車(chē)穎潔，郝林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中 030801）

黃漿水發(fā)酵生產(chǎn)SCP的菌種選配

車(chē)穎潔，郝林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中 030801）

以黃漿水為原料，采用液態(tài)發(fā)酵方式，選配適合其發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白（SCP）的菌種，進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)。結(jié)果表明：扣囊擬內(nèi)孢霉（EndomycopsisfiburigerCICC31258）、解脂假絲酵母（Candida lipolyticaCICC32457）、產(chǎn)朊假絲酵母（CandidautilisCICC31268）、白地霉（Geotrichumcandidum linkSH501）是適合發(fā)酵黃漿水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的優(yōu)良菌種；菌種間的最佳發(fā)酵配比為白地霉（SH501）∶扣囊擬內(nèi)孢霉（CICC31258）∶解脂假絲酵母（CICC32457）∶產(chǎn)朊假絲酵母（CICC31268）為2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2。

大豆黃漿水；單細(xì)胞蛋白（SCP）；菌種配比

豆制品營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，深受人民群眾的喜愛(ài)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年我國(guó)豆制品的投豆量達(dá)到9.753×105噸，國(guó)內(nèi)豆制品生產(chǎn)企業(yè)每年黃漿水排放量達(dá)到300萬(wàn)噸以上［1］。在豆腐壓榨到成型過(guò)程中，為了使豆腐獲得特定的含水量、彈性特征等，施加一定的壓力把多余的水分排出，使豆?jié){中的蛋白凝固成豆腐，分離出來(lái)的即壓濾廢水，又稱(chēng)黃漿水［2］。經(jīng)過(guò)對(duì)黃漿水進(jìn)行檢測(cè)得知，其主要成分有維生素、礦物質(zhì)、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、氨基酸、可溶性固形物等，其中BOD高達(dá)7400mg/L，COD高達(dá)10000mg/L，總氮（TN）和氨氮（NH3-N）也較高，屬于高濃度可生化性程度高的廢水。目前企業(yè)都采取生化處理方式，投資大且效率低［3，4］。黃漿水的資源化利用符合我國(guó)“建設(shè)資源節(jié)約型、環(huán)境友好型社會(huì)、大力發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)”的重要導(dǎo)向。

單細(xì)胞蛋白（SCP）是利用各種基質(zhì)培養(yǎng)細(xì)菌、酵母菌、真菌、藻類(lèi)等獲得的微生物蛋白，又稱(chēng)為菌體蛋白。其本質(zhì)是由蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、核酸、維生素、無(wú)機(jī)物等組成的細(xì)胞質(zhì)團(tuán)。近年來(lái)成為關(guān)注的熱點(diǎn)，在飼料中SCP被作為一種重要的蛋白質(zhì)增補(bǔ)劑來(lái)代替常規(guī)蛋白質(zhì)［5，6］。Gao Yurong等利用熱帶假絲酵母在pH 5.5，30℃時(shí)發(fā)酵大豆蛋白廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，蛋白量達(dá)到6.11g/L。張建斌等［7］在以甘蔗糖蜜作為發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)酵母單細(xì)胞蛋白的菌種選育中，經(jīng)過(guò)搖瓶培養(yǎng)，篩選得到了一株總蛋白得率較高的啤酒酵母S9。德國(guó)慕尼黑餐廳出售的一種既像牛排又像豬脯的“神奇牛排”，實(shí)際上就是SCP。歐洲最大的人造肉食品公司Marlow生產(chǎn)的Quorn是當(dāng)今唯一面向人類(lèi)的SCP產(chǎn)品。在國(guó)外，已經(jīng)開(kāi)展了把SCP摻入餅干、點(diǎn)心等食品中以提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的試驗(yàn)，但仍處于研究開(kāi)發(fā)階段［8，9］。

本文從能夠有效利用黃漿水中營(yíng)養(yǎng)成分且安全性好的工業(yè)菌種中選取扣囊擬內(nèi)孢霉酵母（Endomycopsis fiburigerCICC 31258）、解脂假絲酵母（CandidalipolyticaCICC 32457）、產(chǎn)朊假絲酵母（CandidautilisCICC 31268）、白地霉（GeotrichumcandidumlinkSH501）4類(lèi)菌種作為發(fā)酵黃漿水生產(chǎn)SCP的菌群［10－12］，進(jìn)行了單菌種試驗(yàn)及多菌種的正交試驗(yàn)，以此來(lái)選擇出最佳的菌種配比，并對(duì)黃漿水的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與原料

