的延長Beclin1、LC3的表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，SCI 3 d后Rapamycin組Beclin1、LC3的表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著增高，達(dá)到極顯著水平(P<0.001)；3-MA組Beclin 1、LC3的表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.01)。隨后，隨著SCI時(shí)間的延長，其表達(dá)水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖3 Rapamycin和3-MA對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin1的檢測(cè)

3 討 論

自噬是生命機(jī)體內(nèi)重要的代謝方式，在動(dòng)物、植物和單細(xì)胞生物中廣泛存在，在細(xì)胞增殖分化、組織發(fā)育和穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用〔4〕。自噬主要通過以下途徑發(fā)揮作用：(1)參與細(xì)胞生長、分化，組織發(fā)育和重塑基本生命過程；(2)在營養(yǎng)不足時(shí)，細(xì)胞可以通過自噬作用將自身的大分子營養(yǎng)物質(zhì)分解后再吸收以保證自身能量代謝的需要；(3)當(dāng)機(jī)體受到病原體感染后，自噬與免疫系統(tǒng)的激活與調(diào)控有關(guān)；(4)自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)的損傷蛋白，降解異常壽命的蛋白從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。但當(dāng)自噬過度或不足時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的異常蛋白被聚集后阻礙細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，引發(fā)多種慢性疾病〔5〕。自噬參與多種疾病的調(diào)控，如SCI、惡性腫瘤、自身免疫疾病等〔6～8〕。

目前報(bào)道的SCI機(jī)制主要包括炎癥反應(yīng)學(xué)說、血管學(xué)說、內(nèi)環(huán)境失衡學(xué)說和凋亡壞死學(xué)說。SCI后的再生是其功能修復(fù)的主要表現(xiàn)。自噬在SCI后的作用研究在國內(nèi)外尚處于起步階段。研究結(jié)果顯示SCI后自噬細(xì)胞的死亡與Beclin1表達(dá)異常升高有關(guān)〔9〕。Beclin1作為一種自噬相關(guān)蛋白，能夠促進(jìn)自噬的發(fā)生，且在SCI后Beclin1的表達(dá)量顯著增高〔10〕。Beclin1在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，這在一定程度上促進(jìn)了自噬現(xiàn)象的激活。LC3作為自噬發(fā)生的相關(guān)蛋白，同樣在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量升高，并參與自噬體雙層膜的形成〔11〕。研究表明，在SCI模型體注射Rapamycin能夠增強(qiáng)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)〔12〕，而神經(jīng)元的損傷和膠質(zhì)細(xì)胞的死亡率明顯下降。表明Rapamycin能夠促進(jìn)自噬現(xiàn)象的發(fā)生。3-MA作為自噬抑制劑在自噬小體的形成和發(fā)展過程中起到阻遏作用，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡也有一定影響，并進(jìn)一步加重了疾病的發(fā)展〔13〕。本研究結(jié)果表明，Rapamycin可以有效促進(jìn)SCI后的細(xì)胞自噬，3-MA具有阻礙SCI后細(xì)胞自噬的作用。但Rapamycin和3-MA在SCI后自噬現(xiàn)象發(fā)生的作用機(jī)制還不明確，有待進(jìn)一步研究。

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〔2016-10-12修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030313360)

黃旭明(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)康復(fù)研究。

張 濱(1982-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)康復(fù)研究。

R493

A

1005-9202(2017)05-1071-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.014