扣囊擬內(nèi)孢霉（CICC31258）、產(chǎn)朊假絲酵母（CICC31268）、解脂假絲酵母（CICC32457），購(gòu)于中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院；白地霉（SH501），山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。大豆黃漿水：取自豆制品加工企業(yè)。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽糖培養(yǎng)基：蛋白胨10g、麥芽糖20g、酵母膏5g、瓊脂15g、水1000mL，自然pH，在0.1MPa，121℃下滅菌20min。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000mL，煮沸30min，雙層紗布過(guò)濾，濾液中加2%葡萄糖，補(bǔ)充水分，加2%瓊脂，自然pH，在0.075MPa，115℃下滅菌30min。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；BL-58A滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；水平型超凈工作臺(tái) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 北京醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)。

1.3 方法及步驟

1.3.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的制作

分別將已選取的菌株進(jìn)行活化，取活化好的菌種1環(huán)接入已配制好的100mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，在30℃，140r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)12h后轉(zhuǎn)接100μL于另一新的100mL液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12h后即為種子液。

分別對(duì)4株菌種進(jìn)行60h的培養(yǎng)測(cè)定，每2h進(jìn)行測(cè)定1次，記錄數(shù)據(jù)，以便獲得其生長(zhǎng)曲線(xiàn)，為選擇對(duì)數(shù)期的菌種提供依據(jù)［13］。

1.3.2 種子液的制備

取1環(huán)經(jīng)過(guò)斜面培養(yǎng)基活化好的菌體接種到相應(yīng)的已滅菌的100mL液體培養(yǎng)基中，在140r/min，30℃的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)分別取100μL接入到新的100mL液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后即為種子液。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在進(jìn)行菌株配比試驗(yàn)時(shí)，首先進(jìn)行單菌種發(fā)酵試驗(yàn)，分別將4株菌的種子液在對(duì)數(shù)中期接入經(jīng)過(guò)滅菌（115℃，0.075MPa，5min）冷卻后的100mL黃漿水中，用8層紗布封口，在恒溫培養(yǎng)振蕩器中于28℃，140r/min條件下培養(yǎng)24h，利用臺(tái)式離心機(jī)進(jìn)行離心（4000r/min，20min）分離，然后在70℃烘箱中烘干至恒重，稱(chēng)重［14，15］。

在單個(gè)菌種發(fā)酵試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)混合發(fā)酵對(duì)已選定的菌種進(jìn)行正交試驗(yàn)［16］，發(fā)酵所得SCP的產(chǎn)量作為確定菌種間最佳配比的標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表1。

表1 因素水平表Table 1Factors and levels table

根據(jù)試驗(yàn)方差分析所得的比例進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，即在28℃，140r/min，24h環(huán)境下培養(yǎng)，并對(duì)發(fā)酵后的黃漿水在4000r/min下離心20min，后在75℃干燥箱中烘干至恒重，記錄數(shù)據(jù)并對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種生長(zhǎng)曲線(xiàn)

經(jīng)過(guò)測(cè)定得各菌種的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 各菌種的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1The growth curves of each specy

由圖1可知，A和B在10～30h時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)期，在20h時(shí)菌種的活力最高，因此是接入的最佳時(shí)期；C和D在10～20h左右達(dá)到對(duì)數(shù)期，在15h時(shí)其活力最高，此時(shí)接入最為合適。

2.2 菌種發(fā)酵結(jié)果

經(jīng)過(guò)單個(gè)菌種發(fā)酵，分別得出不同菌種的單細(xì)胞蛋白的產(chǎn)量為：白地霉0.96g/dL、扣囊擬內(nèi)孢霉酵母0.58g/dL、產(chǎn)朊假絲酵母0.15g/dL、解脂假絲酵母0.38g/dL；由各個(gè)菌種的產(chǎn)量結(jié)果可知，白地霉的產(chǎn)量最多，產(chǎn)朊假絲酵母的產(chǎn)量最少。

遵循單菌發(fā)酵的條件，對(duì)4種菌株進(jìn)行四因素三水平的正交組合，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of the orthogonal experiment

由表2可知，理論上的最優(yōu)組合為A3B1C1D1，A∶B∶C∶D為3∶1∶1∶1；由極差的大小可知，對(duì)SCP產(chǎn)量的影響大小因素為B＞D＞C＞A；即B的極差最大，說(shuō)明扣囊擬內(nèi)孢霉酵母的影響作用很大；其次是產(chǎn)朊假絲酵母，對(duì)SCP的產(chǎn)量影響也很大；再次是解脂假絲酵母；白地霉的極差最小，說(shuō)明白地霉對(duì)產(chǎn)物結(jié)果的影響最小。

根據(jù)表2的結(jié)論進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表3。

表3 方差分析表Table 3Analysis of variance table

F檢驗(yàn)結(jié)果表明：白地霉A和解脂假絲酵母C對(duì)SCP的產(chǎn)量有著顯著的影響；扣囊擬內(nèi)孢霉酵母B和產(chǎn)朊假絲酵母D有著極顯著的影響；因此，各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C。

采用q檢驗(yàn)法對(duì)各因素水平進(jìn)行多重比較，見(jiàn)表4。

表4 各因素水平組合平均數(shù)多重比較（q法）Table 4Each factor level combination averages multiple comparisons（q test）

由表4可知，A因素中A2，A3差異不顯著，且均優(yōu)于A1，因此，選擇A2或者A3均可；B因素中B1顯著優(yōu)于B2，B3且差異顯著，因此選擇B1；C因素中C1顯著優(yōu)于C2，C3且差異顯著，因此選擇C1；D因素中D2顯著優(yōu)于D1，D3，且差異顯著，因此選擇D2。

由以上分析得知4個(gè)試驗(yàn)因素的最優(yōu)水平組合為A2B1C1D2或者A3B1C1D2，即白地霉∶扣囊擬內(nèi)孢霉∶解脂假絲酵母∶產(chǎn)朊假絲酵母為2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2。

根據(jù)正交分析的結(jié)果對(duì)兩種最佳配比即白地霉∶扣囊擬內(nèi)孢霉∶解脂假絲酵母∶產(chǎn)朊假絲酵母為2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2進(jìn)行相同環(huán)境下的發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，取平均值作為結(jié)果。經(jīng)過(guò)烘干稱(chēng)重所得菌體的重量分別為1.102，1.076g/dL，比理論中的最佳比例下進(jìn)行發(fā)酵的SCP產(chǎn)量分別高出14.7%和12.01%。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)選取好的4株性能不同的菌株進(jìn)行了單個(gè)發(fā)酵生產(chǎn)SCP研究，分別得出不同菌種的SCP的產(chǎn)量為：白地霉0.96g/dL、扣囊擬內(nèi)孢霉酵母0.58g/dL、產(chǎn)朊假絲酵母0.15g/dL、解脂假絲酵母0.38g/dL。由此可知，白地霉的產(chǎn)量最多，其次是扣囊擬內(nèi)孢霉，然后為解脂假絲酵母，產(chǎn)朊假絲酵母的產(chǎn)量最少。

在單因素的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)得知對(duì)SCP產(chǎn)量影響顯著的主次因素為扣囊擬內(nèi)孢霉＞產(chǎn)朊假絲酵母＞白地霉＞解脂假絲酵母，并確定了菌種間發(fā)酵的最佳配比為白地霉（SH501）∶扣囊擬內(nèi)孢霉（CICC31258）∶解脂假絲酵母（CICC32457）∶產(chǎn)朊假絲酵母（CICC31268）為2∶1∶1∶2或者3∶1∶1∶2，以這兩種比例進(jìn)行混合接種發(fā)酵時(shí)SCP的產(chǎn)量最高。經(jīng)過(guò)對(duì)4種菌株進(jìn)行混合發(fā)酵得知，混合后的菌群所得SCP的產(chǎn)量比任意一株單菌發(fā)酵的SCP的產(chǎn)量都要高，在此條件下進(jìn)行發(fā)酵所得的SCP產(chǎn)量明顯提高，并且經(jīng)過(guò)發(fā)酵后的黃漿水明顯澄清，達(dá)到了廢水凈化的目的。說(shuō)明利用不同特征的菌種進(jìn)行混合發(fā)酵可以有效地利用黃漿水中的營(yíng)養(yǎng)成分。

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Selection of Strain Producing SCP Fermented by Yellow Slurry Water

CHE Ying－jie，HAO Lin
（College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，China）

Strains are selected to produce fermented single cell protein（SCP）with yellow slurry water as liquid media.The results show that the fermentation strains which can make full use of proteins，fats and saccharides，includingEndomycopsisfiburiger（CICC31258），Candidalipolytica（CICC32457），Candida utilis（CICC31268），Geotrichumcandidumlink（SH501）.Use single factor and orthogonal experiments to get the best ratio ofGeotrichumcandidumlink（SH501），Endomycopsisfiburiger（CICC31258），Candida lipolytica（CICC32457）andCandidautilis（CICC31268）is 2∶1∶1∶2or 3∶1∶1∶2.

soybean yellow slurry water；single cell protein（SCP）；ratio of strains

TS261.13

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.006

1000-9973（2017）03-0022-04

2016－09－27

企業(yè)橫向聯(lián)合項(xiàng)目

車(chē)穎潔（1992－），女，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)；郝林（1957－），男，教授，博士，研究方向：食品微生物學(xué)。